JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 4:24 dk • April 30th, 2023
- Dorsal kök gangliyonu veya DRG, mesajları çevreden merkezi sinir sistemine ileten duyusal nöronlardır. Buna karşılık, myenteric pleksus nöronları bağırsakların peristaltik hareketlerinde rol oynar.
Pankreas kanseri gibi kanser durumlarında, bu nöronlar morfolojik ve fonksiyonel olarak değişir. Nöronal morfoloji değişikliklerini incelemek için, nöral hücreleri, laminin proteini ile önceden kaplanmış, çok kuyulu bir plakaya yerleştirilmiş lameller üzerine tohumlayın ve hücreleri nöral bazal ortam ile doldurun.
Laminin proteini, nörit büyümesini teşvik eder. Hücreleri gece boyunca inkübe edin. Daha sonra, pankreas kanseri dokusu ekstrakt ortamını ilk üç oyuğa ve sağlıklı pankreas dokusu ekstrakt ortamını sonraki üç oyuğa ekleyin. Plakayı inkübe edin. Şimdi, nöronlara bağlanan nörona özgü antikor belirteçlerini kullanarak immünohistokimyasal boyama yapın. Lameli cam sürgünün üzerine yerleştirin ve lamı ters çevrilmiş bir mikroskop altına yerleştirin. Yazılımı kullanarak nörit yoğunluğunu ölçün.
Pankreas kanseri dokusu ekstraktında kültürlenen DRG nöronları genellikle sağlıklı pankreas dokusu ekstraktından daha fazla nörit yoğunluğu gösterir. Buna karşılık, mienterik pleksus nöronları, sağlıklı pankreas dokusu ekstraktlarından daha uzun nöritler oluşturur. Aşağıdaki protokolde, yeni doğmuş bir farenin DRG ve myenterik pleksus nöronları üzerinde in vitro nöroplastisite testi yapacağız.
- Hücreleri kültüre hazırlamak için, toplam nöron ve glia sayısını tahmin etmek için bir hemositometre kullanın. Daha sonra, hücreleri 24 oyuklu bir plakada 13 milimetre önceden kaplanmış lameller üzerine tohumlayın. Kullanılan kaplama deneysel amaçlara bağlıdır. Daha sonra, kuyucukları nöral bazal ortamla doldurun ve hücrelerin gece boyunca kuyulara yapışmasına izin verin. Ertesi gün, doku özü takviyeli ortamın veya hücre hattı süpernatan takviyeli ortamın buzunu çözün.
Daha sonra, tohumlama ortamını DRG'lerden aspire edin ve PBS ile isteğe bağlı, çok nazik bir yıkama gerçekleştirin. Daha sonra, mililitre başına 100 mikrogram elde etmek için doku özü takviyeli ortamı veya hücre hattı süpernatan takviyeli ortamı hücrelerin üzerine yavaşça pipetleyin. Şimdi, hücrelerin doku ekstraktı veya hücre hattı süpernatanı ile sağlanan ortamda 37 santigrat derecede 48 saat büyümesine izin verin. 48 saat sonra, ortamı aspire edin ve immün boyama için% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
Çift immünofloresan boyama için, nörona özgü ve gliaya özgü belirteçler kullanın. Morfometri için, nörit yoğunluğunu ölçmek için otomatik yazılımla birlikte bir CCD kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanın. 200X büyütme kullanarak, 50 X 50 mikronluk bir ızgarayı kaplayarak ve kesişen liflerde ölçülen kare başına lif yoğunluğunu sayarak nöronal kültürlerin nörit yoğunluğunu ölçün. Bu analizi, her bir lamel üzerindeki dört ila beş temsili fotomikrograf üzerinde en yoğun büyümenin dört farklı bölgesi için tekrarlayın.
Nöritleri ve perikaryaları işaretleyerek her bir lamel den rastgele seçilen 30 soliter nörondan nörit büyümesini, nöron başına ortalama dal sayısını, ortalama dal uzunluğunu ve perikaryonal boyutu ölçün.