JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 5:08 dk. • April 30th, 2023
- Yeşil floresan proteini veya GFP eksprese eden kanser hücreleri, non-invaziv optik görüntüleme ile tümör büyümesinin ve metastazının izlenmesini sağlar. Bu hücreleri genellikle tümör mikroçevresinin yeniden oluşturulmasına izin veren ve tümör hücrelerinin çevreleriyle etkileşimini taklit eden ortotopik bir modele implante ederiz.
Anestezi uygulanmış bir fareyi ılık bir ısıtma yastığına yerleştirerek başlayın. Şimdi, oksijen ve bir anestezik olan izofluran sağlamak için burnunu bir burun maskesine sokun. Bir makas kullanarak küçük bir kesi yapın ve dokuyu kesin. Dalağı pankreas ile birlikte yavaşça dışarı çekin ve pankreas kuyruğunu bulun.
Floresan kanser hücreleri süspansiyonlu bir şırınga yükleyin ve yavaşça pankreas kuyruğuna enjekte edin. Enjekte edilen bölgede başarılı implantasyonu onaylayan yüzeysel bir kabarcık belirir. Organları vücut boşluğuna geri yerleştirin ve kesiyi kapatmak için steril bir dikiş kullanın. Şimdi, fareyi bir kafese geri koyun ve iyileşene kadar izleyin.
İstenilen süreden sonra, fareyi bir görüntüleme odasına yerleştirin ve görüntü alın. Işık huzmesi kanser hücrelerine çarpar ve GFP'yi uyarır, bu da yeşil bir floresan üretir. Aşağıdaki protokolde, ortotopik bir murin fare modelinde GFP eksprese eden pankreas kanseri hücrelerinin cerrahi implantasyonunu gerçekleştireceğiz.
Hücreleri implante etmek için önce anestezi uygulanmış bir farenin gözlerine merhem sürün ve hayvanı steril bir örtü ile kaplı bir ısıtma yastığına yerleştirin. Ardından, hayvanın yan tarafını üç iyot ovma ile nazikçe dezenfekte edin ve ardından üç adet %70 etanol durulama uygulayın. Ayak parmağı sıkışmasına yanıt verilmediğini doğruladıktan sonra, hazırlanan hücrelerin yaklaşık 200 mikrolitresini 18 gauge iğne ile donatılmış önceden soğutulmuş 1 mililitrelik bir TB şırıngaya yükleyin.
18 gauge iğneyi 27 gauge iğne ile değiştirin ve hücreleri tekrar buzun üzerine yerleştirin. Ardından, karnın sol üst çeyreğindeki dalağın genel alanını bulun. Forseps kullanarak, dalağın üzerindeki cildi sıkıştırın ve bir cep oluşturmak için yaklaşık 1 santimetrelik bir kesi yapın. Ardından, düz kası dalağın üstüne sıkıştırın ve periton boşluğuna erişmek için dokuyu kesin.
Daha sonra, dalağın kuyruk ucunu nazikçe tutun ve vücut boşluğundan dışarı çekin. Islak steril bir pamuklu çubuk kullanarak, pankreas kuyruğunu bulmak için dalağın ucuna bağlı pankreası yayın. 50 mikrolitre hücreyi pankreas kuyruğuna verin. Ardından, iğneyi yavaşça pankreastan dışarı döndürün.
Başarılı bir implantasyon, herhangi bir sızıntı olmadan yüzeysel bir baloncuk gibi görünecektir. Organları periton boşluğuna geri koyun ve her şeyi kas ve cilt ile çevreleyin. Ardından, kesiyi kapatmak için 6-0 dikiş kullanın. Daha sonra hayvanlara ketoprofen enjekte edin ve tamamen iyileşene kadar izleyin. Uygun deneysel zaman noktasında, anestezi altındaki canlı hayvanda tümör büyümesini görüntülemek için ticari bir küçük hayvan görüntü sistemi kullanın ve uygun uyarma ve emisyon filtrelerini seçin.
Ardından, yalnızca beyaz ışık kullanarak bir ilk görüntü elde edin. Hayvanı aynı pozisyonda tutarak GFP filtrelerine geçin ve ikinci bir görüntü elde edin. Tümör büyümesini analiz etmek için, tümör hücrelerinin floresan alanını ve yoğunluğunu değerlendirmek için beyaz ve floresan görüntüleri üst üste koyun.