DCFH-DA Boyama ile ROS Tespiti: Kolorektal Kanser Hücre Hatlarında Toplam ROS Ölçümü

JoVE Encyclopedia of Experiments

Kanser Araştırmaları

0 görüntüleme • 3:50 dk • April 30th, 2023

- Reaktif oksijen türleri, elektronlar elektron taşıma zincirinden sızdığında ağırlıklı olarak mitokondriden üretilir. Bu elektronlar moleküler oksijen ile birleşerek çeşitli reaktif oksijen türlerine veya ROS'a yol açar. Kanser hücrelerinde, reaktif oksijen türlerinin aşırı üretimi vardır. Bu oldukça reaktif ROS molekülleri, hücre içindeki zarlara, proteinlere ve DNA'ya oksidatif olarak zarar verebilir.

Artan ROS seviyeleri, DNA'ya zarar verir ve kanserin ilerlemesine neden olan onkojenik bir sinyal yolunun aktivasyonuna yol açar. Bu nedenle, kanser hücreleri tarafından üretilen reaktif oksijen türlerinin seviyelerini tespit etmek hayati önem taşır.

İnsan kolorektal kanserinden kanser hücrelerini uygun bir kültür ortamında alarak başlayın. Daha sonra, bu hücreleri çok kuyulu bir plakaya tohumlayın ve DCFH-DA çözeltisi ekleyin. Plakayı istenen süre boyunca inkübe edin. DCFH-DA hücre zarını geçer. Hücrenin içine girdikten sonra, DCFH-DA, hücresel bir esteraz enziminin varlığında DCFH'ye dönüşür. Ayrıca, DCFH'nin reaktif oksijen türleri tarafından oksidasyonu yeşil floresan molekülleri verir.

Hücreleri floresan mikroskobu altında gözlemleyin. Yeşil floresan yoğunluğu, hücredeki reaktif oksijen türlerinin seviyesini gösterir. Aşağıdaki protokolde, kolorektal kanser hücrelerindeki reaktif oksijen türlerini boyamak için DCFH-DA boyası kullanıyoruz.

- Hücreleri lekelemek için, ilaç içeren ortamı çıkarın ve bir kez DMEM ile yıkayın. Her bir oyuğa 500 mikrolitre DCFH-DA çalışma çözeltisi ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, DCFH-DA'yı kuyulardan çıkarın ve iki kez DMEM ve bir kez PBS ile yıkayın.

Ardından, her kuyucuğa 500 mikrolitre PBS ekleyin. Hücrelerin temsili görüntülerini almak için floresan mikroskobu üzerindeki yeşil floresan protein kanalını kullanın. Ardından, PBS'yi çıkarın ve her bir oyuğa 200 mikrolitre radyoimmünopresipitasyon tahlil tamponu ekleyin.

Plakayı beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve hücre lizatlarını 1.5 mililitrelik tüplere toplayın. Tüpleri 21.130 x g'da 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanın 100 mikrolitresini 96 oyuklu siyah bir plakaya aktarın. Her bir oyuktaki floresansı ölçmek için 485 nanometre uyarma dalga boyunda ve 530 nanometre emisyon dalga boyunda bir mikroplaka okuyucu kullanın.

Daha sonra, 1 mikrolitre süpernatantı 100 mikrolitre protein tahlil çözeltisi ile 96 oyuklu berrak bir plakaya aktararak protein konsantrasyonunu ölçün. Floresan yoğunluklarını normalleştirmek için protein konsantrasyonlarını kullanın.

06:40

Vivo Reaktif oksijen türleri içinde bir fare görüntüleme modeli yara

İlgili videolar

0 Görüntüler

13:20

Akış sitometrik ölçüm makrofajlar FcγR Cross-linking yanıt ROS üretim

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:00

Meningitik Escherichia Coli ile Enfekte Olan Nötrofillerde Reaktif Oksijen Türlerinin Gerçek Zamanlı Nicelemesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:56

Mitokondrial Membran Potansiyeli ve Reaktif Oksijen Türleri Canlı Rat Kortikal nöronlar Belirlenmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

15:17

Kolorektal Kanser Hücre Yüzey Protein Profil Antikor Mikroarray ve Floresans Multiplexing

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:17

Kanserler Üretim ve reaktif oksijen türlerinin (ROS Algılama)

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:33

Vasküler Ca Görselleştirme 2 + Parakrin Türetilmiş ROS tarafından tetiklenmiş Sinyal

İlgili videolar

0 Görüntüler

16:41

Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:37

Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:53

2',7'-Diklorodihidrolüorescein Diasetat Boyama ile Yapışık Hücrelerde Toplam Reaktif Oksijen Türlerinin Tespiti

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 29 Ağustos 2026