JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 3:50 dk. • April 30th, 2023
- Dolaşımdaki Tümör Hücreleri veya CTC'ler, birincil tümörden kaynaklanan ve kan dolaşımına giren kanser hücreleridir. Çoğu CTC, yüzeye yapışmadan kan dolaşımında hayatta kalabilir; Bu nedenle, onları doğrudan çoğu kanser hastasının kanından tespit edebiliriz.
Kandaki CTC'ler, tümörün vücut içindeki yayılımını gösterebilir, bu nedenle bunları tanımlamak kanserin ilerlemesini anlamaya yardımcı olur. Anestezi uygulanmış bir kolorektal kanser fare modeli alarak başlayın ve kardiyak ponksiyon ile kan elde edin. Kanı, yoğunluk gradyan ortamı içeren konik bir tüpe aktarın ve kan bileşenlerini ayırmak için santrifüjleyin.
Plazma içeren en üst tabakayı atın ve arayüzde bulunan periferik kan mononükleer hücre fraksiyonunu veya PBMC'yi ayrı bir tüpte toplayın. Daha sonra, anti-EpCAM antikorunu PBMC hücrelerine ekleyin ve floresan mikroskobu altında gözlemleyin. Dolaşımdaki CTC'ler, Epitel Hücre Adezyon Molekülü veya EpCAM olarak bilinen bir hücre markörünü eksprese eder. Bu nedenle, anti-EpCAM antikorları, EpCAM pozitif CTC'lerin tanımlanmasına yardımcı olabilir.
CTC'leri toplayın ve daha fazla aşağı akış analizi için saklayın. Aşağıdaki protokolde, kolorektal kanserli fare modelinin kanının periferik mononükleer hücre fraksiyonundan EpCAM eksprese eden CTC'leri tanımlayacağız.
- Dolaşımdaki tümör hücrelerini uygun deneysel son noktada izole etmek için, 15 mililitrelik konik tüpleri tüp başına 5 mililitre yoğunluk gradyan ortamı ile doldurun ve tümör taşıyan hayvanlardan toplanan tam kan örneklerini yoğunluk gradyan katmanlarına dikkatlice aktarın.
Hücreleri santrifüjleme ile ayırın ve mononükleer hücreleri içeren arayüzü dikkatlice geri kazanın. Mononükleer hücreleri ikinci bir santrifüjleme için 15 mililitrelik yeni bir tüpe pipetleyin, ardından PBS'de iki yıkama yapın. İkinci yıkamadan sonra, peletleri EDTA ile desteklenmiş 200 mikrolitre PBS içinde yeniden süspanse edin ve karanlıkta buz üzerinde 20 dakikalık bir inkübasyon için her numuneye dört mikrolitre anti-EpCAM antikoru ekleyin.
Daha sonra, numune başına 6 santimetrelik steril bir Petri kabına yaklaşık 1 santimetrelik bir daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalem kullanın ve her daireye 700 mikrolitre toplama tamponu ekleyin, ardından 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Hücrelerin yoğunluğunu kontrol etmek için bir mikroskop kullanın ve numunelerin yaklaşık beş dakika çökmesine izin verin. Ardından, EpCAM pozitifliği için hücre damlasını tarayın ve ilgilenilen hücreleri, amaçlanan sonraki aşağı akış analizi için uygun tamponun 50 mikrolitresine aktarmak için mikromanipülatörü kullanın.