JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 6:00 dk. • April 30th, 2023
- HCR-FISH veya hibridizasyon zincir reaksiyonu-floresan in situ hibridizasyon, virüsle enfekte olmuş hücrelerin genomundaki viral nükleik asit dizilerini tespit eder. Başlamak için, virüsle enfekte olmuş hücrelerin yapışık bir kültürünü düzeltin ve hücre zarlarını geçirgen hale getirin. Herhangi bir arka plan sinyalini azaltmak için hücreleri bir hibridizasyon tamponu ile inkübe edin. Hücreleri, bir HCR başlatıcı dizisi ve viral DNA'yı hedefleyen tamamlayıcı bir dizi taşıyan başlatıcı problarla tedavi edin. Ev sahibi çift sarmallı DNA'yı tek sarmallı DNA'ya denatüre etmek için numuneyi ısıtın. Probun ücretsiz hedef viral DNA dizisine bağlanmasına izin vermek için numuneyi inkübe edin.
Daha sonra, H1 ve H2 olmak üzere iki set floresan etiketli oligonükleotid firkete probu içeren bir amplifikasyon tamponu ile muamele edin. Hibridizasyon zincir reaksiyonunu kolaylaştırmak için inkübe edin. Eşleşmemiş başlatıcı dizisi, tamamlayıcı H1 kuyruğuna bağlanarak saç tokası yapısını doğrusallaştırır. Açıkta kalan H1 dizisi benzer şekilde tamamlayıcı H2 kuyruğuna bağlanır. Takip eden H2, bir H1 kuyruğuna bağlanmaya devam eder. Bu şekilde, floresan etiketli problar hedef bölgenin etrafında genişleyerek güçlü bir sinyal yayar. Hücre çekirdeğini boyamak için numuneyi DAPI ile muamele edin.
Enfekte olmuş hücrelerin çekirdekleri içindeki replikasyon odaklarından gelen parlak floresansı tespit etmek için bir floresan mikroskobu kullanın. Aşağıdaki protokolde, enfekte olmuş birincil insan cilt hücrelerinde Merkel Hücre Polyomavirüs genomunu tespit etmek için yerinde HCR-DNA FISH'ı göstereceğiz.
- İlk olarak, hücreleri 10 dakika boyunca PBS'de% 4 PFA içeren kapak fişlerine sabitleyin. Daha sonra, kapak fişlerini PBS ile iki kez yıkayın ve hücrelere nüfuz etmek için gece boyunca 4 santigrat derecede% 70 etanol ile muamele edin. Ertesi gün, etanolü prob hidrasyon tamponu ile değiştirin ve numuneleri önceden hibritleştirmek için oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin. Ön hibridizasyon inkübasyonunun bitiminden 30 dakika önce, probları prob hibridizasyon çözeltisinde 1:500 seyreltmede seyreltin ve 45 santigrat derecede inkübe edin.
İnkübasyonlar tamamlandığında, her bir örtü kayması için seyreltilmiş prob karışımından yaklaşık 10 mikrolitre pipetleyin. Her bir kapak kızağını, hücre tarafı aşağı bakacak şekilde, ilgili hibridizasyon karışımı damlacığı üzerine yerleştirin. Bol miktarda kauçuk çimento kullanarak, her bir kapak kaymasının kenarlarını ve arkasını kızağına kadar kapatın. Slaytları bir ısı bloğunun düz tarafına yerleştirin ve 3 dakika boyunca 94 santigrat dereceye ısıtın. Bundan sonra, slaytları nemlendirilmiş bir odaya aktarın ve gece boyunca 45 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, kauçuk çimentoyu dikkatlice soymak için forseps kullanın. Kapak fişlerini, hücre tarafı yukarı bakacak şekilde 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin ve bunları oda sıcaklığında üç kez prob yıkama tamponu ile yıkayın. Her bir oyuğa bir kapak kayması içeren 200 mikrolitre amplifikasyon tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika inkübe edin. Bu arada, probları tanıyan iki etiketli oligonükleotid saç tokasının her birini, 90 saniye boyunca 95 santigrat dereceye ısıtarak ve ardından 30 dakika oda sıcaklığına soğutarak ayrı PCR tüplerinde tavlayın. Saç tokalarını amplifikasyon tamponunda 1:50 seyreltmede karıştırın.
Daha sonra, amplifikasyon reaksiyonu için bir yüzey oluşturmak üzere 12 oyuklu bir plaka kapağının açık yüzüne parafin filmi gerin. Her kapak fişi için 50 ila 100 mikrolitre saç tokası karışımından damlacıkları parafin filme pipetleyin. Forseps kullanarak, her bir kapak fişini ön amplifikasyon solüsyonundan dikkatlice çıkarın ve kuruması için kenarı gözenekli, tek kullanımlık bir mendille dokundurun. Her kurutulmuş kapak kızağını, hücre tarafı aşağı bakacak şekilde bir amplifikasyon damlacığı üzerine yerleştirin. Plaka kapağını nemlendirilmiş bir odaya aktarın ve gece boyunca oda sıcaklığında ve karanlıkta inkübe edin.
Ertesi gün, kapak fişlerini 24 oyuklu plakanın kuyularına geri koyun. Her bir oyuğa mililitre başına 0.5 mikrogram konsantrasyonda 5x SSCT içeren DAPI ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bundan sonra, numuneleri oda sıcaklığında 5x SSCT ile iki kez yıkayın. Yıkanmış kapak fişlerini mikroskop slaytlarına monte edin ve hücreleri analiz etmek ve numuneleri görüntülemek için ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanın.