JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 4:28 dk • April 30th, 2023
- Tau, mikrotübüllerin stabilize edilmesinde ve birleştirilmesinde rol oynayan mikrotübül ile ilişkili bir proteindir. Birçok kanser hücresi, iyi organize edilmiş bir mikrotübül bağlanmasını sürdüremeyen hiperfosforile tau proteini eksprese eder. Tau proteini ve mikrotübüller arasındaki etkileşimi incelemek için, bir mikrofüj tüpüne tau proteini ve bir mikrotübül çalışma çözeltisi içeren kanser hücresi lizatı ekleyin.
Hücre lizatında bulunan fosforile edilmemiş tau proteinleri mikrotübüllere bağlanır. Şimdi, mikrotübüller oluşturmak için filamentlere polimerize olan bir protein olan tübülinin aktivitesini stabilize etmek için tüpe istenen miktarda PEM tamponu ekleyin. Karışımı istenen süre boyunca inkübe edin.
Mikrotübüle bağlı proteini peletlemek için karışımı santrifüjleyin. Bağlanmamış protein süpernatantta kalır. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve peleti uygun bir tamponda yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş pelet süspansiyonuna bir jel yükleme tamponu ekleyin ve mikrotübüle bağlı proteini ve elektroblotu uygun bir zar üzerinde ayırmak için numuneleri bir poliakrilamid jel üzerinde çalıştırın.
Uygun antikorlar ekleyin ve bağlı tau proteinlerini tanımlamak için kemilüminesans substratı kullanarak lekeyi geliştirin. Aşağıdaki protokolde, mikrotübüle bağlı proteinleri tanımlamak için mikrotübül bağlama testini gerçekleştireceğiz.
- Taze numuneler hazırladıktan sonra, 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Numuneleri 100.000 x g ve 25 santigrat derecede 60 dakika boyunca ultrasantrifüj edin. Daha sonra, bağlanmamış tau içeren her süpernatantın 120 mikrolitresini temiz ve etiketli tüpleri ayırmak için aktarın. Bağlı tau içeren pelete 120 mikrolitre 5X numune tamponu ekleyin.
Vorteksleme ve pipetleme ile iyice karıştırdıktan sonra, karışımı etiketli temiz tüplere aktarın. Eşdeğer protein konsantrasyonuna sahip numuneleri hazırladıktan sonra, 400 milimolar DTT içeren taze 4X SDS jel yükleme tamponu ekleyin. Numuneleri 100 santigrat derecede beş dakika inkübe etmek için bir ısı bloğu kullanın.
Numuneleri vorteksleyin ve ardından oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika soğumaya bırakın. Oyuk başına 13 mikrolitre numune ve moleküler ağırlık merdivenini %10'luk bir poliakrilamid jel üzerine yükleyin. Elektroforez sisteminin pozitif ve negatif elektrotlarını bir güç kaynağına bağlayın ve ardından voltajı 20 dakika boyunca 70 volta ayarlayın.
Bundan sonra, 125 volta yükseltin ve numuneler ve protein merdiveni jelin sonuna ulaşana kadar jeli yaklaşık 70 ila 120 dakika çalıştırın. Jeli yaklaşık 100 dakika boyunca 100 voltta bir poliviniliden florür membranına aktarmak için ıslak elektroblotlama sistemini kullanın. Oda sıcaklığında 90 dakika boyunca% 4 sığır serum albümininde lekelenmek için zarı inkübe edin. Daha sonra, gece boyunca 4 santigrat derecede birincil antikor çözeltisi içinde inkübe edin.
Ertesi gün, lekeyi PBST ile dört kez yıkayın ve her yıkama yedi dakika sürer. Yıkanmış lekeyi oda sıcaklığında 90 dakika boyunca ilgili bir ikincil antikor çözeltisi içinde inkübe edin. Ardından, yıkamayı toplam dört kez tekrarlayarak yedi dakika boyunca PBST ile yıkayın. Bir kemilüminesans kiti kullanarak lekeyi geliştirin. Şeffaf plastik sargı ile örtün ve bir kemilüminesans görüntüleme sistemi kullanarak görüntüler elde edin.