Hücreli Davranış kaydetme Myxococcus xanthus Biyofilmler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tekrarlanabilir ve ölçülebilir sonuçlar elde etmek için yeterli titizlikle ucuz bir hızlandırılmış mikro sinematografi testi geliştirmektir. Bu, agros medya plakaları veya mikroskop slaytları oluşturmak için ucuz yeniden kullanılabilir silikon contaların kullanılmasıyla elde edilir. Bu plaka komplekslerinin, çeşitli ortam türleri ve agar konsantrasyonları boyunca bir haftadan fazla hidratlı ve yeterince oksijenli kaldığını gösteren sonuçlar elde edilir.

Ek olarak, hızlandırılmış mikro sinematografi yavaş bir süreç olduğundan, sekiz ucuz mikroskobun kullanılması veri toplamayı hızlandırmaya yardımcı olur. Merhaba, ben Syracuse Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden Dr.Roy Welch'in laboratuvarından Ryan Taylor. Bugün size laboratuvarımızda bakteriyel biyofilmlerin hızlandırılmış filmlerini yapmak için bir prosedür göstereceğiz, bu prosedürü MTI biyofilmlerinin çok hücreli davranışını incelemek için kullanacağız.

Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, bir gece karışımı Occus sanus kültürünün hücre yoğunluğunu bir clut metre ile ölçün, kültürün bir mililitresini 2,5 mililitrelik bir santrifüj tüpü pelet yıkamasına aktarın ve bakterileri ekteki yazılı protokolde açıklandığı gibi TPM ortamında yeniden süspanse edin, peleti tamamen yeniden süspanse etmek için pipet ve girdap, bu biraz zaman alabilir. Daha sonra, tahlil ortamı olan 50 mililitre TPM'ye 0,5 gram aros ekleyin.

Ayrıca sterilize etmek için besleyici disk ortamı otoklavı olan 50 mililitre C-T-T-Y-E'ye 0,5 gram aros ekleyin. Ardından ortamı bir inkübatörde veya su banyosunda 55 santigrat derecede tutun. İzleme tahlilini oluştururken.

Plaka kompleksleri, besleyici diski ilk alev sterilizatörü cam mikroskobunu oluşturmaya devam eder. Kaydırın ve sürgünün üzerine 0,5 milimetre kalınlığında steril bir silikon kauçuk conta yerleştirin. Yaklaşık 300 mikrolitre C TT YE ortamını pipetler, sürgü üzerindeki conta tarafından oluşturulan kuyuya aros eder.

C-T-T-Y-E medya agrosu alevleri toplamalı, başka bir sürgüyü sterilize etmeli ve C-T-T-Y-E medya arosunun üzerine belirli bir açıyla yerleştirmelidir. Sürgüyü belirli bir açıyla aşağı ayarlamak kabarcık oluşumunu önler. Slayt yerleştirildikten sonra, kompleksi her iki tarafta birer tane olmak üzere mini bağlayıcı klipslerle birlikte doldurun.

Kırpılmış kompleksi dört santigrat dereceye yerleştirin ve C-T-T-Y-E medya agrosunun sertleşmesine izin verin. Bu genellikle yaklaşık beş dakika sürer. Agro ayarlandıktan sonra, izleme tahlilinde kullanılan plaka kompleksleri hazırlanabilir.

Tahlil komplekslerini oluşturmak için slaytları hazırlayarak başlayın. Her kompleks için alevle sterilize edilmiş iki cam mikroskop slaytı. Testin tabanını oluşturmak için kızaklardan birinin üstüne bir otoklav contası yerleştirin.

Diğer slayt, agroları düzleştirmek ve bir destek slaytı olarak kullanılır. Testin üst kısmı bir kapak fişidir. Önce bir mikroskop lamını etiketleme bandı ile sarın, ardından alev sterilizatörü cam kapak fişi ve sterilize edilmiş sarılmış lamın üzerine yerleştirin.

Sarılmış sürgüyü yukarı kaydırın, kapak kızağını destekleyerek çatlamasını önler. Forseps ile alevle sterilize edilmiş kapak kaymasının üzerine bir otoklav contası yerleştirin. Camla bir sızdırmazlık oluşturduklarından emin olmak için alt sürgüdeki contalara ve kapak sürgüsüne bastırın.

