JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 5:19 dk • April 30th, 2023
- Mutasyona uğratılacak istenen tümör baskılayıcı geni çevreleyen LoxP ekleri adı verilen spesifik Cre-rekombinaz enzim tanıma dizilerini taşıyan modifiye edilmiş bir genoma sahip anestezi uygulanmış koşullu mutant bir fare alarak başlayın. Cerrahi olarak karın boşluğunu ortaya çıkarın. Distal kolonu bulun ve üst kısmını kelepçeleyin. Transanal olarak tıbbi sınıf bir tüp yerleştirin ve distal kolona ilerletin. Herhangi bir dışkı maddesini çıkarmak için kolonu tuzlu suyla yıkayın. Tüpü değiştirin. Segmentasyon için kolonun alt bölgesini kelepçeleyin. Uygun bir hücre ayrışma çözeltisi kullanarak segmenti şişirin. Bu, mukozal bariyeri deler ve bağırsak kript hücrelerinin erişilebilirliğini arttırır. Ayrışma çözeltisini boşaltın.
Daha sonra, kolon segmentine bir adenoviral süspansiyon enjekte edin. Bu tasarlanmış viral vektörler, Cre-rekombinaz enzimlerini kodlar. Virüs hücreye girer, DNA'sını çekirdeğe bırakır ve enzimleri ifade eder. Proteinler, konakçı genomundaki LoxP eklerini tanır ve bölgeye özgü rekombinasyonu katalize eder, böylece tümör baskılayıcı geni inaktive eder. Bu fonksiyon kaybı mutasyonu kanserin ilerlemesini teşvik eder. Kesiği dikin ve farenin iyileşmesine izin verin. İzole kolorektal tümörlerin büyümesini gözlemlemek için izleyin. Aşağıdaki protokol, segmental adeno-cre enfeksiyonu ile bir kolorektal kanser fare modeli oluşumunu göstermektedir.
- Anestezi uygulanmış bir fareyi sırtüstü pozisyona getirerek başlayın ve hayvanın gözlerine merhem sürün. Fareyi güvenli bir konuma bantlayın ve ardından ayak parmağınızı kıstırarak uygun sedasyon seviyesini onaylayın. Alt karın derisinde yaklaşık 15 milimetrelik bir orta hat kesisi yapın. Ardından, karın duvarı kas sistemini kavramak için forseps kullanın ve karın boşluğunu açmak için kası makasla dikkatlice kesin. Distal kolonu tanımladıktan sonra, dokuyu anüsün yaklaşık 15 milimetre proksimalinde hassas bir kelepçe ile dikkatlice perçinleyin.
Daha sonra, esnek bir Teflon tüpü transanal olarak yerleştirin, tüpü luminal oklüzyona ulaşana kadar dikkatlice ilerletin ve tüpü 30 gauge kanül ile kanüle edin. Kanüle standart 1 mililitrelik bir şırınga bağlayın ve dışkı maddesinin tamamı boşaltılana kadar kolonu birkaç mililitre normal tuzlu su ile yıkayın. Distal kolon boşaldığında, salin tüpünü yeni bir Teflon tüp ile değiştirin ve kolonu ilk kelepçenin yaklaşık 3 milimetre distalinde tıkamak için ikinci bir kelepçe kullanın.
30 gauge kanül ile donatılmış ikinci bir 1 mililitrelik şırınga kullanarak, klemplenmiş kolon segmentine dikkatlice 50 ila 80 mikrolitre% 0.25 Tripsin-EDTA enjekte edin. Kolon, klemplenmiş doku segmentini delmeden mukozal bariyeri kıracak kadar şişmelidir. 10 dakika sonra distal klempi çıkarın. Ardından, Tripsin tüpünü çıkarın ve distal kolonu 500 mikrolitre normal salin ile yıkayın.
Yeni bir Teflon tüp yerleştirdikten sonra, kolonu tekrar sıkıştırın ve dokuyu 50 ila 80 mikrolitre adenoviral çözelti ile şişirin. 30 dakika sonra, klempleri ve tüpü çıkarın ve karın duvarını 6-0 hızla emilebilir koşu dikişleri ile kapatın. Cildi cerrahi yara klipsleriyle kapatın ve hayvanı tamamen iyileşene kadar bir ısıtma yastığı üzerinde izleyin.
Kolonoskopi ile tümör büyümesini izlemek için, anestezi uygulanmış tümör taşıyan hayvanı sırtüstü pozisyonda bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirin ve endoskopu transanal olarak bağırsak sistemine yerleştirin. Kolonu şişirmek için görsel kontrol altında havayı nazikçe şişirin. Ardından, distal kolonda mukozal lezyon tanımlanana kadar kapsamı dikkatlice ileri doğru itin ve her endoskopik görüntüyü daha sonra değerlendirilmek üzere elde edildiği gibi kaydedin. Tüm görüntüler elde edildiğinde, endoskopu yavaşça çıkarın ve tamamen iyileşene kadar fareyi 38 santigrat derecelik bir ısıtma yastığına yerleştirin.