JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 3:14 dk • April 30th, 2023
- Pankreas kanseri kök hücreleri veya CSC'ler, kendi kendini yenileyen kanser hücrelerinin bir alt kümesidir ve tüm tümöre yol açabilir. CSC'ler, fibroblastlar, bağışıklık hücreleri, endotel hücreleri ve sitokinler ve büyüme faktörleri gibi hücre dışı matris bileşenleri gibi diğer hücrelerden oluşan iyi korunmuş bir niş içinde bulunur. Böyle bir ortamda hücreler arasında meydana gelen etkileşimler, CSC'lerin yayılmasına ve tümör büyümesinin artmasına yardımcı olur.
CSC'lerin özelliklerini incelemek için onları pankreas tümörlerinden izole ediyoruz. Bir CSC büyüme ortamında insan pankreas tümör dokusundan hücre süspansiyonunu alarak başlayın. Daha sonra, esas olarak fibroblastlar ve CSC'lerden oluşan süspansiyonu jelatin kaplı bir plaka üzerine tohumlayın ve istenen süre boyunca inkübe edin. Fibroblastlar jelatin yüzeyine yapışır ve serbest yüzen CSC'leri hücre süspansiyonunda bırakır.
Az miktarda hücre süspansiyonu alın ve tripan mavisi ekleyin. Bu karışımı bir hemositometreye pipetleyin ve canlı hücrelerin sayısını sayın. Tripan mavisi ölü hücrelere girer ve onları maviye boyar ve canlı hücreleri renksiz bırakır. Son olarak, daha fazla analiz için CSC'leri saklayın.
Aşağıdaki protokolde, CSC'leri pankreas tümörlerinden izole edeceğiz.
- Steril bir biyogüvenlik kabininde bir pankreas duktal adenokarsinomundan kanser kök hücrelerini izole etmek için, steril bir neşter ve forseps kullanarak insan tümörünü bir mililitre steril PBS içeren 60 x15 milimetrelik bir kültür kabında doğrayın, doku tamamen ayrışana kadar gerektiği kadar üç ila dört mililitre PBS daha ekleyin.
Doku süspansiyonunu steril bir konik tüpe aktarın ve PBS'yi beş mililitrelik bir son hacme ekleyin. Daha sonra, numuneyi ayrıştırıcı, santrifüj ile mekanik olarak homojenize edin ve homojenize dokuyu 37 santigrat derecede kollajenaz ile sindirin.
Bir saat sonra, hücreleri santrifüjleyin ve peleti 10 mililitre tam ortamda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir süzgeçten geçirin ve hücreleri tekrar döndürün, bu sefer peleti beş mililitre ACK'da yeniden süspanse edin.
Oda sıcaklığında beş dakika sonra, kırmızı kan hücresi lizis tamponunu santrifüjleme ile çıkarın ve peleti kanser kök hücre ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, hızlı bir şekilde bağlanan fibroblast hücrelerinin çoğunu çıkarmak için hücreleri 37 santigrat derecede jelatin kaplı bir tabak üzerinde inkübe edin. Bir saat sonra, süpernatanı geri kazanın ve canlı pankreas kanseri hücrelerinin sayısını ölçün.