CRC Hücrelerinde Fosfataz Deneyi: Kolorektal Kanser Hücrelerinde Tau Proteininin Fosforilasyon Durumunu İncelemek İçin Bir Yöntem

0 görüntüleme4:22 dk • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- Tau proteini, kolorektal kanser hücrelerinde nükleolusa periferik olarak lokalize olur ve nükleolar yapının korunmasına yardımcı olur. Çoğunlukla, bu hücreler hiperfosforile tau proteinini eksprese eder ve bu da ilaç direncine neden olur. Bu nedenle, bir fosfataz testi yaparak tau fosforilasyon seviyelerini analiz ediyoruz.

İnsan kolorektal kanser hücrelerinden toplam protein içeren hücre lizatını test ve kontrol olarak etiketlenmiş iki şişede alarak başlayın. Test örneğini alkalin fosfataz enzimi ile muamele edin. Alkalin fosfataz, fosfat gruplarını tau'dan uzaklaştırırken, kontrol şişesi fosforile tau proteinini tutar.

Ardından, proteinleri ayırmak için hem numuneyi hem de kontrol tau'sunu bir poliakrilamid jel üzerinde çalıştırın. Fosforile tau, jel üzerinde fosforile olmayan tau proteininden daha yavaş hareket eder. Protein örneğini uygun bir zara elektroblot yapın ve hem fosforile hem de normal tau'ya karşılık gelen birincil antikorları ekleyin.

Lekeyi gece boyunca kuluçkaya yatırın. Lekeyi, birincil antikorun Fc bölgesine bağlanan raportör enzim konjuge ikincil antikor ile tedavi edin. Son olarak, lekede bulunan toplam protein örneğinden tau proteinini tanımlamak için kemilüminesan substrat kullanarak lekeyi geliştirin. Aşağıdaki protokolde, CRC hücrelerinde tau'nun genel fosforilasyon durumunu değerlendirmek için fosfataz testini göstereceğiz.

- 20 mikrogram toplam protein içeren numuneleri hazırladıktan sonra, her birine iki mikrolitre alkalin fosfataz tamponu ve 10 mikrolitre alkalin fosfataz ekleyin. Ardından, her bir numunenin son hacmi 20 mikrolitre olacak şekilde damıtılmış su ekleyin.

Numuneleri 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Numuneler inkübe edilirken, aynı konsantrasyonda, ancak karşılaştırma için fosfataz içermeyen ek numuneler hazırlayın. Bir saat sonra, 50 milimolar final konsantrasyonunda EDTA veya 10 milimolar final konsantrasyonda sodyum ortovanadat ekleyerek reaksiyonu durdurun.

400 milimolar DTT içeren taze hazırlanmış 4X SDS jel yükleme tamponu ekleyin. Bir ısı bloğu kullanarak, numuneleri 100 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Numuneleri vorteksleyin ve ardından oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika soğumaya bırakın.

Daha sonra, kuyucuk başına 13 mikrolitre numune ve moleküler ağırlık merdivenini %10'luk bir poliakrilamid jel üzerine yükleyin. Elektroforez sistemini bir güç kaynağına bağlayın ve protein örneklerini istifleme jelinden çözme jeline taşımak için voltajı 20 dakika boyunca 70 volta ayarlayın.

Bundan sonra, 125 volta yükseltin ve jeli, numuneler ve protein merdiveni jelin sonuna ulaşana kadar yaklaşık 70 ila 120 dakika çalıştırın. Islak bir elektroblotlama sistemi kullanarak, jeli yaklaşık 100 dakika boyunca 100 voltta bir poliviniliden florür membranına aktarın.

Daha sonra, oda sıcaklığında 90 dakika boyunca% 4 sığır serum albümininde lekelenmek üzere zarı inkübe edin. Lekeyi gece boyunca 4 santigrat derecede birincil antikor çözeltisi içinde inkübe edin. Ertesi gün, lekeyi PBST'de üç kez yıkayın ve her seferinde yedi dakika yıkayın.

İlgili ikincil antikor çözeltisinde oda sıcaklığında 90 dakika inkübe edin. Ardından, PBST ile dört kez yıkayın ve her yıkama yedi dakika sürer. Üreticinin talimatlarına göre bir kemilüminesans kiti kullanarak lekeyi geliştirin.

Geliştirilen lekeyi şeffaf plastik sargı ile örtün ve ardından piyasada bulunan bir kemilüminesans görüntüleme sistemi ile lekenin kemilüminesans görüntülerini elde edin.

09:22

In Vitro toplama Deneyler hiperfosforile tau proteini kullanılarak

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:49

Vitro Tahlil türleri çalışmak için toplama Tau Protein ve uyuşturucu tarama

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:59

Renkölçer analiz, alkalin fosfataz etkinliğinde S. aureus biyofilm

İlgili videolar

0 Görüntüler

13:38

Hücre Döngüsü FRET oranlı metrik sayesinde Kinaz ve Fosfataz Aktiviteleri İzleme

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:28

CRC Hücrelerinde Mikrotübül Bağlanma Deneyi: Kolorektal Kanser Hücrelerinde Mikrotübül Bağlayıcı Tau Proteinini İncelemek İçin Bir Yöntem

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:14

Protein Fosforilasyon Analizi için Tek Moleküllü Aşağı Çekme Testi: Hücre Lizatında Protein Fosforilasyonunu Ölçmek İçin Yüksek Verimli Bir Teknik

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:47

Proteinlerdeki Çoklu Fosforilasyonları Tanımlamak için Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

İlgili videolar

0 Görüntüler

12:47

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

İlgili videolar

0 Görüntüler

12:55

Tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin Tau proteinin birlikte Mikrotubul bağlama için

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:55

Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 22 Ağustos 2026