PTM Tabanlı Tümör Mikroçevre İzleme: Tümör Sferoidleri Kullanılarak ECM Rijiditesindeki Değişiklikleri İzlemek İçin Bir Yöntem

- Tümör invazyonunda, periferik tümör hücreleri epitelyal-mezenkimal geçişe veya EMT'ye uğrar, bu da hücre dışı matrisin veya ECM'nin lokal bozulmasına neden olur. Tümör hücrelerinin ECM ile etkileşimini in vitro olarak inceleyebiliriz.

Bu etkileşimleri incelemek için, pankreas tümör hücrelerinden türetilen önceden oluşturulmuş bir sferoidi, gömülü floresan izleyici probları ve kültür ortamı ile birlikte kollajen iskelesi içeren bir plakaya aktarın. Tümör sferoidi, kollajeni bozan ve ECM sertliğini azaltan proteazları serbest bırakır ve bu da ECM'de izleyici probların serbest hareketine neden olur.

Plakayı istenen süre boyunca inkübe edin. Kollajen iskelesindeki numune noktalarının ızgarasına bakmak ve bunlardan video verileri kaydetmek için numuneyi ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Matrisin sferoid yakınındaki bölgesi maksimum kollajen yıkımı gösterir. Bu nedenle, prob hareketini arttırmıştır. Buna karşılık, sferoidden daha uzak alan daha az kollajen bozulması gösterir ve bu da prob moleküllerinin kısıtlı hareketine neden olur.

İzleyici parçacıkların yörüngelerini ölçerek ECM'nin reolojik özelliklerini incelemeye yönelik bu teknik, parçacık izleme mikroreolojisi veya PTM olarak bilinir. Aşağıdaki protokolde, pankreas kanseri kök hücrelerini tanımlamak ve metforminin etkisini değerlendirmek için bir küre oluşturma testi yapacağız.

Başlamak için, iki adet 2 mililitrelik flakon içeren bir laminer akış başlığı içinde bir iş istasyonu hazırlayın. Flakon 1, tümör sferoidini içerecek ve flakon 2, hücresiz bir kontrol olacaktır. 25 kısım steril suya 2 parça stok probu ekleyerek karboksilat ile modifiye edilmiş, 1 mikron çapında floresan izleyici probların seyreltilmiş bir karışımını hazırlayın.

Buzdolabından mililitre sığır kollajeni başına 3.1 miligramlık bir şişe çıkarın ve buzun üzerine koyun. 125 mikrolitre kollajen ve ardından 50 mikrolitre seyreltilmiş izleyici prob solüsyonu flakon 1'e alıkonulur. Probları dağıtmak için kısaca girdap.

Daha sonra, toplam 410 mikrolitre hacim için fenol kırmızısı içeren 235 mikrolitre uygun hücre kültürü ortamı ekleyin ve 205 mikrolitreyi çıkarmadan ve flakon 2'ye yerleştirmeden önce kısa bir süre vorteksleyin. Daha sonra, çözeltiyi nötr pH'a geri getirmek için flakon 1'e yaklaşık 2 mikrolitre 1 molar sodyum hidroksit ekleyin. Karıştırmak için kısaca girdap. Ardından, karışımın kürlenmeye başlamaması için hemen buz rafına geri dönün.

Tümör sferoidini içeren kuyudan 40 mikrolitre ortamı yavaşça çıkarın. Bir sonraki adımı gerçekleştirirken bu 40 mikrolitreyi koruyun. Önceki adımda sferoidin çıkarılıp çıkarılmadığını görmek için kuyuyu kontrol edin. Değilse, 40 mikrolitreyi tekrar kuyuya yerleştirin ve önceki adımı tekrarlayın.

Eğer öyleyse, sferoid içeren 40 mikrolitreyi flakon 1'e ekleyin. Karışımı 60 mikrolitrelik porsiyonlar halinde 96 oyuklu bir plakanın üç ayrı kuyucuğuna aktarmadan önce şişe 1'i hafifçe karıştırın. Karışımı ekledikten sonra hangi kuyucuğun sferoid içerdiğini belirlemek için her bir kuyuyu mikroskopla inceleyin.

Daha sonra flakon 2'ye yaklaşık 2 mikrolitre 1 molar sodyum hidroksit ve 40 mikrolitre hücre kültürü ortamı ekleyin ve bu karışımın 60 mikrolitresini 96 oyuklu plakadaki boş bir kuyuya ayırmadan ve hücresiz kontrol olarak etiketlemeden önce girdap yapın. Plakayı en az bir saat kürlenmesi için 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin.

Numune noktalarından oluşan bir ızgara oluşturmak için önce numune plakasını inkübatörden mikroskop aşamasına aktarın. Isıtılmış bir aşama mevcut değilse, numunenin oda sıcaklığına dengelenmesi için 10 dakika bekleyin. Sağlam ve görüntülemeye hazır olduğundan emin olmak için numuneyi düşük güçlü objektif lensleriyle gözlemleyin. Kuyu içindeki tümör pozisyonunu belirleyin ve bunu daha sonraki mekansal kokayıt için iletilen bir ışık görüntüsü ile belgeleyin.

Tipik olarak, sferoidin etrafındaki eşmerkezli halkalar halinde dağıtılan her bir kuyucukta 20 numune noktası, yeterince ayrıntılı sonuçlar üretecektir. Sahneyi istenen her konuma getirin ve x ve y koordinatlarını kaydetmek için mikroskop arabirim yazılımını kullanın.

Mikroskobu yüksek güçlü bir objektif merceğe geçirin ve izleyici probların uyarma dalga boyu için uygun filtre küpünü seçin. Oluşturulan noktaların listesini kullanarak, ızgaradaki ilk noktaya gidin. Birkaç odak içi izleyici probu içeren bir görüş alanı bulmak için yukarı hareket etmeden önce kuyunun dibini bulmak için odağı ayarlayın.

Yoğunluk histogramını gözlemleyin ve görüntünün doygun hale gelmemesini sağlarken mümkün olan en yüksek dinamik aralığı vermek için pozlama yoğunluğunu ve süresini ayarlayın. Kare başına 20 ila 30 milisaniye kare hızında bir video dizisi elde edin ve uygun bir adlandırma kuralıyla kaydedin. Kayıt sırasında mikroskoba veya masaya dokunmayın.

Izgaradaki her örnek noktası için kaydı tekrarlayın. Ardından, deneydeki her kuyu için bir ızgara oluşturmak için işlemi tekrarlamaya devam edin ve uzunlamasına izleme süresi boyunca her bir zaman noktası için tüm işlemi tekrarlayın.