Primer Murin Melanositlerinin ve Fibroblastlarının Hızlı Kültürlenmesi: Tüm Murin Deri Örneğinden Melanositlerin ve Fibroblastların İzole Edilmesi

- Cilt, farklı katmanlarını dolduran çeşitli hücrelerden oluşur. Melanin üreten hücreler olan melanositler, epidermal-dermal bileşkede lokalize olurken, bağ dokusu üreten hücreler olan fibroblastlar dermiste bulunur.

Melanositleri ve fibroblastları hızlı bir şekilde izole etmek için, ötenazi yapılmış bir fare yavrusunun gövdesini alarak başlayın. Cildi gövdenin uzunluğu boyunca ventral olarak kesin. Epidermal ve dermal tabakayı içeren cildi soyun ve dokuyu küçük parçalar halinde kıyın.

Şimdi, hücre dışı matrisi bozan ve hücreleri süspansiyona bırakan tripsin ve kollajenaz enzimleri içeren bir sindirim tamponu ile tedavi edin. Hücreleri peletlemek ve süpernatanı atmak için santrifüjleyin. Melanosit ortamındaki hücreleri yeniden süspanse edin ve süspansiyonu çok kuyulu bir plakaya aktarın.

Kültür sırasında, fibroblastların çoğu kuyu dibine yapışırken, melanositler ve diğer epidermal hücreler süspansiyon halinde kalır. Askıda kalan hücreleri aspire edin ve büyümelerini teşvik etmek için fibroblast kültürüne fibroblast spesifik ortam ekleyin. Yapışkan bir kültürün oluşumuna yardımcı olmak için aspire edilmiş süspansiyonu taze kollajen kaplı bir kuyuya aktarın.

Bir antibiyotik olan geneticin ile takviye edin ve taze melanosit büyüme ortamı ekleyin. Geneticin, kalan fibroblastları seçici olarak ortadan kaldırırken, ortam melanositlerin diğer epidermal hücre tiplerine göre büyümesini destekler. Aşağıdaki protokolde, murin yavrusu derisinden melanositleri ve fibroblastları izole edeceğiz.

- Laminer akış kabininde, ötenazi yapılmış her farenin gövdesini% 70 etanol içeren steril bir Petri kabında kısaca yuvarlayın. Fareyi etanolden çıkarın ve boş, steril bir Petri kabına koyun. Ardından, cerrahi makasları% 70 etanol içinde sterilize edin. Gövdenin ventral tarafındaki deride, boyundan başlayıp kuyruğa kadar devam eden bir kesi yapmak için bu makası kullanın. Steril forseps kullanarak, cildi farenin gövdesinden soyun ve cildin dermal tarafındaki fazla yağ dokusunu alın.

Cildi, dermis tarafı aşağı bakacak şekilde, 3 mililitre 1x antibiyotik/antimikotik solüsyon içeren 6 oyuklu bir tabağa yerleştirin. Oda sıcaklığında 2 ila 3 dakika inkübe edin. Ardından, doku doğrayıcıyı açın ve ayarları burada gösterilenlere göre ayarlayın.

- Kağıt mendil doğrayıcı bıçağını takarken ve makineyi çalıştırırken dikkatli olun.

- Cildi dermis tarafı aşağı bakacak şekilde steril bir doku doğrayıcı kabına aktarın ve cildi üç kez doku doğrayıcıdan tamamen geçirin. Bundan sonra, homojenize edilmiş cildi 3 mililitre cilt sindirim tamponu içeren steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Bir P1000 mikropipet kullanarak, elde edilen süspansiyonu on ila on beş kez kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Konik tüpü kapatın ve numuneyi 37 santigrat derecede bir su banyosunda 15 dakika inkübe edin, tüpü her 3 ila 5 dakikada bir ters çevirdiğinizden emin olun.

Daha sonra, cilt homojenasyonundaki hücreleri peletlemek için tüpü sallanan bir kova rotorunda oda sıcaklığında 750 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Cilt sindirim tamponunu yavaşça ve tamamen çıkarmak için bir P1000 mikropipet kullanın ve peleti rahatsız etmemeye dikkat edin.

- Tüm cilt sindirim tamponunu aspire ettiğinizden emin olun. Sorun yaşıyorsanız, hücre peletini 2 ila 3 mililitre melanosit ortamı ile yıkayın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın ve fazla cilt sindirim tamponunu çıkarın.

- Ardından, bir P1000 pipeti ile on beş ila yirmi kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini 1 mililitre melanosit ortamında iyice yeniden süspanse edin. Elde edilen hücre çözeltisini, 1 mililitre melanosit ortamı içeren 6 oyuklu bir tabakta kaplanmamış bir kuyucuğa damla damla aktarın. Kaplanmış cilt homojenatını 37 santigrat derecede bir doku kültürü inkübatöründe% 5 karbondioksit ile 40 dakika inkübe edin.

Bundan sonra, kültür süpernatantını kaplanmamış tabaktan önceden yıkanmış kollajen kaplı 6 oyuklu bir tabağın bir kuyusuna aktarın. G418'i, nihai konsantrasyon mililitre başına 100 nanogram olacak şekilde ortama ekleyin. Şimdi yapışkan fibroblastlar içeren kaplanmamış kabın bir kuyucuğuna 2 mililitre fibroblast ortamı ekleyin. Her iki kültürü de gece boyunca 37 santigrat derecede %5 karbondioksit içeren bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin.

16 ila 24 saatlik inkübasyondan sonra, ortamı ve her kültürden herhangi bir kalıntıyı ayrı ayrı aspire edin. Her yıkama için 1 mililitre PBS kullanarak her kabı iki kez yıkayın. Daha sonra melanosit kültürüne 2 mililitre taze melanosit besiyeri ekleyin ve fibroblast kültürüne 2 mililitre taze fibroblast besiyeri ekleyin.