CRC Organoid Hücre Etiketleme: GFP Lentivirus ile Dönüştürülmüş Kolorektal Kanser Organoid Hücreleri Oluşturmak İçin Bir Yöntem

- Organoidler, köken organının temel doku özelliklerini taklit etmek için kendi kendini organize eden üç boyutlu in vitro hücresel yapılardır. Etiketlemeye başlamak için, hücreleri süspansiyona ayırmak için hasat edilen organoidleri proteolitik ve kollajenolitik bir enzim kokteyli ile muamele edin. Hücreleri enzim içeren süpernatanttan ayırmak için santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Lentiviral vektörler içeren bir ortam kullanarak hücre peletini çözün. Bu rekombinant virüsler, yeşil bir floresan proteini veya GFP için kodlama dizisini taşır.

Virüsler hücrelerle birleşir ve genetik materyallerini ve bazı viral enzimleri sitoplazmaya salar. Viral ters transkriptaz, konakçının çekirdeğine hareket eden tamamlayıcı viral DNA'yı sentezler. Viral integraz, GFP dizisi içeren viral DNA'nın konakçı genomuna dahil edilmesine yardımcı olur. Bu dönüştürülmüş hücreleri hücre dışı bir matris veya ECM kaplı kültür plakasında büyütün. Ortamı aspire edin ve bağlanmamış hücreleri toplamak için santrifüjleyin. Hücreleri ek ECM'de yeniden askıya alın.

Hücre canlılığını arttırmak için süspansiyonu yapışkan kültür üzerine yerleştirin. Matris katılaştıktan sonra, kültür ortamı ekleyin ve organoid oluşumunu kolaylaştırmak için inkübe edin. Kültürü bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin. Dönüştürülen hücreler yeşil floresan proteinleri sentezler. Bu hücrelerden oluşan organoidler GFP pozitifliği gösterirler. Aşağıdaki protokol, GFP'nin hasta kaynaklı kolorektal kanser organoid hücrelerine lentiviral transdüksiyonunu göstermektedir.

- 7 ila 10 günlük kültürden sonra, organoidleri steril bir hücre kazıyıcı ile mekanik olarak ayırın ve organoidleri santrifüjlemeleri için 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Ardından, başka bir santrifüjleme için hafifçe vurarak peletleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Kolorektal kanser organoidlerini ayırmak için, tüplere 500 mikrolitre proteolitik ve kollajenolitik enzim çözeltisi ekleyin ve hafifçe vurarak karıştırın.

Oda sıcaklığında 10 dakika sonra, hücrelere% 1 FBS ile takviye edilmiş 500 mikrolitre ortam ekleyin ve organoidleri parçalamak için hücre süspansiyonunu birkaç kez çok nazikçe pipetleyin.

- Geçiş sırasında insan CRC organoidlerinin nazikçe pipetlenmesi, kültürde bozulmamış bir sferoid oluşumunu korumak için kritik öneme sahiptir.

- Hücreleri tekrar santrifüjleyin ve peletleri 100 mikrolitre 5x GFP lentivirüs stoğu ve 400 mikrolitre taze kolorektal kanser organoid kültür ortamında yeniden süspanse edin.

- Özellikle yaklaşık% 100 enfeksiyon verimliliği elde etmek için, insan CRC organoidlerini yüksek titre GFP lentivirüsü ile enfekte etmek esastır.

- 500 mikrolitre orta konsantrasyon başına 5 kez 10 ila beşinci ayrışmış tümör hücresi elde etmek için her tüpteki hacmi ayarlayın ve gösterildiği gibi yapay hücre dışı matris kaplı 12 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre hücre yerleştirin. Hücre kültürü inkübatöründe 18 saat sonra, yüzen hücre içeren süpernatanları santrifüjleme için ayrı ayrı 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüplerine aktarın, ardından peletlerin buz üzerinde tüp başına 70 mikrolitre yapay hücre dışı matris içinde yeniden süspansiyonu yapın.

Kolorektal kanser hücresi canlılığını arttırmak için, tümör hücresi içeren yapay hücre dışı matrisi 12 oyuklu plakadaki tümör organoidlerinin üzerine yerleştirin ve plakayı 30 dakika boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Yapay hücre dışı matris kaplama katılaştığında, kültürleri %1 FCS ile takviye edilmiş 1 mililitre taze CRC organoid kültür ortamı ile besleyin ve hücreleri üç gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Ardından, neredeyse %100 GFP pozitifliğini doğrulamak için enfekte olmuş hücreleri floresan mikroskobu ile gözlemleyin ve hücreleri 4 ila 6 gün daha inkübatöre geri koyun.