Melanomda hedef doğrulama için CD133-pozitif hücrelerin izole edilmesi neden önemlidir?

CD133-pozitif hücrelerin izole edilmesi, melanomda kanser kök hücre hedeflerinin doğrulanması için kritik olan tümörijenik ve kendi kendini yenileme kapasitelerinin fonksiyonel testlerine olanak tanır. Bu saflaştırma işlemi, kök hücre olmayan hücrelerden kaynaklanan gürültüyü azaltarak hedef bağımlılık analizlerindeki güvenilirliği artırır. Bu yöntem, CD133 ekspresyonunu tümör başlatma potansiyeli ile ilişkilendirerek mekanistik risk azaltma sürecini destekler.

Manyetik aktivasyonlu hücre ayıklama, kök hücre araştırmalarında bağımsız değişkenlerin izole edilmesini nasıl sağlar?

Manyetik aktive hücre ayıklama, yalnızca hedef popülasyonu biotinize antikorlar ve mikroboncuklarla işaretleyerek CD133-pozitif ve negatif fraksiyonları izole eder ve böylece tanımlanmış deneysel gruplar oluşturur. Bağımsız değişkenin (CD133 durumu) bu şekilde izole edilmesi, araştırmacıların fonksiyonel farklılıkları spesifik olarak kök hücre zenginleştirmesine atfetmelerine olanak tanır. Bu teknik, analizlerde gözlemlenen fenotiplerin karma popülasyonlardan ziyade izole edilen değişkene bağlı olmasını sağlar.CD133 ile tanımlanmış melanoma fraksiyonlarının izole edilmesiyle hangi kantitatif bağımlı değişken ölçümleri gerçekleştirilebilir?

CD133 ile tanımlanmış melanoma fraksiyonlarının izole edilmesiyle hangi kantitatif bağımlı değişken ölçümleri gerçekleştirilebilir?

İzole edilen fraksiyonlar, küre oluşturma verimliliği, in vivo tümör başlatma frekansı ve diferansiyel ilaç yanıt oranları gibi kantitatif ölçümlere olanak tanır. Bu bağımlı değişkenler, CD133-pozitif ve negatif hücreler arasındaki kök hücrelik ilişkili fenotipleri karşılaştırmak için sayısal veriler sağlar. Yöntem, deneysel koşullar genelinde kök hücre frekansının ve fonksiyonel potansiyelin istatistiksel analizini desteklemektedir.

Güvenilir CD133-pozitif ve negatif melanoma hücrelerini izole etmek için replikasyon gereksinimleri neden önemlidir?

Tekrarlanabilirlik, izolasyonun deneyler boyunca CD133 ile tanımlanan fraksiyonlarda tutarlı saflık ve canlılık sağladığını garanti eder; bu durum, tekrarlanabilir fonksiyonel analizler için gereklidir. Ayırma verimliliğindeki değişkenlikler, kök hücre ve kök hücre dışı popülasyonlar arasındaki karşılaştırmaları karmaşıklaştırarak hedef doğrulama çalışmalarını zayıflatabilir. Tekrarlı çalışmalar içeren standartlaştırılmış protokoller, endüstriyel ortamlarda saflık ve geri kazanım için güçlü eşik değerlerin belirlenmesine yardımcı olur.

Melanom kök hücre iş akışlarında CD133 izolasyonu uygulanmadan önce hangi istatistiksel analiz yetkinlikleri gereklidir?

Uygulama, ayrıştırma verimliliğini değerlendirmek için akış sitometrisi veya benzeri yöntemlerle saflık ve verimi miktarsal olarak belirleme kapasitesi gerektirir. İzole edilen fraksiyonlar arasında fonksiyonel analizlerin (örneğin, tümör oluşumu, proliferasyon) istatistiksel karşılaştırması, anlamlılık ve etki boyutunu hesaplamak için uygun araçlar gerektirir. Tekrarlanan verileri analiz etmek için yazılımlara erişim, kök hücre fenotiplerinde gözlenen farklılıkların istatistiksel olarak geçerli olduğunu ve izolasyon değişkenliğinden kaynaklanmadığını sağlar.