Aksi takdirde, ortam ve diziler kuruyabilir. Kayar contayı ve kapak kayma contası tertibatlarını, sterilize edilmiş tarafları yukarı bakacak şekilde bir kenara koyun, buradan itibaren ortam agroslarının katılaşmasını önlemek için her seferinde yalnızca bir kompleks üzerinde çalışın, bu da düşük film kalitesine neden olur. Besleyici diski yerleştirerek başlayın.

Besleyici disk kompleksini dört santigrat dereceden çıkarın. 100 mikrolitrelik cam tek kullanımlık uçlu bir mikro örnekleme pipeti kullanarak artık katılaşmış C-T-T-Y-E aros'u açığa çıkaran bağlamayı ve slaytların önceki kısmını çıkarın. Bir milimetre çapında bir besleyici diski de C-T-T-Y-E medya agrosundan çıkarın ve kapak kızağı üzerindeki conta tarafından oluşturulan kuyuya yerleştirin.

Daha sonra TPM media agros'u inkübatörden alın ve 300 mikrolitreyi kapak kızağı üzerindeki conta tarafından oluşturulan ve besleyici diski içeren kuyucuğa pipetleyin. TPM ortamı Agros, T-P-M-S-A ortam arosunu düzleştirmek için höyük oluşturmalıdır: Contasız, alevle sterilize edilmiş kızaklardan birini TPM ortam arosunun üzerine belirli bir açıyla yerleştirin. Sürgünü belirli bir açıyla yerleştirmek, kabarcık oluşumunu önlemeye yardımcı olur.

Kompleksi her iki tarafta birer tane olmak üzere mini bağlayıcı klipslerle birlikte sıkıştırın. Kırpılmış kompleksi dört santigrat dereceye yerleştirin ve ortamın sertleşmesine izin verin. Bu genellikle yaklaşık beş dakika sürer.

Ortam ortaya çıktıktan sonra, kompleksi dört santigrat dereceden çıkarın. Bağlayıcı klipsleri çıkarın ve kompleksin ucunu sıkın. Bantla sarılmış sürgüyü gevşetmek için, bantla sarılmış sürgüyü çıkarın ve daha sonra kullanmak üzere tezgahın üzerine yerleştirin.

Sonra kama olarak bir çift forseps kullanarak. Kapak kayma contası medya agros kompleksini destek kızağından ayırın ve destek sürgüsünü atın. Kapak kayma contası kompleksini ayırmak için meraklı bir hareket kullanmayın, çünkü bu, kapak kaymasının frenlenmesine ve/veya ortamın destek kızağına yapışmasına neden olabilir.

Destek sürgüsünü çıkardıktan sonra, kapak kayma conta ortamı aray kompleksini, conta tarafı yukarı bakacak şekilde bantla sarılmış sürgünün üzerine yerleştirin. Yeni maruz kalan ortam agros yüzeyinden tüm görünür nemin buharlaşmasına izin vermek için bu kompleksi bir brülörün yanına yerleştirin. Medya agrosunun bir dakikadan daha uzun süre kurumasına izin vermeyin.

Bu, M Zant'ın sürü davranışını etkileyebileceğinden, hücreleri yeni hazırlanan tahlil kompleksi üzerinde plakalamaya devam edin. Fazla nem, kapak kayma contası ortamından buharlaştıktan sonra, agros kompleksi, ortam üzerinde birikmek üzere 0,5 mikrolitre konsantre hücreyi aspire eder. Aeros, medya agrosuna yaklaşmadan önce pipet ucuna basın.

Pipet ucunun altında bir damla hücre belirir, bu da uç ortam agrosuna dokunmadan hücrelerin bırakılmasını kolaylaştırır. Agros yüzeyindeki bir çöküntü, mz'nin, sürünün davranışını değiştirebilir. Hücreleri gömülü besleyici diskten yaklaşık bir milimetre uzağa dağıtmak için pipeti düz bir şekilde aşağı doğru hareket ettirin.

