JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 3:53 dk. • April 30th, 2023
- Kolorektal kanserin 3D organotipik modelleri, in vivo tümör mikro ortamlarını taklit etmek için tasarlanmış in vitro kültürlerdir. Kültür genellikle, uygun bir hücre dışı matriks mikroortamında kolorektal kanser epitel hücreleri ile birlikte kültürlenmiş fibroblastlar gibi stromal hücreler içerir.
Yerleşik kültürlerde, metastatik potansiyele sahip tümör hücreleri hücre dışı matrisi istila eder. Bu istilacı hücreleri izole etmek için, önce hücreleri ve hücre dışı matrisi sabitlemek için organotipik modeli formaldehit ile tedavi edin. Numuneyi kurutmak için alkolle inkübe edin.
Ardından, bir doku bloğu oluşturmak için sıvı parafin mumuna gömün. İnce dilimlenmiş bölümler elde etmek için bir ultramikrotom kullanın. Bölümleri uygun bir cam kızak üzerine monte edin.
Bölümleri ayrıştırmak için Ksilen ekleyin. Sırayla, numuneleri yeniden sulandırmak için bölümleri azalan etanol konsantrasyonlarında inkübe edin.
Kolorektal kanser hücrelerini mikro ortamdan lekelemek ve ayırt etmek için Cresyl Violet ile tedavi edin. Vitray slaytı yüzü aşağı bakacak şekilde mikroskop tablasına yerleştirin. Uygun yazılımı kullanarak, mikrodiseke edilecek hücreleri tanımlayın ve sınırları belirleyin. Vurgulanan bölümü kesmek ve mikrodiseke edilmiş kısmı toplamak için lazeri ateşleyin.
Aşağıdaki protokolde, kolorektal kanser hücrelerinin lazer mikrodiseksiyon ile 3 boyutlu organotipik ko-kültür modelinden izolasyonunu göstereceğiz.
- Naylon levha da dahil olmak üzere tüm organopik tabakayı kuyudan çıkarın ve streç film üzerine yerleştirin. Organotipik ve naylon tabakayı temiz, tek kullanımlık bir neşter kullanarak ikiye bölün ve her iki yarıyı da oda sıcaklığında 24 saat formaldehit içinde sabitleyin. Formaldehiti 24 saat sonra %70 etanol ile değiştirin ve parafine gömmeden, kesit ayırmadan ve boyamadan önce gece boyunca bırakın.
Lazer mikrodiseksiyon yapmak için önce organotipik olanı 10 mikron kalınlığa kadar membrana monte slaytlar üzerine bölümlere ayırın. Bölümleri metin protokolünde açıklandığı gibi tedavi ettikten sonra, seçilen platformu kullanarak lazer mikrodiseksiyon yapmaya hazırlanın.
Mikrodiseke edilecek lekeli bölümü aşağı bakacak şekilde cam slaytı mikroskop tablasına yerleştirin. Toplama kasetine 0.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpü monte edin ve mikrodiseke dokunun toplanacağı kapağa 50 mikrolitre hücre lizis tamponu ekleyin. Doğrudan görüş altında, ilgilenilen dokuyu tanımlamak için joystick'i kullanın ve yazılım arayüzünü kullanarak, tümör istilası cephesinde mikrodiseke edilecek hücreleri vurgulayarak lekeli organik bölüme açıklama ekleyin.
Lazere, hem vurgulanan bölümü kesmeli hem de mikrodiseke edilmiş dokuyu mikrosantrifüj tüpünün kapağına itmelidir. İlgilenilen analiti çıkarmak için numuneleri uygun bir yöntemle işlemeye devam edin.