JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 4:07 dk. • April 30th, 2023
- Keratinositler, epidermiste veya cildin en dış tabakasında bulunan belirgin hücre tipidir. Keratinositleri genetik olarak değiştirmek için, retroviral paketleme anka kuşu hücrelerinin bir kültürüyle başlayın. Daha sonra, ilgilenilen geni taşıyan retroviral vektörler ve bir transfeksiyon reaktifi içeren bir karışım ekleyin. Plakayı istenen süre boyunca inkübe edin.
Transfeksiyon reaktifi, viral genetik materyalin ambalaj hücrelerine verilmesini kolaylaştırır. Bu özel olarak tasarlanmış hücreler, retroviral kapsid üretimi için gerekli proteinleri kodlar ve ilgilenilen geni taşıyan retroviral vektör RNA'nın paketlenmesini teşvik eder. Paketlendikten sonra, olgun virüsler hücrelerden ortama çıkar. Şimdi, virüsle süspanse edilmiş ortamı birincil keratinositler içeren taze bir kültür kabına aktarın. Kültürü istenen bir katyonik polimer çözeltisi ile arttırın.
Katyonik polimer, viral ve keratinosit zarları üzerindeki negatif yükleri nötralize ederek hücre yüzeyi ile viral füzyonun verimliliğini arttırır. Füzyon üzerine virüs, RNA'sını hücre sitoplazmasına bırakır ve bu da çift sarmallı DNA'ya ters kopyalanır. Bu viral DNA çekirdeğe girer ve keratinosit genomu ile bütünleşerek genetik değişikliklere yol açar. Aşağıdaki protokolde, retroviral transfeksiyon kullanılarak primer insan keratinositlerinin genetik modifikasyonunu göstereceğiz.
- Transfeksiyondan bir gün önce, anka kuşu hücrelerini tam ortamda, kuyu başına 800.000 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu bir plakaya tohumlayın. Transfeksiyon gününde, transfekte edilecek her bir kuyucuk için 6 mikrolitre transfeksiyon reaktifini 100 mikrolitre DMEM ile karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Karışımı, transfekte edilecek her bir kuyucuk için 3 mikrogram retroviral vektör içeren bir tüpe ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bu karışımın tamamını anka kuşu hücrelerinin her bir oyuğuna damla damla ekleyin ve hücreleri gece boyunca inkübe edin.
Transfeksiyondan bir gün sonra, ortamı anka kuşu hücrelerinden çıkarın ve 2 mililitre taze tam ortam ekleyin. Aynı gün, primer insan keratinositlerini keratinosit serumu serbest ortamda antibiyotiklerle yeniden süspanse edin ve oyuk başına 75.000 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu plakalara tohumlayın.
Ertesi gün, şimdi transfekte edilmiş anka kuşu hücrelerinden viral parçacıklar içeren ortamı hasat edin. Kirletici hücreleri çıkarmak için ortamı bir şırınga kullanarak 0,45 mikronluk filtreden geçirin. Enfeksiyon sürecine aracılık etmeye yardımcı olmak için filtrelenmiş virüs içeren ortama mililitre başına 5 mikrogram heksadimetrihrin bromür ekleyin.
Daha sonra, 2 mililitre virüsü önceki gün kaplanmış keratinositlerin üzerine pipetleyin. Daha sonra, 6 oyuklu plakaları oda sıcaklığında 1 saat boyunca 200 x g'da bir santrifüjde döndürün. Döndürme işleminden sonra, virüs içeren ortamı çıkarın ve atın. Hücreleri 1x PBS ile bir kez yıkayın ve ardından taze KCSFM ekleyin. Ertesi gün, az önce gösterilen prosedürü kullanarak aynı keratinosit grubunu virüsle enfekte edin.