Ardından pipeti düz bir şekilde yukarı doğru çekin. Bu şekilde sürünün dairesel olması sağlanır. Hücreler biriktirildikten sonra, hücre lekesinin 20 saniyeden fazla kurumasını sağlamak için kompleksi brülörün yanına yerleştirin.

Kuruduktan sonra, kompleksin tabanını oluşturan kayar conta tertibatını kapaktaki conta ile hizalayın. Slip conta ortamı kompleksinin üst kısmını oluşturan acro hücre kompleksi. Bir conta oluşturmak için hafifçe birbirine bastırın.

Yoğuşmayı önlemek için kalıntıları gidermek için kapak kızağındaki sürgünün yüzeylerini bir kimyaj mendiliyle temizleyin. Slaytları temizledikten hemen sonra, slayt aşağı ve kapak kayması yukarı bakacak şekilde kompleksi ısıtılmış mikroskop tablasına yerleştirin. Yoğuşma oluşmuşsa, görüntü elde etme yazılımını başlatmadan önce slayt kompleksinin ısıtılmış tablada birkaç saniye oturmasına izin verin.

Filmi hazırlamak için mikroskopta iki x dört x veya 10 x olmak üzere uygun objektifi seçin. Kamerayı ve mikroskobu açın ve ışığın çok yoğun olmadığından emin olmak için ışık seviyelerini kontrol edin. Bilgisayarı başlatın ve görüntü alma programını açın.

Canlı görüntü penceresine tıklayın ve mikroskobu odaklayın. Görüntü, burada gösterilene benzer şekilde görünür. Görüntüleri almaya başlayın.

İlk bir saat boyunca odağı düzenli olarak kontrol ettiğinizden emin olun, çünkü ortam agar yerleşme eğilimindedir ve odağın kaymasına neden olur. Görüntü alımı tamamlandıktan sonra, alınan görüntüleri depolama için aktarın. Gece boyunca %90 etanole batırarak veya yeniden kullanım için contaları TOLA ile yaparak slayt kompleksini parçalayın.

Bu hızlandırılmış film, burada açıklanan izleme testine tabi tutulduğunu gösteriyor. Yakalama hızı, 20 x büyütme oranında dakikada bir görüntüdür, oynatma hızı saniyede 60 görüntüdür. Bu hızlandırılmış film, hücrelerin %1'inin GFP'yi ifade ettiği hücrelerin bir popülasyonunu gösterir.

Film, alternatif faz kontrastı ve floresan görüntülerin birleştirilmesiyle derlendi. Test, C-T-T-Y-E üzerinde% 1 Aros yakalama hızı, 100 x büyütme olarak dakikada bir görüntüdür. Bu zaman atlamalı video, M Anthes'in kayma hareketini gözler önüne seriyor.

Bu test C-T-T-Y-E üzerinde %1 Aros yakalama hızında gerçekleştirildi, 100 x büyütmede dakikada bir görüntüdür. Bu TimeLapse filmi, P OSA seğirme hareketliliğini gösterir. Bu test LB üzerinde %1 Aros yakalama hızında gerçekleştirildi, bu da dakikada bir görüntüdür.

20 x büyütme hızında oynatma hızı saniyede 60 görüntüdür. Bu hızlandırılmış film, Smar'ın kaynama hareketliliğini hissettiğini gösteriyor. Bu test LB üzerinde gerçekleştirildi ve% 1 Aris yakalama hızı dakikada bir görüntüdür.

20 x büyütme hızında oynatma hızı saniyede 60 görüntüdür. Bu zaman atlamalı film, EGT kayma hareketliliğini göstermektedir. Bu test LB üzerinde %0,5 oranında gerçekleştirildi, 20 x oynatma hızı büyütme hızı saniyede 120 görüntü olduğundan, lv'de %0,5'lik kırılganlık nedeniyle dakikada bir görüntü olan etiket gülü yakalama hızı bir görüntüdür.

Bu tahlil, şekil bir'de görülen daha büyük contaların kullanımını kullanır B.Size bakteriyel biyofilmlerin hızlandırılmış filmlerinin nasıl oluşturulacağını gösterdik. Bu prosedürü yaparken. Tutarlı sonuçlar elde etmek için zaman ayırmayı ve mümkün olduğunca kesin olmayı unutmamak önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.