JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 3:25 dk. • April 30th, 2023
- Substrat morfolojisi, kanser hücrelerinin davranışını ve metastatik tepkilerini büyük ölçüde etkiler. Dinamik bir aktin hücre iskeleti ağı, hücrelere yapısal destek sağlar ve hücresel harekete aracılık eder. Fokal adezyonlar adı verilen büyük zarla ilişkili protein kompleksleri, hücre iskeletini hücre dışı matrise bağlayarak hücre yayılmasını kolaylaştırır.
Boyamaya başlamak için bir kanser hücre kültürü alın ve hücreleri sabitlemek ve geçirgen hale getirmek için paraformaldehit ile muamele edin. Şimdi, hücreleri arka plan lekelenmesini azaltmaya hazırlamak için proteinleri içeren bir sinyal arttırıcı reaktif ile inkübe edin. Fokal yapışma kompleksi içindeki proteinlerden biri olan vinculin'e bağlanan anti-vinkülin birincil antikorlarını ekleyin.
Daha sonra, numuneyi, birincil antikoru hedef alan bir floresan boya konjuge ikincil antikor ile inkübe edin. Son olarak, hücreleri, hücre iskeletinin aktin filamentlerine seçici olarak bağlanan floresan etiketli falloidin konjugatları ile tedavi edin. Floresan sinyallerini incelemek için hücreleri konfokal lazer tarama mikroskobu altında gözlemleyin.
İyi yayılmış morfolojiye sahip hücreler, tanımlanmış aktin lifleri sergiler ve farklı ve uzun vinkülin içeren fokal adezyonlar sunar. Tersine, zayıf yayılmış hücreler tanımlanmış aktin filamentlerine sahip değildir, ancak punktat vinkülin içeren fokal yapışmalar gösterir. Aşağıdaki protokolde, primer kolon kanseri hücrelerinde hücre iskeleti ve fokal adezyon organizasyonunu incelemek için bir immünofloresan testi göstereceğiz.
- İmmün boyalı olacak substratları laminer davlumbaza alın ve kültür ortamını çıkarın. Daha sonra, substratları fosfat tamponlu salin veya PBS ile durulayın ve hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS'de% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Alt tabakaları PBS ile toplam üç kez beş dakika yıkayın. Ardından, PBS ile durulamadan önce alt tabakaları 500 mikrolitre sinyal arttırıcı ile 30 dakika inkübe edin.
Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında 45 dakika boyunca PBS'de 1 ila 250 seyreltmede monoklonal anti-vinkülin antikoru ile inkübe edin. Ardından, alt tabakaları PBS ile toplam üç kez beş dakika yıkayın. Numuneleri ikincil bir antikor Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG ile PBS'de 1 ila 200 seyreltmede oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Ardından, alt tabakaları tekrar PBS ile beş dakika boyunca toplam üç kez yıkayın.
F-aktin yapısını görselleştirmek için, hücreleri oda sıcaklığında 45 dakika boyunca mililitre başına 50 mikrolitre konsantrasyonda tetrametironin-falloidin konjugatları ile inkübe edin. Ardından, alt tabakaları daha önce olduğu gibi tekrar yıkayın. Son olarak, konfokal taramalı bir lazer mikroskobu kullanarak numuneleri görüntülemeye devam edin.