Name: Hücreli Davranış kaydetme Myxococcus xanthus Biyofilmler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-06T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Öğrenin, Myxococcus xanthus sürü davranışını incelemek için zaman atlamalı mikrosinematografi yöntemini. Bu protokol, tekrarlanabilir ve nicelenebilir sonuçlar elde etmek için yeniden kullanılabilir silikon contalar kullanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma, RDW için bir Ulusal Bilim Vakfı Kariyer ödülü (MCB-0.746.066, acil Davranış düzenler transkripsiyonel Aktivatörler Karakterizasyonu) mümkün olmuştur LJ Shimkus, BS Goldman, G. Suen, M. Singer, LG Welch, KA Murphy, ve HG Taş el yazması üzerinde yararlı tartışmalar ve yorumlar için teşekkür ediyoruz.

Malzemeleri gerekli: <ul><li> Klett metre </li><li> Pipet ve ipuçları </li><li> 2.5 ml mikrosantrifüj tüpler </li><li> Mikrosantrifüj </li><li> CTTYE medya: <ul><li> % 1.0 Casitone (Difco Laboratories),% 0.5 maya özü (Difco Laboratories), </li><li> 10.0 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1.0 mM KH 2 PO 4, 8.0 mM MgSO 4 </li></ul></li><li> TPM medya: <ul><li> 10.0 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1.0 mM KH 2 PO 4, 8.0 mM MgSO 4 </li></ul></li><li> Agaroz </li><li> Su banyosu, 55 ° C </li><li> Cam mikroskop lamı </li><li> Büyük cam lamelleri </li><li> 2 x 2 cm, 0.5-mm kalınlığında silikon kauçuk conta (Grace Bio-Lab Inc.) </li><li> Parafilm (ya da etiketleme bant) </li><li> Forseps </li><li> Küçük bağlayıcı klipleri </li><li> Micro-örnekleme pipet (Balıkçı) </li><li> 100 ul cam tek ucu (Balıkçı) </li><li> Kimwipes </li></ul> Bölüm 1: Hücre Hazırlama Steril bir ortam oluşturarak başlayın. <ul><li> Temiz çalışma alanı, don eldiven ve ışık brülör. </li></ul><ol><li> CTTYE suyu içeren bir balona aşılama ve dinç dönen ile 32 ° C de karanlıkta inkübe bir gecede hücre kültürü başlayın. </li><li> Sonra kültür 5 x 10 8 hücre / ml, 2.5 ml mikrosantrifüj tüp içine pipetle 1 ml hücre yoğunluğu ulaştı. </li><li> 16.000 xg (veya maksimum hız) 2 dakika süreyle santrifüj Pelet hücreleri. </li><li> Durusu ve supernatant atın. </li><li> 1 ml TPM (tuz dengeli, besin ücretsiz medya) ile hücre pelletini yıkayın. <ul><li> yeniden askıya alma ve vorteks </li></ul></li><li> 16.000 xg (veya maksimum hız) az 2 dakika için iplik Re-pelet hücreleri. </li><li> Durusu ve supernatant atın. KRİTİK ADIM </li><li> Pipetleme ve vorteks bir arada kullanarak 100 ul TPM medya tamamen pelet yeniden askıya. ÖNEMLİ NOT: Bu adım, tüp içinde kalan hücreleri hiçbir kümeleri olduğunu sağlar. Bu biraz zaman alabilir. </li><li> Izleme tahlil plakalar hazırlarken oda sıcaklığında kenara hücreleri ayarlayın. </li></ol> Bölüm 2: Agar hazırlanması <ol><li> TPM (testi medya) ve CTTYE (besleyici disk) medya hem de 50 ml hazırlayın. </li><li> Her (agaroz agar daha az difraktif) 0.5 g agaroz ekleyin. </li><li> Sterilize etmek Otoklav. </li><li> Sterilizasyon sonrasında, 55 medya korumak ° C (bir inkübatör veya su banyosu) izleme tahlil plaka kompleksleri inşa ederken. </li></ol> Bölüm 3: Besin Disk İnşaat <ol><li> Oluşturan küçük bir iyi, bir alev steril cam mikroskop lamı üst 0.5 mm kalınlığında steril bir silikon kauçuk conta yerleştirin. </li><li> Pipet ~ 300 ul 55 ° C de slaytta conta tarafından oluşturulan ve besin disk içeren bir CTTYE medya / agaroz. CTTYE medya / agaroz kadar höyük. </li><li> CTTYE medya / agaroz üst alev sterilize slayt (conta ile) yerleştirin. ÖNEMLİ NOT: Bu slayt şekillendirme kabarcıklarını engellemek için bir açıyla aşağı doğru ayarlanmış olması gerekir. </li><li> Slayt yerleştirildikten sonra, mini bağlayıcı klipleri ile birlikte karmaşık kelepçe - her iki tarafta. </li><li> Kırpılır kompleksi, 4 ° C ve CTTYE medya / agaroz ayarlamak için izin yerleştirin. Bu genellikle yaklaşık 5 dakika sürer. </li></ol> Bölüm 4: Takip Testi Hazırlık - Plaka Kompleksleri Kurma Parçaları bir araya toplamak, slayt kompleksleri hazırlamak, besin disk yerleştirin, TPM medya / agaroz, ayrı ve kuru plaka kompleksleri, plaka hücreleri ve tahlil plaka kompleksleri izleme monte dökün. Plaka karmaşık parçaları bir araya <ol><li> Her bir kompleks için, alev, bir cam mikroskop lamı sterilize </li><li> Otoklavlanmış conta slayt üstünde bir koyun ve bir kenara koyun (yüzü yukarı sterilize). Bu testin alt oluşturacaktır. </li><li> Alev bir cam kapak kayma ve yer etiketleme bant (veya Parafilm) ile sarılmış bir ikinci cam mikroskop lamı üstüne (yüzü yukarı sterilize) bir kenara sterilize edin. Bu çatlama lamel tutmak için bir destek slayt olarak kullanılır. Bu testin en oluşturacaktır. </li><li> Alev üçüncü bir cam mikroskop lamı sterilize ve kenara koyun (yüzü yukarı sterilize). Bu agaroz düzleştirmek için kullanılır. ÖNEMLİ NOT: contalar, forseps ile aşağı basarak cam bir mühür formu emin olun, aksi takdirde medya / agaroz kurumasına neden olabilir. </li></ol> P besleyici diske dantel ÖNEMLİ: 10 ile 5 Adımda bir defada bir slayt kompleksi yapılması gerekir, aksi takdirde medya / agaroz film kalitesi kötü sonuçlanan katılaşmaya başlar. <ol start="5"><li> Besleyici disk kompleksi formu çıkarın 4 ° C (bölüm 3 adım 5) ve şu anda katılaşmış CTTYE / agaroz açığa slaytları ayrı gözetlemek. </li><li> 100 ul cam tek ipucu, bir mikro-örnekleme pipet kullanarak yukarıda açıklanan CTTYE medya / agaroz 1 mm çapında 'besleyici disk' çıkarın ve kapak kayma (yukarıdaki adım 3) conta tarafından oluşturulan . </li></ol> Plakalar dökün KRİTİK ADIM <ol start="7"><li> Pipet ~ 300 ul 55 ° C TPM medya / agaroz ve kapak kayma ve besin disk içeren conta tarafından oluşturulan içine. TPM medya / agaroz kadar höyük. KRİTİK ADIM </li><li> TPM medya / agaroz üstünde herhangi bir conta (3 adım) alev sterilize slayt yerleştirin. ÖNEMLİ NOT: Bu slayt şekillendirme kabarcıklarını engellemek için bir açıyla aşağı doğru ayarlanmış olması gerekir. </li><li> Slayt (5 adım) yerleştirildikten sonra, mini bağlayıcı klipleri ile birlikte karmaşık kelepçe - her iki tarafta. </li><li> Kırpılır kompleksi, 4 ° C ve medya / agaroz ayarlamak için izin yerleştirin. Bu genellikle yaklaşık 5 dakika sürer. </li></ol> Ayrı ve kuru plakalar ÖNEMLİ: medya / agaroz kurumasını önlemek için, 20 üzerinden 11, bir defada yalnızca bir slayt kompleksi yapılmalıdır adımları. ÖNEMLİ: En iyi sonuç için, 13 ile 11 adımda 4 yapılmalıdır ° C <ol start="11"><li> Medya / agaroz ayarlandıktan sonra, bağlayıcı klipleri kaldırmak ve bant sarılmış slayt gevşetmek için kompleks sonuna sıkmak. </li><li> Bant sarılmış bir slayt çıkarın ve daha sonra kullanmak için tezgah üzerine yerleştirin. KRİTİK ADIM </li><li> Destek slayt (conta), bir kama olarak forseps kullanma kapak slip / conta / media / agaroz kompleksi ayrı ve destek slayt atın. ÖNEMLİ NOT: kapak kayma / conta kompleksi ayrı bir meraklı hareket etmeyin. Bu kapak kayma kırılması ve / veya medya / agaroz destek slayt yapışmasını neden olabilir. </li><li> Bant sarılmış slayt kapak kayma / conta / media / agaroz kompleksi (conta tarafı yukarı) yerleştirin ve 4 kaldırmak ° C. Tüm görünür nem yeni maruz medya / agaroz yüzeyinden buharlaşması izin vermek için bir yazıcı için bu karmaşık sonraki yerde en fazla 1 dakika. ÖNEMLİ NOT: M. medya / agaroz kuru bu kadar çok uzun süre izin vermeyin etkileyebilir xanthus sürüsünün davranış. </li></ol> Plaka hücreleri KRİTİK ADIM <ol><li> Sonra aşırı nem, besin disk uzak medya / agaroz yaklaşık 1 mm üzerine konsantre hücreleri (part 1 adım 8) 0.5 ul pipet buharlaştı. ÖNEMLİ NOT: Bu hücreler, düz aşağı ve sonra doğruca yukarı pipet hareket ettirerek tevdi olduğundan emin olmak için son derece önemlidir. Bu sürüsü yuvarlak olmasını sağlar. ÖNEMLİ: Bu medya / agaroz pipet ucu dokunmak için son derece önemlidir. Bu yüzey üzerinde bir depresyon ve M. davranış değişikliği xanthus sürüsü. İPUCU: pipet medya / agaroz yaklaşmadan önce sıkıp. Bu hücreler bir damla pipet ucu alt görünür ve hücreleri daha kolay yatırmak için yapmak için izin verecektir. </li><li> Hücrelerin yatırılır sonra, brülör sonraki karmaşık hücre nokta kurumasını bekleyin yerleştirin en fazla 20 sn. </li></ol> Tahlil birleştirin <ol><li> Hücre nokta kuruduktan sonra, kapak kayma / conta / media / agaroz / hücre kompleksi (13 adım) contası ile slayt / conta kompleksi (adım 1) hizaya getirin ve yavaşça bir mühür formu ile birlikte basın. KRİTİK ADIM </li><li> Slayt yüzeyleri temizleyin ve Parafilm bıraktığı kalıntı kaldırmak için bir Kimwipe kayma kapsayacak. Tamamlanan test Şekil 1 benzer. </li><li> , 32 ° C'de muhafaza ısıtılmış aşaması tamamlanan slayt kompleksi Place (slayt aşağı yukarı kayma kapak) yoğuşmaya oluşturan önlemek için (adım 15) hemen sonra aşağı silin. Varsa, yoğunlaşma oluşan görüntü elde etme yazılımı başlamadan önce birkaç saniye boyunca ısıtmalı sahnede slayt karmaşık bekletin. </li><li> (2X, 4X, 10X) uygun bir hedef seçin. </li></ol> Bölüm 5: Film Hazırlığı t "&gt; KRİTİK ADIM <ol><li> Açın, fotoğraf makinesi ve mikroskop ve ışık düzeylerini kontrol (ışık çok yoğun olmadığından emin olun). Bilgisayarı başlatın ve görüntü elde etme programını açın. </li><li> Canlı görüntü penceresi tıklayın ve mikroskop odak. Görüntü Şekil 3'te görüldüğü gibi görünmelidir. Düzgün agar yüzeyinden dikkat edin. </li><li> Görüntüler elde başlayın. KRİTİK ADIM </li><li> Medya / agar odak kayması neden yerleşmek eğilimi, ilk bir saat boyunca odağı düzenli olarak kontrol edin. </li><li> Çalışma alanını temiz. </li><li> Görüntü alımı tamamlandıktan sonra, transfer görüntüleri depolama için satın almış ve bir gecede% 90 etanol iliklerine slayt kompleksi yıkmak. </li><li> Yeniden Otoklav conta. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 TM plaka kompleks Karikatür resimde. (A) patladı görünümü ve kesit temel TM plaka kompleksi gösterir. (B) büyük contaların kullanımını gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Mikroskop küme. Her mikroskop düğüm (inset) Nikon E400 mikroskop, hedefleri, ısıtılmış bir aşamada, bir Insight kamera ve dizüstü bilgisayar oluşur. Her düğüm birlikte ağ ve bir ana denetleyici bilgisayara bağlı. Düğümlerin İki EXFO ışık kaynağı ve iki Uniblitz kepenkler oluşur floresan yetenekleri ile ayarlanır. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. 20X görüntü izleme analiz aygıtının bir anda = 0. Ölçeği bar, 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 TM plaka kompleks Uyarlanabilirlik. (A) M. 100X görüntü % 1.0 agar CTTYE xanthus kayma motilite. (B) P. 20X görüntü aeruginosa motilite seğirmesi. (C) 20X görüntü S. marcescens motilite swarming. Her ikisi de (B) ve (C),% 1.0 agar LB ölçüldü. (D) M. 40X görüntü smegmatis% 0.5 agar LB motilite kayar. Bu görüntü Şekil 1B görülen alternatif tahlil yapılandırmayı kullanarak ele geçirildi. Video 1 izleme tahlil tabi bir sürüsü bir zaman atlamalı video. Bir M. Video 2. bir zaman atlamalı video xanthus sürüsü hücrelerin% 1 floresan ile işaretlenmiş. Alternatif faz kontrast ve floresan görüntüler yakalanır ve floresan hücrelerinin sürüsü içindeki konumunu aydınlatmak için üst üste. Bu video% 1.0 agar CTTYE üzerine yakalandı. M. Video 3. bir zaman atlamalı video xanthus kayma motilite. Bu video% 1.0 agar CTTYE üzerine yakalandı. Video 4 P. bir zaman atlamalı video aeruginosa motilite seğirmesi. Bu video% 1.0 agar LB yakalandı. Video 5 S. bir zaman atlamalı video marcescens motilite swarming. Bu video% 1.0 agar LB yakalandı. Video 6 M. A time-lapse video smegmatis motilite kayar. Bu video Şekil 1B görülen alternatif tahlil yapılandırmayı kullanarak% 0.5 agar LB yakalandı.

