Küre Oluşum Testi: Pankreas Kanseri Kök Hücrelerini Tanımlamak için İn Vitro Bir Yöntem ve Tarama Tedavileri

- Pankreatik Duktal Adenokarsinom (PDAC), yalnızca tümörjenik Kanser Kök Hücrelerinin (CSC) bir alt kümesini içerir. CSC'ler kendi kendini yenileyebilir, pluripotent ve tümör oluşturma yeteneğine sahiptir. Anti-apoptotik proteinleri eksprese ederler ve ayrıca çoklu ilaca dirençli genler içerirler, bu da onları kemoterapiye dirençli hale getirir. Kanser kök hücrelerini tanımlamak ve ilaçların onlar üzerindeki etkisini incelemek için bir küre oluşturma testi yapıyoruz.

İlk olarak, ekstrakte edilen kanser kök hücrelerini istenen hücre kültürü ortamında askıya alın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu çok kuyulu bir plakaya tohumlayın ve istenen süre boyunca inkübe edin. Negatif kontrol olarak birkaç kuyucuğa gerekli miktarda ilgili ilacı ve diğer kuyucuklara plasebo ekleyin. Hücreleri istenen süre boyunca inkübe edin. Kanser kök hücreleri, yapışık olmayan bir kültür ortamı altında küre şeklinde koloniler oluşturur.

İnkübasyondan sonra, bir hemositometre üzerine az miktarda hücre süspansiyonu pipetleyin ve otomatik bir hücre sayacına yerleştirin. Şimdi, oluşan kürelerin sayısını sayın. İlaçla tedavi edilen hücreler genellikle kürelerin boyutunda ve sayısında önemli bir azalma gösterir. Aşağıdaki protokolde, pankreas kanseri kök hücrelerini tanımlamak ve metforminin etkisini değerlendirmek için bir küre oluşturma testi yapacağız.

- Kanser kök hücrelerinin zenginleştirilmesi için tümör küresi oluşumunu kolaylaştırmak için, hücreleri uygun hacimde kanser kök hücre ortamındaki hücreleri, mililitre başına 2 kez 10 ila 3 hücrelik bir nihai konsantrasyona seyreltin ve birkaç dakika buz üzerinde soğutun. Daha sonra, 24 ultra düşük bağlantılı hücre plakasının ilk ve son sıralarına 500 mikrolitre PBS ekledikten sonra, hücreleri pipetle yeniden süspanse edin ve plakanın boş kuyucuklarına oyuk başına 1 mililitre hücre tohumlayın.

Dört hücre kuyusunu ilgilenilen ilaçla ve en az dört negatif kontrol kuyusunu araçla tedavi edin. Daha sonra hücreleri bir hafta boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Her iki günde bir, kuyucukların her birine taze tedavi veya araç ekleyin.

5. veya 7. günde, daha büyük yapıların tanımlanmasına izin veren otomatik bir hücre sayacı ile oluşan tümör kürelerinin sayısını değerlendirin. Tümör kürelerinin seri geçişi için, 7. günde, küreleri hasat etmek için 40 mikrometrelik bir hücre süzgeci kullanın. Daha sonra, küreleri aşağı doğru döndürün ve peleti tek hücreli bir süspansiyona ayırmak için 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca 1 mililitre tripsin içinde inkübe edin. Ardından, az önce gösterildiği gibi hücreleri yedi gün daha genişletin.