3D sferoidlerde hücre dışı akı testi: pankreas tümör sferoidlerinin metabolik aktivitesini ölçmek için bir yöntem

- Pankreas kanseri hücreleri, tümör mikroçevresinde veya TME'de kanserle ilişkili fibroblastlarla etkileşime girer. Bu etkileşimler kanser hücrelerinin metabolik aktivitesini modüle eder ve kanserin ilerlemesini etkiler.

Sferoidler, TME'yi in vitro olarak özetleyen hücresel agregalardır. Bu nedenle, bu sferoidleri, hücre dışı akı testi ile tümörün metabolik fonksiyonlarındaki değişiklikleri test etmek için kullanabiliriz. Bu test, sırasıyla aerobik ve glikolitik metabolizmayı belirlemek için hücre dışı oksijen ve proton konsantrasyonunu ölçer.

Pankreas kanseri hücrelerinin pankreas fibroblastları ile birlikte kültürlenmesiyle elde edilen uygun boyutta 3D sferoidleri alarak başlayın. Şimdi, sferoidleri bir akı analiz plakasına aktarın ve test ilaçları içeren bir sensör kartuşu ile örtün. Tahlili hücre dışı bir akı analizöründe çalıştırın.

Akı analizörü, test ilaçlarını sensör kartuşundan belirli zaman noktalarında analiz plakasına pnömatik olarak enjekte eder. Test ilaçlarına yanıt olarak, hücreler protonları ve oksijeni plaka mikro odasına salar ve sensör probunda bulunan floroforlar bu seviyeleri ölçer. Son olarak, uygun yazılımı kullanarak sferoidlerin işlevselliğini analiz edin.

Aşağıdaki protokolde, hücre dışı akı testini kullanarak 3D sferoidlerde bulunan pankreas tümör hücrelerinin metabolik fonksiyonunu ölçmek için bir yöntem göstereceğiz.

Metabolik tahlilden bir gün önce, prob kartuşunu sağlanan yardımcı plakadaki oyuk başına 200 mikrolitre tahlil kalibranı ile nemlendirin ve yardımcı plakayı gece boyunca nemlendirilmiş 37 santigrat derece CO2 olmayan bir inkübatörde inkübe edin.

Ertesi sabah, morfolojilerini ve genel homojenliklerini kontrol etmek için büyüme plakasındaki sferoidleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Büyüme plakasını manyetik bir tutma tahrikine aktarın ve oyuk başına yaklaşık 120 mikrolitre büyüme ortamını dikkatlice aspire edin.

Sferoidleri 120 mikrolitre ısıtılmış tahlil ortamı ile üç kez nazikçe yıkayın. Son yıkamadan sonra, sferoidlerin yıkanmadığını doğrulamak için sferoidleri mikroskop altında tekrar inceleyin ve her oyuğa 180 mikrolitre ılık tahlil ortamı ekleyin.

Hücre itici büyüme plakasından önceden yıkanmış tek bir sferoidi dikkatlice aspire etmek için geniş delikli bir uç kullanın ve sferoidi doğrudan bir sferoid tahlil plakasının bir oyuğunun merkezine nazikçe aktarın, böylece sferoidin yerçekimi ile kuyunun merkezi mikro odasına düşmesine izin verin.

Tüm sferoidler transfer edildiğinde, tahlil plakasını bir saat boyunca CO2 olmayan, 37 santigrat derece nemlendirilmiş hava inkübatörüne yerleştirin. İnkübasyon sırasında, sensör kartuşunu A'dan H'ye kadar olan sıralar sol tarafta olacak şekilde yönlendirin ve kartuşun üzerine, yüklenecek bağlantı noktasına karşılık gelen harf sol üst köşede olacak şekilde bir yükleme kılavuzu yerleştirin.

Plaka eşit şekilde yüklenmişse, analiz yazılımını açın ve Şablonlar'a tıklayın. Boş Şablon'a çift tıklayın ve Grup Oluştur'a tıklayın. Plaka Haritası sekmesi altında, deneysel tasarıma karşılık gelen tahlil plakasına gruplar atayın ve arka plan kuyuları olarak dört köşe kuyusunu seçin.

Instrument Protocol (Cihaz Protokolü) sekmesi altında, Calibrate, Equilibrate (Kalibre Et), Equilibrate (Kalibre Et), ve baseline Measurement Cycle (Temel Ölçüm Döngüsü) seçeneklerini işaretleyin. Enjeksiyonlar'a tıklayın ve her bağlantı noktası için bileşiği tanımlayın. Ölçüm döngülerini 6 olarak değiştirin. Protokol ve Grup özetini gözden geçirin, ardından tahlil tasarım şablonunu kaydedin.

Kılavuz olarak tahlil tasarımına dayanarak, her bir reaktifi doğrudan enjeksiyon portlarına dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve yükleme kılavuzlarını parmak uçlarınızla yerinde tutun. Tüm reaktifler yüklendiğinde, yükleme kılavuzunu çıkarın ve enjeksiyon portlarında eşit yükleme olup olmadığını görsel olarak incelemek için kartuşu göz hizasında tutun.

Kartuşu ve yardımcı plakayı hücre dışı akı analizörüne aktarın ve test öncesi kalibrasyonu başlatın. Kalibre edildikten sonra, yardımcı plakayı 3D sferoidleri içeren önceden ısıtılmış tahlil plakasıyla değiştirin ve tahlile başlayın. Tahlil bittiğinde, verileri uygun veri analiz yazılımına aktarın.