JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 4:23 dk • April 30th, 2023
- Hareketsiz melanositlerin kök hücreleri, UV radyasyonuna veya saç epilasyonuna yanıt olarak aktive olur. Aktive edilmiş melanom kök hücreleri, bir tür cilt kanseri olan kutanöz melanoma yol açabilir. Melanomu incelemek için, sabitleme prosedürü sırasında DNA ve proteinlerin doğal yapılarını korumak için donmuş cilt dokusu blokları hazırlıyoruz.
Ötenazi uygulanmış bir melanom faresini cerrahi bir yatağa yerleştirerek başlayın ve kuyruğun üzerindeki cildin sırt bölgesindeki tüyleri alın. Cildi eksize edin ve bir filtre kağıdıyla kaplayın. Daha sonra, cilt dokusunu içeren filtre kağıdını istenen süre boyunca nötr tamponlu formaline batırın. Formalin cilt dokusuna nüfuz eder ve amino asitlere bağlanır, bu da proteinlerin çapraz bağlanmasına neden olur, bu nedenle doku fiksasyonuna yol açar.
Cilt dokusunu kağıttan çıkarın ve istenen boyutta parçalar elde etmek için dokuyu kesin. Şimdi, doku parçalarını OCT ortamı ile doldurulmuş bir kriyokalıba dikey olarak gömün ve kriyokalıpları kuru buz üzerine yerleştirin. OCT, donma sırasında katılaşan ve doku örneğinin etrafında onu yerinde tutan jelatinimsi bir tabaka oluşturan bir örnek matrisidir. Daha ileri histolojik analizler için donmuş blokları kullanın. Aşağıdaki protokolde, kutanöz melanomu incelemek için murin dorsal derisinden donmuş cilt dokusu blokları hazırlayacağız.
- Deri örneklerini izole etmek için, ötenazi uygulanmış ışınlanmış farelerin sırt derisi bölgesindeki tüyleri almak için elektrikli bir düzeltici kullanın ve alanı temizlemek için açıkta kalan cildi tüy bırakmayan bir dokuyla hafifçe fırçalayın. Kuyruğun tabanının hemen üzerinde keskin bir makasla küçük bir kesi yapın ve deri altı bağ dokularını ayırmak için kesiye büyük künt makas sokun. Keskin bir makas kullanarak, doku örneğini izole etmek için ilgilenilen cilt bölgesinin kenarı boyunca dikkatlice kesin ve eksize edilen cilt dokusunu temiz bir kağıt havlu üzerine yerleştirin.
Ardından, cildi havluya yapışacak ve gergin olacak şekilde germek için donuk forseps kullanın. Tüm numuneler hasat edildiğinde, cilt numunesini ve kağıt havlu sırtını, numunenin pürüzsüz olmasına ve katlanmamasına veya buruşmamasına dikkat ederek, kırışıklığın hemen yanındaki katlanmış bir filtre kağıdına yerleştirin. Filtre kağıdının kenarlarını zımba ile kapatın ve kağıdı kesin. Daha sonra, dokuları deiyonize suda iki adet 5 dakikalık yıkama ile yıkamadan önce numuneleri oda sıcaklığında 3 ila 5 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formaline tamamen batırın.
İkinci yıkamadan sonra, cilt dokularından kalan materyali dikkatlice çıkarın ve numunenin kenarlarını pürüzlü olmayacak şekilde düzeltin. Daha sonra, şeritlerin genişliği 5 milimetreden fazla olmayacak şekilde her numunede üç sagital kesim yapın ve numuneler 20 milimetreden daha geniş olmayacak şekilde enine kesimler yapın. Optimum kesme sıcaklığı veya OCT ortamı içeren bir kriyo kalıbı dikey yönde yerleştirin ve OCT'nin üzerine dört ila beş parça deri yerleştirin.
Tüm parçalar yerine oturduğunda, her bir deri parçasının uzun kenarını kriyokalıbın dibine getirmek için iki çift ince forseps kullanın, böylece numuneler OCT içinde dikey ve kalıbın tabanına dik olur. Daha sonra, kalıbı ikinci dudağa ek OCT ile doldurun ve kalıbı bir parça kuru buzun düz bir yüzeyine yerleştirin, blok gerektiği gibi donmaya başladığında aktarım sırasında kaymış olabilecek cilt parçalarını ayarlamak için forseps kullanın.