Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
- Zebra balığında melanom, melanin üreten hücreler olan melanositlerin kötü huylu dönüşümünden kaynaklanır. Melanom başlangıcını incelemek için, melanoma eğilimli, melanosit eksikliği olan bir transgenik zebra balığı modeli kullanın. Bu model, melanosit spesifik mitfa promotöründeki fonksiyon kaybı mutasyonu nedeniyle melanositlerden yoksundur.
Bu transgenik modelin tek hücreli bir embriyosunu bir agar plakası üzerinde alarak başlayın. Transpozon bazlı bir miniCoopR vektörü ve transpozaz enzimi mRNA'ları içeren bir karışımı embriyoya birlikte enjekte edin. Vektör, iki transpozon elemanı arasına sıkıştırılmış bir aday gene bağlı promotör taşıyan bir mitfa mini geni içeren bir gen kaseti içerir.
Birlikte enjekte edilen mRNA'lar, transpozaz proteinlerini kodlar. Bu proteinler transpozon elementleri üzerinde etki eder ve miniCoopR vektöründen kaset eksizyonunu katalize eder, ardından embriyonun genomik DNA'sına entegrasyonu gerçekleşir. Daha sonra, kaset promotörü hem mitfa geninin hem de ilgilenilen aday genin ekspresyonunu yönlendirir.
Mitfa geni melanosit kurtarılmasını ve gelişimini desteklerken, aday gen onkojenik ise melanom başlangıcını indükler. Geliştirilen zebra balığını tarayın. Kurtarılan melanositlere sahip transgenik balıklar melanin pigmentasyonu geliştirirken, melanom taşıyanlar kabarık pigmentli lezyonlar taşır.
Aşağıdaki protokolde, transgenik zebra balığı tümör modellerinde miniCoopR vektörleri kullanılarak melanom başlangıç değiştiricilerinin taranmasını göstereceğiz.
- Enjekte edilecek yapılar oluşturmak için, ilgilenilen genlerin tam uzunlukta açık okuma çerçevesini güçlendiren ve pDONR221'e yeniden birleştiren PCR ile Ağ Geçidi orta giriş klonları oluşturarak başlayın. Ardından, ilgilenilen genleri mitfa promotörün kontrolü altına yerleştirmek için melanosit spesifik mitfa promotörünü, ilgilenilen geni ve poliadenilasyon sinyalini miniCoopR vektörüne yeniden birleştirmek için Multisite Gateway teknolojisini kullanın.
Tek hücreli, transgenik, üçlü homozigot zebra balığı embriyolarına 25 pikogram Tol2 transpozaz mRNA'sı ile birlikte her klonun 25 pikogramını enjekte edin. mitfa-BRAF-p53 mutant hayvanlar melanosit eksikliği vardır ve transformasyona ve melanom oluşumuna eğilimlidir. İlgilenilen gen ile birlikte, miniCoopR vektörü kurtarıcı bir mitfa minigeni içerir. Bu nedenle, başarılı bir şekilde enjekte edilen hayvanlar, ilgilenilen geni ifade eden kurtarılmış melanositler geliştirecektir.
Enjekte edilen embriyoları 28.5 santigrat derecede inkübe edin. Döllenmeden 24 saat sonra veya hpf, ölü embriyoları çıkarın. Döllenmeden 72 saat sonra, beyaz bir arka plana karşı gelen ışık altında bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, kurtarılan melanositleri olan transgenik hayvanları seçin.
Hayvanlar döllenmeden 4 gün sonrasına ulaştığında, onları zebra balığı tesisinin fidanlığındaki 3 litrelik tanklara aktarın. 2 aylıkken, en az bir melanosit kurtarma alanı 4 milimetre kareden daha büyük olan hayvanları seçin. Seçilen hayvanları tümörlerin varlığı açısından haftalık olarak tarayın. Çalışma için tümör taşıyan hayvanları izole edin.
Apsiste yaş ve haftalarla melanomsuz sağkalım eğrileri ve ordinatta melanomsuz sağkalım yüzdesi çizin. Melanositlerde EGFP eksprese eden hayvanları kontrol etmek için ilgilenilen bir geni ifade eden melanositli hayvanları karşılaştırın. İki eğrinin istatistiksel olarak farklı olup olmadığını belirlemek için bir log-rank testi kullanın.
