Keratinosit Koloni Oluşum Deneyi: Keratinositlerin Kolonilere Dönüşme Yeteneğini Değerlendirmek İçin Bir İn Vitro Test

- Koloni oluşumu testi, tek tek hücrelerin çoğalma ve koloniler oluşturma yeteneğini belirler. Bir kültür plakasında eksize edilmiş bir fare sırtı derisi ile başlayın. Deri altı dokusunu ve yağı derinin ventral tarafından kazıyın. Dokuyu bir sindirim çözeltisi ile tedavi edin. Çözeltideki proteolitik enzimler, hücre dışı matrisi bozarak epidermal hücre ayrışmasına neden olur.

Ayrışan hücreleri ve kılları bir hasat ortamına bırakmak için epidermal tabakayı nazikçe kazıyın. Kılları veya herhangi bir kalıntıyı yakalamak ve epidermal hücrelerin tek hücreli bir süspansiyonunu elde etmek için süspansiyonu uygun bir süzgeçten süzün. Bu hücre süspansiyonunun istenen hacmini, büyümeyi durduran besleyici hücrelerin yapışkan bir tabakası içeren kollajen kaplı bir plakaya aktarın. Keratinosit sağkalımını destekleyen uygun bir besiyeri ile takviye edin.

Kültür sırasında, keratinositler besleyici tabakaya yapışır. Ek olarak, bu besleyici hücreler büyüme faktörleri salgılar ve keratinositlerin büyümesini destekleyen hücre dışı matris proteinlerini sentezler. Bireysel keratinositlerin çoğalma yeteneğine bağlı olarak, koloniler oluşturmaya başlarlar. Ortamı çıkarın ve kolonileri sabitleyin. Sayılacak kolonileri tespit etmek için hücreleri uygun bir boya ile boyayın. Aşağıdaki protokolde, test bileşikleri ile tedaviyi takiben yetişkin farelerden hasat edilen primer keratinositlerin klonojenik testini gerçekleştireceğiz.

- Ötenazi uygulanmış yetişkin farelerden dorsal deri örnekleri alındıktan sonra, otoklavlanmış forseps ve bir neşter kullanarak her seferinde bir sırt derisini tüylü tarafı aşağı bakacak şekilde ince bir Petri kabına yerleştirin ve deri altı dokusunu kazıyın, doku yarı saydam olana kadar cilt dokusunun ventral tarafındaki yağ dahil.

Bu kazınmış deriyi, kalan diğer tüm deriler işlenene kadar PBS'ye yerleştirin. Ardından, cilt örneklerini 0,5 x 1 ila 1,5 santimetrelik şeritler halinde dilimlemek için bir neşter kullanın. Numuneleri 20 mililitrelik bir PBS artı %0.25 Tripsin ile desteklenmiş 2x Gentamisin çözeltisinin yüzeyinde 32 santigrat derecede 2 saat boyunca plastik 100 x 20 milimetre Petri kabında yüzmeden önce şeritleri tüylü tarafı yukarı bakacak şekilde steril bir Petri kabına yerleştirin.

Kuluçka işleminin sonunda, 30 derecelik bir eğimle 15 mililitre hasat ortamı içeren steril bir plastik kare Petri kabı yerleştirin ve yüzen bir deri şeridini tabağa dikkatlice aktarmak için kavisli forseps kullanın. Yeni bir neşter bıçağını cilde dik bir açıyla tutarak ve yeterli fakat aşırı olmayan bir kuvvet kullanarak, epidermisi ve tüyleri numuneden ortama kazıyın.

Tüm şeritler kazındığında, epidermal hücre içeren süpernatanı 1,5 inçlik bir manyetik karıştırma çubuğu içeren steril 60 mililitrelik bir kavanoza dikkatlice boşaltın ve kalan epidermal hücreleri toplamak için Petri kabını ek hasat ortamı ile durulayın.

Kavanozdaki son hacmi taze ortamla 30 mililitreye getirin ve epidermal hücre çözeltisini oda sıcaklığında 20 dakika boyunca dakikada 100 dönüşte karıştırın. Karıştırma inkübasyonunun sonunda, bir biyogüvenlik kabininde, karıştırma çubuğunu çıkarın ve hücre çözeltisini 70 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün.

Sıkışan saç hücrelerini serbest bırakmak için dokuyu manipüle etmek için kılları ve stratum corneum materyallerini süzgeçten geçirmek için forseps ve ardından bir pipet kullanın ve kalan sıkışmış saç hücrelerini tüpe bırakmak için ek 5 mililitre toplama ortamı kullanın.

- Epidermal hücrelerin ve kılların, hücreleri saç foliküllerinden serbest bırakacak şekilde manipüle edilmesi çok önemlidir.

- Tüpteki toplam hacmi taze ortamla 50 mililitreye getirin ve hücre süzüntüsünü santrifüjleme ile toplayın. Peletleri 5 mililitre taze hasat ortamında ve 5 mililitrelik bir pipetle yaklaşık 20 öğütmede yeniden süspanse edin. 1:20 seyreltmenin 0,5 mililitresini alın ve 2 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne aktarın.

Numuneyi dikkatlice karıştırdıktan sonra, mikrofüj tüpünden 200 mikrolitre alın ve eşit hacimde %0,4 Tripan Mavisi çözeltisi ile hafifçe karıştırın. Bu çözeltiyi üç kez yavaşça karıştırın ve hücreleri çekirdekli keratinositleri saymak için bir hematitometreye aktarın.

Tüm koyu mavi hücreleri canlı olmayan hücreler olarak puanlayın ve küçük altın pembemsi hücreleri canlı hücreler olarak puanlayın. Canlılık ortalaması yaklaşık% 80'dir ve fare başına nihai keratinosit verimi yaklaşık 30 milyon canlı hücre olmalıdır. Saydıktan sonra, hücreleri başka bir santrifüjleme ile toplayın ve kitle kültürü için, 2 mililitre hücre kültürü ortamında 35 milimetre Petri kabı başına 2 ila 4 kez 10 ila altıncı canlı keratinositleri yeniden süspanse edin.

Klonojenik bir koloni oluşumu testi için, hücreleri, X-ışını ışınlanmış İsviçre faresi 3T3 besleyici katmanları üzerinde kollajen kaplı 60 milimetre Petri kabı başına takviyeler ve serum konsantrasyonu ile 4 mililitre modifiye William's E Ortamı başına 1 kez 10 ila üçüncü keratinosit olarak yeniden süspanse edin.

Kitle kültürü için, kültürleri uygun hücre kültürü periyodu için% 5 karbondioksit içinde 32 santigrat derecede büyütün, ortamı kitle kültürü için ilk tohumlamadan 24 saat sonra ve daha sonra haftada 3 kez değiştirin.

Klonal kültürün sonunda, ortamı aspire edin ve kolonileri gece boyunca oda sıcaklığında% 10 tamponlu formalin içinde sabitleyin. Ertesi sabah, su berraklaşana kadar bulaşıkları soğuk otoklavlanmış suda durulamadan önce kolonileri otoklavlanmış suda bir saat boyunca %0,5 Rhodamine B ile boyayın. Ardından, kolonileri saymadan önce bulaşıkları kuruması için kapaklarına eğin.