<ol><li>Taylor, R. G., Welch, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+as+an+emergent+property+of+a+swarm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis as an emergent property of a swarm.</a> J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).</li>
<li>Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+of+Myxococcus+xanthus+During+Fruiting+Body+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation.</a> J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).</li>
<li>Mignot, T., Merlie, J. P., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+pole-to-pole+oscillations+of+a+bacterial+gliding+motility+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein.</a> Science. 310, 855-857 (2005).</li>
<li>Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachment+surface+migration%2C+and+other+dynamic+behavior+in+bacterial+biofilms+revealed+by+digital+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging.</a> Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).</li>
<li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+as+microbial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu Rev Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li>
<li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+and+twitching+motility+are+necessary+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).</li>
<li>Dalton, H. M., Poulsen, L. K., Halasz, P., Angles, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substratum-induced+morphological+changes+in+a+marine+bacterium+and+their+relevance+to+biofilm+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure.</a> J Bacteriol. 176, 6900-6906 (1994).</li>
<li>Dworkin, M., Eide, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myxococcus+xanthus+does+not+respond+chemotactically+to+moderate+concentration+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Myxococcus xanthus does not respond chemotactically to moderate concentration gradients.</a> J Bacteriol. 154, 437-442 (1983).</li>
<li>Dworkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactic+behavior+of+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tactic behavior of Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 154, 452-459 (1983).</li>
<li>Wu, S. S., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+expression+of+the+pilA+gene+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).</li>
<li>Bustamante, V. H., Martínez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Frz+signal+transduction+system+of+Myxococcus+xanthus+shows+the+importance+of+the+conserved+C-terminal+region+of+the+cytoplasmic+chemoreceptor+FrzCD+in+sensing+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals.</a> Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).</li>
</ol>