Melanom Kök Hücre İzolasyonu: Manyetik Aktivasyonlu Hücre Sıralaması Kullanılarak CD133 Pozitif ve Negatif Melanom Hücreleri Elde Etmek İçin Bir Yöntem

JoVE Encyclopedia of Experiments

Kanser Araştırmaları

0 görüntüleme • 5:40 dk • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- Melanom, hem kendini yenileme hem de tümör başlatma yeteneklerine sahip küçük bir kanser kök hücresi alt popülasyonunu barındırır. CD133 veya bir pentaspan transmembran glikoproteini olan Prominin-1, metastatik melanom kanseri kök hücreleri tarafından ifade edilen anahtar belirteçlerden biridir. CD133 pozitif hücreleri izole etmek için, uygun bir tamponda primer melanom hücrelerinin süspansiyonu ile başlayın.

Hücre yüzeyindeki spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke eden proteinler içeren bir bloke edici reaktif ile inkübe edin. Hücreleri biyotinile CD133 primer antikorları ile tedavi edin. Bu antikorlar, CD133 pozitif hücrelerde eksprese edilen CD133 antijenlerine bağlanır. Şimdi, süspansiyona anti-biyotin manyetik mikro boncuklar ekleyin. Mikroboncukların biyotin etiketli hücrelere bağlanması için kuluçkaya yatırın.

Son olarak, inkübe edilmiş süspansiyonu manyetik bir alana yerleştirilmiş bir kolondan geçirin. Manyetik etki ile, mikro boncuklarla etiketlenmiş tüm CD133 pozitif hücreler sütuna yapışırken, etiketlenmemiş hücreler geçer. Bu etiketlenmemiş CD133 negatif hücreleri toplayın. Sütunu manyetik alandan çıkarın. CD133 pozitif hücreleri elüte etmek ve toplamak için içeriği uygun bir tampon kullanarak yıkayın.

Aşağıdaki protokolde, tümör dokusundan elde edilen bir primer melanom kültüründen CD133 pozitif ve negatif kanser kök hücrelerinin izolasyonunu göstereceğiz. % 80 birleşik hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın. Uygun miktarda Accutase ekleyin ve hücreler kültür yüzeyinden ayrılana kadar inkübe edin. Hücreleri Quantum 263 ortamında toplayın ve 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Hücreleri numaralandırın. Ardından, gerekli sayıda hücreyi 300 x g ve 4 ila 8 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen aspire edin ve 350 mikrolitre MACS tamponunda sekizinci hücrelere 1 kez 10'a kadar yeniden süspanse edin. 100 mikrolitre FcR Bloke Edici Reaktif ve 50 mikrolitre CD133 / 1-Biotin ekleyin. İyice karıştırın ve 4 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.

Hücreleri 10 mililitre MACS tamponu ile yıkayın, ardından 300 x g ve 4 ila 8 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen aspire edin. İkinci bir yıkamadan sonra, hücre peletini 400 mikrolitre MACS tamponunda yeniden süspanse edin. 100 mikrolitre anti-biyotin mikro boncuk ekleyin ve iyice karıştırın. 4 ila 8 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Bu arada, MACS ayırıcıyı manyetik ayırmaya hazırlamak için QuadroMACS'i MACS Ayırıcı Çoklu Standına takın. QuadroMACS'in manyetik alanında gerekli sayıda LS Sütununu sütun kanatları ile öne yerleştirin. Her LS Sütununa bir Ön Ayırma Filtresi ve her sütunun altına uygun bir toplama tüpü yerleştirin.

Filtreyi ve sütunu 3 mililitre MACS tamponu ile durulayın ve akışı atın. Hücreleri daha önce tarif edildiği gibi MACS tamponunda yıkadıktan sonra, hücreleri 500 mikrolitre MACS tamponunda yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu hazırlanan LS Sütununa uygulayın. Sütun başına 3 mililitre MACS tamponu ile üç kez yıkayın. Etiketlenmemiş CD133-negatif hücre fraksiyonunun toplam atık suyunu toplayın.

Ardından, Ön Ayırma Filtresini atın, sütunu ayırıcıdan çıkarın ve uygun bir toplama tüpüne yerleştirin. 5 mililitre MACS tamponu uygulayın. Pistonu kolona sıkıca iterek etiketli CD133 pozitif hücreleri hemen yıkayın. Negatif fraksiyonun saflığını arttırmak için, hücre süspansiyonunu yeni bir dengelenmiş LS Sütununa uygulayın ve atık CD133-negatif fraksiyonu toplayın.