JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 4:05 dk. • April 30th, 2023
- Melanom nakli tahlili sırasında, tümör taşıyan zebra balığından elde edilen kanserli hücreler, tümör gelişimini incelemek için bağışıklığı baskılanmış bir alıcı modeline nakledilir. Ötenazi yapılmış tümör taşıyan bir donör zebra balığı alarak başlayın ve tümörü vücudundan cerrahi olarak çıkarın. Tümörü uygun bir tampon içeren bir Petri kabına aktarın ve küçük parçalar halinde kıyın.
Daha sonra, tümör parçalarını bir pipet kullanarak tritüre edin. Bu, tümör parçalarını tek tek hücrelere ayırır. Şimdi, tümör hücresi süspansiyonunu bir şırıngaya yükleyin. Daha sonra, bağışıklığı baskılanmış bir alıcı Casper zebra balığını bir filtre kağıdına hazırlayın. Zebra balığının bu pigmentasyon eksikliği, mutant varyantı melanositlerden ve iridoforlardan yoksundur, bu da onu görüntüleme ve transplantasyon deneyleri için şeffaf ve çok yönlü hale getirir.
Ardından, önceden yüklenmiş melanom hücre süspansiyonunu, Casper zebra balığının arka beyin ile sırt yüzgeci arasındaki periton boşluğunun üzerindeki bölgeye deri altından enjekte edin. Şimdi, alıcı balığı suya aktarın ve tümör gelişimini gözlemlemek için izleyin. Zebra balığının şeffaf gövdesi, gelişmiş tümörlerin kolay görüntülenmesine yardımcı olur.
Aşağıdaki protokolde, transgenik tümör taşıyan bir zebra balığı donöründen melanom hücrelerinin bağışıklığı baskılanmış bir alıcı Casper balığı modeline naklini göstereceğiz.
- Alıcı 2 ila 3 aylık Casper balığını, transplantasyondan bir gün önce 25 Gy gama ışınlaması ile ışınladıktan sonra, balığın balık suyunda iyileşmesine izin verin. Tümör taşıyan bir balığı ötenazi yapmak için tricaine kullanın. Tümörü kesin ve yaklaşık 5 mililitre filtre, sterilize edilmiş 0.9x PBS,% 5 FPS ile bir Petri kabına koyun. Bir ustura ile, çözelti içindeyken tümörü doğrayın.
Oda sıcaklığında ve bir P1000 pipeti ile çalışarak, tek hücreler üretmek için tritüre edin. Hacmi 25 mililitreye getirin. Çözeltiyi 40 mikrometrelik bir ağ filtresinden süzün ve 10 dakika boyunca 453 rcf'de bir masa üstü santrifüjde döndürün. Pelet% 0.9 PBS% 5 FBS'de istenen konsantrasyona yeniden süspanse edin.
Bir hemositometre kullanarak, tam hücre sayısını hesaplayın ve hücre süspansiyonunu, son enjeksiyon hacmi yaklaşık 5 mikrolitre olacak şekilde seyreltin. Örneğin, 50.000 hücre enjekte edilecekse, hücre süspansiyonu mikrolitre başına 10.000 hücrelik bir nihai konsantrasyona seyreltilmelidir. Hücrelerin topaklanmasını önlemek için hücre süspansiyonunu içeren tüpü birkaç dakikada bir hafifçe vurun.
% 100 etanol ve 0.9x PBS ile, şırıngayı 5 mikrolitre hücre süspansiyonu ile yüklemeden önce 26s gauge (konik uç) 701 N 10 mikrolitre Hamilton şırıngasını 2 ila 3 kez yıkayın. Işınlanmış alıcı balığı tricaine içinde uyuşturduktan sonra, nemli bir Kimwipe üzerine yan yatırın.
Balığı bir elinizle sabitleyin ve iğneyi, eğim yukarı bakacak şekilde 45 derecelik bir açıyla balığın yan tarafına, periton boşluğunun üzerinde, arka beynin arka sınırı ile sırt yüzgecinin iç sınırı arasında yaklaşık yarıya kadar sokun. Pistona hafifçe bastırın. Balığın taze balık suyunda iyileşmesine izin verin ve balıkları tümör aşılaması için günlük olarak gözlemleyin. Aşılama meydana gelmişse, devam eden büyüme ve hastalık gelişimi de gözlemlenebilir.