Time-lapse microcinematography (TM), prokaryotik motilite 2-7 okuyan bir standart yaklaşım haline gelmiştir . Geleneksel olarak, TM yüzeylerde 8-11 gibi filtre kağıdı fitil, ince agar pedleri, veya agar plaka kullanılarak yapılır. Bu yöntemler bakteri hareketin genel çizimler için görüntü dizileri oluşturmak için kullanıldığı zaman etkili, yeterli ve maliyet. Ancak, görüntü sıralarını tekrarlanabilir ve nicel titiz veri üretimi sonucu gerekiyorsa, bu yöntemlerin zaman alıcı ve biraz güvenilmez. Örn...

<table><tbody><tr><td>%1,0 Casitone</td><td>Difco Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>%0,5 maya ekstresi</td><td>Difco Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro-örnekleme pipeti</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;l cam tek kullanımlık uç</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 x 2 cm, 0,5-mm kalınlığında silikon kauçuk conta</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hücreli davranış kaydetme myxococcus xanthus</emzaman atlamalı microcinematography kullanarak> biyofilmler

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

Δ-proteobacterium Myxococcus xanthus sürüsü milyonlarca sinyalleri bir dizi çevresel uyaranlara yanıt olarak karmaşık, dinamik desenler oluşturmak için kolektif bir, koordine bir hareket olarak hareket hücre içerir . Bu modeller, kendini organize ve acil bireysel hücrelerin davranışlarını gözlemleyerek tahmin edilemez. Bir zaman atlamalı microcinematography izleme testi kullanılarak, M. ayrı bir acil desen tespit xanthus kaynak 1 doğru bir besin degrade kadar bir sürüsü yönlendirilmiş bir hareket olarak tanımlanan, kemotaksis olarak adlandırılır. Time-lapse microcinematography yoluyla kemotaksis verimli karakterize etmek için, bir çok değiştirilebilir plaka kompleksi geliştirdi (Şekil 1) ve 8 mikroskoplar (Şekil 2), zaman atlamalı videos yakalama yetenekli her bir küme inşa edilmiş. Testin ölçülebilir verilerin tutarlı çoğaltma yetecek kadar titiz, ve ortaya çıkan videolar ince sürüsü davranış değişiklikleri gözlemlemek ve izlemek için izin verir. Bir kez yakalanan, videolar, binlerce videoları işlemek ve depolamak için yeterli belleğe sahip bir analiz / depolama bilgisayara aktarılır. Bu kurulum esnekliği kanıtlanmıştır M. birkaç üyelerine faydalı xanthus toplum.

Çalışmak için<em&gt; Myxococcus xanthus</em&gt; Sürüsü davranış, biz farklı deneyleri için modifiye edilebilir bir zaman atlamalı microcinematography protokol tasarladık. Mikroskopi için uygun standart büyüme istihdam ve ucuz, yeniden silikon conta kullanımı tekrarlanabilir sonuçlar verir. Biz çok hücreli kemotaksis ölçmek için bu yöntemi kullanmıştır.

