Rekombinant Merkel Hücreli Polyomavirüs (MCPyV) Virion Hazırlığı: Yüksek Titreli Rekombinant MCPyV Virion Üretmek İçin Bir Teknik

- Merkel hücreli polyomavirüs veya MCPyV, bir tür cilt kanseri olan merkel hücreli karsinomuna neden olan dairesel bir genoma sahip çift sarmallı bir DNA onkovirüsüdür. MCPyV virionlarını hazırlamak için, önce yapışık bir paketleme hücresi kültürünü, bir transfeksiyon ajanı, viral genom ve viral replikasyonu teşvik etmek için gerekli proteinleri kodlayan iki ekspresyon plazmidi içeren bir kokteyl ile muamele edin.

İnkübasyon sırasında, transfeksiyon reaktifi, plazmitlerle lipopleksler oluşturur ve bunların paketleme hücrelerine verilmesini kolaylaştırır. Çekirdeğin içine girdikten sonra, hücre mekanizması viral ve plazmit genomlarının ekspresyonuna izin verir. Plazmitler ekspresyonu, büyük tümör antijenini ve küçük tümör antijen proteinlerini kodlar. Bu proteinler çekirdeğe yer değiştirir ve viral DNA replikasyonunu yönlendirir. Daha sonra, viral genom yapısal kapsid proteinlerini kodlar. Bu proteinler çekirdeğe hareket eder ve rekombinant virionların toplanmasına yardımcı olur.

Ardından, kültürlenmiş hücreleri hasat edin. Onlara deterjan ve DNaz içeren bir çözelti uygulayın. Deterjan, virüsleri serbest bırakmak için hücreleri parçalar. DNaz, süspansiyondan herhangi bir serbest plazmit DNA'sını bozar. Peletteki hücresel kalıntıları ayırmak için santrifüjleyin. Virüs içeren süpernatanı, uygun bir yoğunluk gradyan ortamı taşıyan bir tüpe yükleyin. Gradyan ortamı içinde konsantre virion açısından zengin fraksiyonlar elde etmek için santrifüjleyin.

Aşağıdaki protokolde, 293TT hücreleri kullanılarak yüksek titreli rekombinant MCPyV viryonlarının hazırlanmasını göstereceğiz.

- Öğleden sonra veya akşam geç saatlerde, 6 milyon 293TT-28 hücreyi, takviye edilmiş DMEM ortamı içeren 10 santimetrelik bir tabağa tohumlayın. % 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, hücrelerin yaklaşık% 50 oranında birleştiğinden emin olun. Daha sonra, hücreleri 66 mikrolitre transfeksiyon reaktifi, 12 mikrogram yeniden bağlanmış MCPyV izolatı R17b DNA, 8.4 mikrogram ST ekspresyon plazmidi pMtB ve 9.6 mikrogram LT ekspresyon plazmidi pADL ile transfekte edin. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin.

Ertesi gün, transfekte edilen hücreler neredeyse birleştiğinde, hücreleri tripsinize edin ve genişlemeye devam etmek için bunları 15 santimetrelik bir tabağa aktarın. Bu çanak neredeyse birleştiğinde, hücreleri üç yeni 15 santimetrelik tabağa aktarın. Bu yeni yemekler neredeyse birleştiğinde, hücreleri metin protokolünde belirtildiği gibi hasat edin. Oda sıcaklığında 180 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı çıkarın ve 1 hücre hacmi DPBS-Mg ekleyin.

25 mikromolar amonyum sülfat, ardından %0.5 Triton X-100, %0.1 Benzonaz ve %0.1 ATP'ye bağımlı DNaz ekleyin. İyice karıştırın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, karışımı 15 dakika buz üzerinde soğutun. Ardından, 0.17 hacim sodyum klorür ekleyin. Karıştırın ve 15 dakika daha buz üzerinde inkübe edin. 12000 x g'da 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatan net değilse, tüpü yavaşça ters çevirin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.

Bundan sonra, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Pelet, 0.8 mol sodyum klorür ile desteklenmiş bir hacim DBPS'de yeniden süspanse edin. 12000 x g'da 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatan net değilse, tüpü yavaşça ters çevirin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. İki süpernatanı birleştirin ve 12000 x g'de 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.

Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi ince duvarlı 5 mililitrelik poliallomer tüplere iyodiksonal gradyanlarını biriktirmek için bir pipet kullanın. Hazırlanan iyodiksonal gradyanın üzerine 3 mililitre arıtılmış, virüs içeren süpernatan yükleyin. SW55ti rotor ile 234.000 x g'da ve 16 santigrat derecede 3,5 saat boyunca santrifüjleyin, hızlanma ve yavaşlamayı yavaşlattığınızdan emin olun. Ultrasantrifüjleme tamamlandıktan sonra, silikonlu tüplerde 12 fraksiyon toplayın.