JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 2:57 dk. • April 30th, 2023
- Kolorektal kanser organoidlerini ifade eden yeşil floresan proteini veya GFP kültürü ile başlayın. Organoidleri hasat edin. Organoidleri tek hücreli bir süspansiyona ayırmak için bir hücre ayırma enzim çözeltisi ile muamele edin. Enzim içeren süpernatanı ayırmak için santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın. Yapay bir hücre dışı matris içeren ortam kullanarak GFP eksprese eden kolorektal kanser hücrelerini yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu bir şırıngaya yükleyin ve ortam sıcaklıklarında matris katılaşmasını önlemek için buz üzerinde tutun.
Ardından, sırtüstü pozisyonda anestezi uygulanmış bir fare hazırlayın. Rektumun mukozal tabakasını anal açıklıktan yavaşça dışarı çekin. Şimdi, hazırlanan GFP eksprese eden kanser hücresi süspansiyonunu, kan damarları ağını içeren rektal submukozal tabakaya enjekte edin. Farenin iyileşmesine izin verin.
Birkaç gün içinde, enjeksiyon bölgesinde GFP eksprese eden bir primer tümör gelişir. Spontan metastaz ile bu tümör hücreleri ayrılır ve dolaşıma girer. Sonunda, hücreler uzak organlara ekstravaze olur ve GFP pozitif metastatik tümörler oluşturmak için çoğalır. Aşağıdaki protokolde, GFP eksprese eden kolorektal organoid hücrelerin ortotopik olarak enjekte edilmesiyle kolorektal kanserin spontan metastaz yapan bir fare modelinin oluşturulmasını göstereceğiz.
- CRC hastadan türetilmiş tümör ksenogreftlerinin spontan metastaz fare modelini oluşturmak için, GFP etiketli organoidleri gösterildiği gibi ayırın ve tek tümör hücresi süspansiyonlarını 5 mikrolitre PBS başına 5 kez 10 ila beş tümör hücresine seyreltin,% 50 yapay hücre dışı matris konsantrasyonu ile desteklenmiştir. 22 gauge iğne ile donatılmış bir şırıngaya fare başına 50 mikrolitre hücre yükleyin ve tümör hücrelerini buzun üzerine yerleştirin.
Daha sonra, ayak parmağını sıkıştırmaya yanıt verilmediğini onaylayın ve ilk anestezi uygulanmış NOG faresini laboratuvar tezgahında sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Steril cımbız kullanarak, rektal mukozayı anüsten nazikçe çekin ve tümör hücrelerini hemen rektal submukozaya enjekte edin.