$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Çevresel zenginleştirme veya EE, kanser gibi çeşitli hastalıklar üzerinde faydalı etkiler elde etmek için konut parametrelerindeki değişiklikleri ifade eder. Tümör taşıyan bir farede, EE bağışıklık sistemini aktive eder ve iltihabı azaltır, bu da sonuçta bağırsak mikrobiyotasını iyileştirir ve hayatta kalma oranını artırır. Bağırsak mikrobiyotasındaki değişiklikleri incelemek için, fare dışkısını içeren bir tüpe istenen miktarda dışkı lizis tamponu ekleyin.
Numuneyi santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. DNaz ve RNazı denatüre eden guanidinyum klorür lizis tamponu ekleyin. Daha sonra, etanol ekleyin ve numuneyi bir silika döndürme kolonuna aktarın.
Etanol, DNA'nın silikaya bağlanmasına yardımcı olur. Numuneyi santrifüjleyin. Şimdi, sütunu yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve DNA'yı elüte etmek için sütuna bir elüsyon tamponu ekleyin.
Numuneyi santrifüjleyin ve sütunu atın. Numuneyi bir PCR tüpüne aktarın ve DNA'yı çoğaltmak için PCR çalıştırın. DNA'yı agaroz jel üzerine yükleyin ve mikrobiyal DNA'nın boyutunu ölçmek için elektroforez gerçekleştirin. Aşağıdaki protokolde, tümörijenik farede EE'nin kolon mikrobiyotası üzerindeki etkisini analiz etmek için dışkıdan DNA'yı izole edeceğiz.
- Bir dışkı patojeni tespit protokolünü takiben mikrobiyal DNA'yı dışkıdan izole etmek için ticari bir kit kullanın. Bunu yaparken, numuneleri eksi 80 santigrat derece dondurucudan kuru buz üzerine aktarın ve tartın. Ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi mikrobiyal DNA'yı çoğaltan bir PCR ayarlayın. Ardından, manyetik boncuklar kullanarak reaksiyon ürünlerini temizleyin.
Temizleme için, önce reaksiyon ürünlerini çekmek için amplikon PCR plakasını kısaca santrifüjleyin. Daha sonra, manyetik boncukları eşit şekilde dağıtmak için girdaplayın ve her reaksiyona 20 mikrolitre alikot aktarın. Tüm hacmi 10 kez yavaşça pipetleyerek boncukları solüsyonla iyice karıştırın. Ardından boncukların 5 dakika oturmasına izin verin.
Ardından, PCR plakasını manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve manyetik boncuk toplamanın ardından süpernatantların temizlenmesi için 2 dakika bekleyin. Ardından, süpernatantları çıkarın ve atın. Daha sonra, plaka hala mıknatısın üzerindeyken, her bir boncuk kuyusunu 200 mikrolitre taze yüzde 80 etanol ile doldurun ve 30 saniye bekleyin. Ardından, süpernatanı dikkatlice çıkarın.
Bu yıkama adımını bir kez tekrarlayın ve boncukları 10 dakika kurumaya bırakın. Şimdi, plakayı manyetik standdan çıkararak ve her bir oyuğa 52.5 mikrolitre Tris ekleyerek reaksiyon ürünlerini boncuklardan ayırın. Tüm hacmi 10 kez yavaşça pipetleyerek boncukları tamamen çözelti içinde karıştırın. Ardından, boncukları daha önce olduğu gibi manyetik stand üzerinde toplayın ve 50 mikrolitre süpernatantı temiz bir PCR plakasına aktarın. Plakayı şeffaf bir yapıştırıcı ile örtün ve eksi 20 santigrat derecede bir haftaya kadar saklayın.