Hücreli Davranış kaydetme Myxococcus xanthus</emZaman atlamalı Microcinematography kullanarak> Biyofilmler

$\delta$-proteobacterium Myxococcus xanthus'un bir sürüsü, bir dizi ... aracılığıyla hareketlerini koordine ederek bir kolektif olarak hareket eden milyonlarca hücre içerir.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tekrarlanabilir ve nicelendirilebilir sonuçlar üretmek için yeterli titizliğe sahip, düşük maliyetli bir zaman ayarlı mikrosinematografi deneyi geliştirmektir. Bu, agar ortam plakaları veya mikroskop lamları oluşturmak için ucuz, yeniden kullanılabilir silikon contaların kullanılmasıyla gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçlar, bu plaka komplekslerinin çeşitli ortam türleri ve agar konsantrasyonlarında bir haftadan fazla süreyle nemli kaldığını ve yeterince oksijenlendiğini göstermektedir.Ayrıca, zaman ayarlı mikro sinematografi yavaş bir süreç olduğu için, sekiz adet ucuz mikroskobun kullanılması veri toplama sürecini hızlandırmaya yardımcı olur. Merhaba, ben Syracuse Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden Dr. Roy Welch'in laboratuvarından Ryan Taylor. Bugün size laboratuvarımızdaki bakteriyel biyofilmlerin zaman ayarlı videolarını çekme prosedürünü göstereceğiz; bu prosedürü MTI biyofilmlerinin çok hücreli davranışlarını incelemek için kullanacağız.Hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, bir hücre sayacı kullanarak gece boyunca inkübe edilmiş bir Occus sanus kültürünün hücre yoğunluğunu ölçün; kültürden 1 mL alarak 2,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne

recording-multicellular-behavior-myxococcus-xanthus-biofilms-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, otomatik floresan zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak zaman farklı bakteriler tek hücre davranışlarını izlemek için bir adım-adım yordam sağlar. Ayrıca, biz nasıl mikroskobu görüntüleri analiz etmek için yönergeler sağlar.

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

Bu yöntem gerçek zamanlı ve bu hız, yer değiştirme ve hız gibi farklı hücre göçü parametrelerinin nicel ölçümleri hücrelerin izlenmesine olanak sağlar. Geleneksel yöntemlerin aksine, bu gerçek zamanlı bir yaklaşım uç kantitatif göç ölçümlere dayalı değildir, bunun yerine izlenmesi ve sürekli farklı parametreler hesaplanarak sağlar.

Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz

Kaynak: Oms, T., ve diğerleri. Escherichia coli'de Antibiyotik Kalıcılığının Popülasyon ve Tek Hücre Analizi. J. Vis. Uzm. (2023)Bu video, mikroakışkan bir sistem içinde floresan etiketli bir DNA bağlayıcı proteini eksprese eden bireysel bakteri hücrelerini izlemek için bir protokol sunar. Antibiyotiklerin çoğu hücreyi nasıl inhibe ettiğini, kalıcı hücrelerin bir alt popülasyonunun tedaviden sağ çıktığını ve antibiyotiğin çıkarılmasının ardından yeniden büyüdüğünü gösterir.

Bakterilerde Antibiyotik Kalıcılığını İncelemek için Mikroakışkan Hızlandırılmış Mikroskopi

Kaynak: Schumacher, D. ve diğerleri. Yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus'un tam vejetatif hücre döngüsünün floresans canlı hücre görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, yavaş büyüyen bir toprak bakterisi olan Myxococcus xanthus'un hazırlanma ve görüntülemesini gösteriyor. Kültür, floresan mikrokürelerle örtülü bir örtü üzerine uygulanır ve hidrasyon ile besin tedarikini desteklemek için önceden ısıtılmış agaroz yastığı ile örtülür. Bu düzen, bakteriyel hücre bölünmesi sırasında...

