DNA Hasar Odaklarının Değerlendirilmesi: İmmünofloresan Boyama Kullanarak Kanser Hücre Hattında Radyasyona Bağlı DNA Hasar Odaklarını Belirlemek
JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 4:09 dk. • April 30th, 2023
- İyonlaştırıcı radyasyon, tek sarmallı kırılmalar veya SSB'ler ve çift sarmallı kırılmalar veya DSB'ler gibi farklı DNA hasarı türlerine neden olur. Tek iplikçik kopmaları veya SSB'ler, radyasyon bazlara zarar verdiğinde ve DNA omurgasını parçaladığında meydana gelirken, çift iplikçik kopmaları, DSB'ler, zıt DNA ipliklerinde iki SSB meydana geldiğinde gelişir. DSB oluşumunun ilk adımı, immünofloresan boyama ile görüntülenebilen H2AX histonunun fosforilasyonudur.
İmmünofloresan boyama yapmak için, bir Petri kabına yerleştirilmiş bir kapak kızağına sabitlenmiş bir numuneye birincil antikorlar ekleyin. Antikorlar, fosforile histon proteini gama-H2AX'e bağlanır. Numuneyi inkübe edin ve bağlanmamış antikorları çıkarmak için PBS ile yıkayın. Daha sonra, birincil antikorları tanıyan ve bunlara bağlanan floroforları taşıyan ikincil antikorları ekleyin. Çekirdekleri karşı boyamak için istenen miktarda DAPI floresan boyası ekleyin.
Kapak kızağını bir montaj ortamı olan bir cam kızağa nazikçe monte edin ve hücreleri floresan mikroskop altında gözlemleyin. Gama-H2AX odakları, ışınlanmış kanser hücrelerinde belirgin floresan noktalar olarak görünür. Aşağıdaki protokolde, radyasyona bağlı DNA o
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin