Dolaşımdaki miRNA Ekstraksiyonu: Organik Ekstraksiyon ve Küçük RNA Zenginleştirme Yoluyla Plazma Örneklerinden miRNA'yı İzole Etmek İçin Bir Yöntem

- MikroRNA'lar veya miRNA'lar, mRNA'yı parçalayarak veya fonksiyonel proteinlere translasyonlarını bloke ederek gen ekspresyonunu düzenleyen küçük, kodlamayan RNA'lardır. Dolaşımdaki miRNA'lar potansiyel kanser biyobelirteçleridir ve plazma gibi vücut sıvılarından ekstrakte edilebilirler. Başlamak için, plazmayı, numuneyi aynı anda homojenize eden ve RNA bozunan ribonükleazları inhibe eden denatüre edici bir çözelti ile karıştırın.

Numuneyi DNA ve protein içeren bir alt organik faz ve RNA içeren bir üst sulu faz olmak üzere iki faza ayırmak için asit fenol-kloroform ve santrifüj ile muamele edin. Sulu fazı geri kazanın. Çözeltiden RNA'yı çökeltmek için mutlak etanol ekleyin.

Büyük RNA ayrılmasına elverişli bir başlangıç koşulu ayarlamak için numune etanol konsantrasyonunu %25'e getirin. Karışımı önceden monte edilmiş bir filtre kartuşuna ve santrifüje aktarın. Büyük RNA'lar filtre üzerinde seçici olarak hareketsiz hale gelirken, daha küçük miRNA'lar süzüntüde toplanır.

Daha sonra, miRNA izolasyonunu desteklemek için etanol konsantrasyonunu %55'e yükseltin. Filtratı yeni bir filtre kartuşuna aktarın ve miRNA'ları yakalamak için santrifüjleyin. Kartuşu bir toplama tüpüne yerleştirin ve uygun bir elüsyon tamponu ekleyin. MiRNA'ları tüpe atmak için santrifüjleyin. Aşağıdaki protokolde, kolorektal kanser hastalarının plazmasından dolaşımdaki miRNA izolasyonunu göstereceğiz.

Başlamak için, 400 mikrolitre plazma örneğini RNaz içermeyen 2 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ardından, tüpe 400 mikrolitre denatüre edici solüsyon ekleyin. 4 mikrolitre 1 nanomolar spike-in ekleyin.

Çözeltiyi karıştırdıktan sonra 800 mikrolitre asit fenol-kloroform ekleyin. Çözeltiyi 60 saniye vorteksleyin ve 15 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. Daha sonra, üst sulu fazda bulunan lizatı, interfazı bozmamaya dikkat ederek temiz bir tüpe aktarın.

Geri kazanılan sulu fazın hacmini ölçün ve lizata 1/3 hacim etanol ekleyin. Ardından, yeni bir toplama tüpüne bir filtre kartuşu yerleştirin. 700 mikrolitreye kadar etanol lizat karışımını filtre kartuşuna aktarın. Filtre kartuşunu 10.000 x g'da 30 saniye santrifüjleyin.

Ardından, akışın toplam hacmini ölçün. Daha sonra, süzüntüye etanol hacminin 2 / 3'ünü ekleyin ve iyice karıştırın. Yeni bir toplama tüpüne ikinci bir filtre kartuşu yerleştirin. Ardından, 700 mikrolitreye kadar numuneyi kartuşa aktarın ve akışı atmadan önce 30 saniye boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.

Filtre kartuşuna 700 mikrolitre mikroRNA yıkama solüsyonu ekleyin ve 15 saniye boyunca 10.000 x g'da bir toplama tüpü ile santrifüjleyin. Akışı atın ve filtre kartuşunu aynı tüpe geri koyun.

Bundan sonra, filtre kartuşunu yeni bir toplama tüpüne taşıyın. Ardından, kartuşa 100 mikrolitre önceden ısıtılmış elüsyon çözeltisi ekleyin. MikroRNA'ları geri kazanmak için filtre kartuşunu 10.000 x g'da 30 saniye santrifüjleyin.

• MicroRNAs - Small non-coding RNAs that regulate gene expression.
• Circulating miRNAs - miRNAs in body fluids used as possible cancer biomarkers.
• Denaturing Solution - Homogenizes the sample and inhibits RNA-degrading ribonucleases.
• Acid phenol-chloroform - Used to separate the sample into distinct phases.
• Elution Buffer - A solution added to elute miRNAs into a collection tube.

• Introduce MicroRNAs - Small molecules regulating gene expression (e.g., mirna).
• Key Concepts – Summarize the roles and potential of miRNAs in cancer research (e.g., mirna plasma kit).
• Underlying Mechanisms – miRNAs are isolated using specific procedures (e.g., mirvana isolation kit).
• Connect to Experiment – The study utilizes miRNA isolation from plasma samples.

• What are MicroRNAs and how to extract them (using mirna extraction kits)?
• How does the process of miRNA isolation work (using mirvana paris kit)?
• What is the role of circulating miRNAs in cancer research?

• Practical Applications – miRNAs in diagnostics, research, and treatment (e.g., micro rna isolation).
• Industry Impact – Impacting biotech, healthcare sectors (e.g., s1122-1830).
• Societal Importance – Potential benefits in early disease detection (e.g., miRNA isolation protocol).
• Link to Scientific Advancements – Emergence of advanced extraction kits (e.g., mirna plasma extraction kit).