Canlı Hücre Görüntüleme İçin Myxococcus Xanthus Örneklerinin Hazırlanması

Kaynak: Schumacher, D. ve Sogaard-Andersen, L. Yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus'un tam vejetatif hücre döngüsünün floresans canlı hücre görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, bakteriyel hücre bölünmesi sırasında floresan etiketli kromozom kökenlerini takip etmek için canlı hücre görüntüleme kullanımını göstermektedir. Kromozom ayrımcılığı dinamiklerini zaman geçişli faz kontrastı ve floresan mikroskopisi kullanarak yakalar.

Flüoresans Etiketli Bakterilerde Kromozom Ayrılmasının Zaman Kesmesi Görüntülemesi

Kaynak: Makowski, Ł. ve diğerleri. Bakteriyel Avcı Bdellovibrio bacteriovorus'un yaşam döngüsünün Zaman Geçişli Flüoresans Mikroskopisi kullanılarak canlı hücre görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, Bdellovibrio bacteriovorus'un immobilize edilmiş E. coli'yi agaroz pedinin altında avladığı zaman geçişli floresan görüntülemeyi göstererek, bakteriyel predasyon ve konak-patojen etkileşimlerini incelemek için hücre içi çoğaltma ve soyut salınımının gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlıyor.

E. coli üzerinde Bdellovibrio bacteriovorus avlanmasının Canlı Hücre Zaman Geçişli Görüntülemesi

Parçacık izleme mikroreolojisi, malzemelerin viskoelastisitesini araştırır. Burada teknik, bir bakteri biyofilminin farklı matris bileşenlerinin viskoelastisite, sürünme uyumu ve etkili çapraz bağlama rollerini belirlemek için kullanılır. Matris, bakteriler tarafından salgılanan polimerik maddelerden oluşur ve bileşenleri biyofilm yapısını ve mekanik özelliklerini belirler.

Parçacık izleme Microrheology tarafından Biyofilmler Mekanik Özelliklerinin Yerinde Haritalama

Bu çalışmada, nano-mikroakışkan akış odası görselleştirmek ve işlevsel Xylella fastidiosa, dedikodu olarak Pierce hastalığa neden olan bir bakterinin seğirmesi motilitesini karakterize etmek kullanılmıştır.

Rolü seğirmesi Motilitesi görselleştirme ve Karakterizasyonu<em&gt; PilG</em&gt; &#39;de<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Bakteri hücreleri son derece dağınık şekilde düzenlenir. Yavaş büyüyen Myxococcus xanthus hücreler zamanla bu organizasyonda takip etmek için bir tuzak birçok nesiller boyunca yüksek kronolojik zamanmekansal çözünürlük ile floresan canlı hücre görüntüleme için geliştirilmiştir. Bu yöntemi kullanarak, kromozom segregasyon ve hücre bölünmesi için önemli proteinlerin kronolojik zamanmekansal dynamics tespit edilemedi.

Floresans Live-hücre görüntüleme, tam bitkisel hücre döngüsü yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus

İki boyutlu (2D) büyüme ve yara onarım testlerinin hızlandırılmış görüntülemesi için primer fare embriyonik palatal mezenkimal hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol sunuyoruz. Ayrıca hücre akışı oluşumunu ve yönlü hareketliliği belirlemek için zaman atlamalı görüntüleme verilerinin analizi için metodoloji sağlıyoruz.

Kolektif Hareket Niteliklerini Analiz Etmek için Birincil Fare Embriyonik Palatal Mezenkim Hücrelerinin İzolasyonu ve Zaman Atlamalı Görüntülenmesi

Öğrenin, Myxococcus xanthus sürü davranışını incelemek için zaman atlamalı mikrosinematografi yöntemini. Bu protokol, tekrarlanabilir ve nicelenebilir sonuçlar elde etmek için yeniden kullanılabilir silikon contalar kullanır.

Hücreli Davranış kaydetme Myxococcus xanthus Biyofilmler

Daha fazla video keşfet