Melanom Kök Hücre İzolasyonu: Manyetik Aktivasyonlu Hücre Sıralaması Kullanılarak CD133 Pozitif ve Negatif Melanom Hücreleri Elde Etmek İçin Bir Yöntem

- Melanom, hem kendini yenileme hem de tümör başlatma yeteneklerine sahip küçük bir kanser kök hücresi alt popülasyonunu barındırır. CD133 veya bir pentaspan transmembran glikoproteini olan Prominin-1, metastatik melanom kanseri kök hücreleri tarafından ifade edilen anahtar belirteçlerden biridir. CD133 pozitif hücreleri izole etmek için, uygun bir tamponda primer melanom hücrelerinin süspansiyonu ile başlayın.

Hücre yüzeyindeki spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke eden proteinler içeren bir bloke edici reaktif ile inkübe edin. Hücreleri biyotinile CD133 primer antikorları ile tedavi edin. Bu antikorlar, CD133 pozitif hücrelerde eksprese edilen CD133 antijenlerine bağlanır. Şimdi, süspansiyona anti-biyotin manyetik mikro boncuklar ekleyin. Mikroboncukların biyotin etiketli hücrelere bağlanması için kuluçkaya yatırın.

Son olarak, inkübe edilmiş süspansiyonu manyetik bir alana yerleştirilmiş bir kolondan geçirin. Manyetik etki ile, mikro boncuklarla etiketlenmiş tüm CD133 pozitif hücreler sütuna yapışırken, etiketlenmemiş hücreler geçer. Bu etiketlenmemiş CD133 negatif hücreleri toplayın. Sütunu manyetik alandan çıkarın. CD133 pozitif hücreleri elüte etmek ve toplamak için içeriği uygun bir tampon kullanarak yıkayın.

Aşağıdaki protokolde, tümör dokusundan elde edilen bir primer melanom kültüründen CD133 pozitif ve negatif kanser kök hücrelerinin izolasyonunu göstereceğiz. % 80 birleşik hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın. Uygun miktarda Accutase ekleyin ve hücreler kültür yüzeyinden ayrılana kadar inkübe edin. Hücreleri Quantum 263 ortamında toplayın ve 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Hücreleri numaralandırın. Ardından, gerekli sayıda hücreyi 300 x g ve 4 ila 8 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen aspire edin ve 350 mikrolitre MACS tamponunda sekizinci hücrelere 1 kez 10'a kadar yeniden süspanse edin. 100 mikrolitre FcR Bloke Edici Reaktif ve 50 mikrolitre CD133 / 1-Biotin ekleyin. İyice karıştırın ve 4 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.

Hücreleri 10 mililitre MACS tamponu ile yıkayın, ardından 300 x g ve 4 ila 8 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen aspire edin. İkinci bir yıkamadan sonra, hücre peletini 400 mikrolitre MACS tamponunda yeniden süspanse edin. 100 mikrolitre anti-biyotin mikro boncuk ekleyin ve iyice karıştırın. 4 ila 8 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Bu arada, MACS ayırıcıyı manyetik ayırmaya hazırlamak için QuadroMACS'i MACS Ayırıcı Çoklu Standına takın. QuadroMACS'in manyetik alanında gerekli sayıda LS Sütununu sütun kanatları ile öne yerleştirin. Her LS Sütununa bir Ön Ayırma Filtresi ve her sütunun altına uygun bir toplama tüpü yerleştirin.

Filtreyi ve sütunu 3 mililitre MACS tamponu ile durulayın ve akışı atın. Hücreleri daha önce tarif edildiği gibi MACS tamponunda yıkadıktan sonra, hücreleri 500 mikrolitre MACS tamponunda yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu hazırlanan LS Sütununa uygulayın. Sütun başına 3 mililitre MACS tamponu ile üç kez yıkayın. Etiketlenmemiş CD133-negatif hücre fraksiyonunun toplam atık suyunu toplayın.

Ardından, Ön Ayırma Filtresini atın, sütunu ayırıcıdan çıkarın ve uygun bir toplama tüpüne yerleştirin. 5 mililitre MACS tamponu uygulayın. Pistonu kolona sıkıca iterek etiketli CD133 pozitif hücreleri hemen yıkayın. Negatif fraksiyonun saflığını arttırmak için, hücre süspansiyonunu yeni bir dengelenmiş LS Sütununa uygulayın ve atık CD133-negatif fraksiyonu toplayın.

• Melanoma - A type of skin cancer with self-renewing tumor initiation capabilities.
• CD133 - A marker in metastatic melanoma stem cells that enables their isolation.
• MACS Separator - A device used for magnetic cell sorting isolation.
• Quantum 263 medium - A culture medium used for melanoma cell cultivation.
• Anti-Biotin Microbeads - Tiny magnetic particles used to label cells for isolation.

• Understanding Melanoma - It's a skin cancer with self-renewable tumor cells (e.g., MACS separator).
• Principles of Magnetic Cell Sorting - The process of sorting cells based on their magnetic properties (e.g., CD133).
• Role of Microbeads - They assist in segregating cells during magnetic isolation (e.g., Anti-Biotin Microbeads).
• Isolation of CD133 - The melanoma stem cells are differentiated using MACS separator.

• [Question 1] What is melanoma and how is it connected to CD133 stem cells?
• [Question 2] What role does a MACS separator play in cell isolation?
• [Question 3] How are Anti-Biotin Microbeads used in the magnetic cell isolation process?

• Cell Isolation Techniques - Understanding melanoma therapy (e.g., MACS Separator).
• Medical Industry Impact - Improved cancer treatment methodologies (e.g., CD133).
• Scientific Progression - Better understanding of stem cells can lead to medical advancements.
• Research Developments - Isolation techniques pave way for newer studies.