JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 3:45 dk • April 30th, 2023
- Transkripsiyon faktörleri, DNA bağlanma alanları içeren proteinlerdir. Spesifik DNA dizilerine bağlanırlar ve hücrelerde gen ekspresyonunu düzenlemeye yardımcı olurlar. Ölçekle ilişkili melanositlerde transkripsiyon faktörü ekspresyonunu tespit etmek için, önce anestezi uygulanmış bir zebra balığından koyu pigmentli sırt pullarını hasat edin. Ölçekleri sabitleyin ve tek tek melanositleri geçirgen hale getirmek için bir geçirgenleştirme solüsyonu ile muamele edin.
Koyu melanin pigment granüllerini hücrelerden çıkarmak için bir ağartıcı solüsyon ile muamele edin. Bu ağartma işlemi, sonraki boyama adımları sırasında pigmentle ilişkili arka plan sinyallerinin olasılığını ortadan kaldırır. Hücre yüzeyindeki spesifik olmayan protein bağlanma bölgelerini bloke etmek için proteinler içeren bir bloke edici çözelti ile inkübe edin.
Şimdi, numuneyi istenen primer antikorlarla tedavi edin. Bu antikorlar, hücreler içindeki hedef transkripsiyon faktörlerine bağlanır. Daha sonra, numuneyi birincil antikorlara özgü floresan etiketli ikincil antikorlarla etiketleyin. Ek olarak, hücre çekirdeğini lekelemek için numuneyi uygun bir floresan DNA bağlayıcı boya ile muamele edin. Transkripsiyon faktörü-antikor komplekslerinden ve hücre çekirdeklerinden gelen parlak floresan emisyonlarını tespit etmek için bir floresan mikroskobu kullanın.
Aşağıdaki protokolde, transgenik bir zebra balığında melanosit ile indüklenen transkripsiyon faktörü-A veya mitfa eksprese eden dorsal ölçekle ilişkili melanositlerin immün boyamalarını göstereceğiz.
- İmmün boyama yapmak için, balığı mililitre Trikain başına 0.17 miligram olarak uyuşturun. Diseksiyon mikroskobu altında gelen ışıkla, ölçeğin melanosit içeren yarısına zarar vermemeye dikkat ederek sırt pullarını koparmak için keskin ince uçlu forseps kullanın. Terazileri doğrudan forsepsten 1 mililitre fiksatife yerleştirin ve döndürürken 2 saate eşit veya daha fazla oda sıcaklığında inkübe edin. Balıkları balık suyuna aktarın ve başarılı bir şekilde iyileşmeyi doğrulamak için balığı izleyin.
Pigmentli melanositleri ağartmak için önce PBST'de sabit pulları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca iki kez yıkayın. Daha sonra, 1 mililitre taze yapılmış çamaşır suyu çözeltisi ekleyin ve gazın tüpleri patlatmasını önlemek için parafilm veya kapak kilitleriyle örtün. Pigment gidene kadar ağartmaya devam edin. Daha sonra PBST'de oda sıcaklığında 5 dakika boyunca dört kez yıkayın.
Blok çözelti içinde en az 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, gece boyunca oda sıcaklığında blok çözelti içinde yaklaşık 400 mikrolitre primer antikor ile inkübe edin. Ertesi gün, tartıları oda sıcaklığında PBST'de 30 dakika boyunca üç kez yıkayın. İkincil antikor ile oda sıcaklığında 2 saat ila gece boyunca inkübe edin.
DAPI ile boyama işleminden sonra, bir cam slayta bir damla vectashield uygulayın ve pulları, pulların içbükey tarafı slayta bakacak şekilde monte edin. Numunelerin üzerine bir cam kapak kılıfı yerleştirin. Kenarları kapatmak için şeffaf oje kullanın ve slaytları floresan mikroskobu altında gözlemleyin.