Name: Yalıtım için Yöntem Francisella tularensis Dış Membranlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-29T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Öğrenin, Francisella tularensis dış membran veziküllerini osmotik liziz ve süroz yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjasyonu ile izole etme yöntemini. Bu protokol, bakteri virülansı ve aşı hedefleri araştırmaları için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Hibe Numaraları NIAID / NIH P01 AI055637 ve U54 AI057156 tarafından açıklanan proje desteklenmiştir. Kitabın içeriği, sadece yazarların sorumluluğundadır ve RCE Programlar Ofisi, NIAID veya NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Gün 1: F. tularensis plaka aşılama <ol><li> F. Plaka dondurulmuş stok kültürleri Mueller-Hinton agara tularensis% 2.5 (hacim / hacim) donör buzağı serumu,% 2 (hacim / hacim) IsoVitaleX,% 0.1 'lik (ağırlık / hacim) glikoz ve% 0.025 (ağırlık / hacim) demir pirofosfat ile desteklenmiştir. F. büyütün 37 ° ° C'de% 5 CO 2 ile yaklaşık 24 saat tularensis </li></ol> 2. Gün: F. tularensis sıvı medya aşılama <ol><li> Katyon ayarlı Mueller-Hinton orta (1.23 mM kalsiyum klorür dihidrat ve 1.03 mM magnezyum klorür hekzahidrat içeren) 1 litre hazırlayın ve otoklav. 37 Ilıyınca ° C,% 0.1 'lik (ağırlık / hacim) glikoz,% 0.025 (ağırlık / hacim) demir pirofosfat ve% 2 (hacim / hacim) IsoVitaleX ile daha fazla ek orta. Iki adet 500 ml alikotları içine (0,22 μ) sterilize orta Filtresi. </li><li> Steril 50 ml Falcon tüp içine 12 ml desteklenmiş Mueller-Hinton orta ve transfer çıkarın. </li><li> 10-ul steril bir aşılama döngü kullanarak, F. büyük bir loopful kazımak Mueller-Hinton orta (bkz. Adım 2) 12 ml agar plakları (Gün 1) ve transfer bakteri tularensis büyüme. Pipet çözüm birden çok kez kümeleri-break up ve homojen bir bakteriyel süspansiyon hazırlamak için. Girdap değil. </li><li> Adım 3 ila 5 ml bakteri süspansiyonu steril bir pipet kullanarak, her 500 ml damar aşılamak. 37 ° suyu kültürler büyütün ° C nazik sallayarak (New Brunswick Innova 2300 serisi çalkalayıcı 190-200 rpm) 14 ila 18 saat. </li></ol> 3. Gün: Spheroplasting, osmotik lizis ve sukroz yoğunluk gradiyenti santrifüj <ol><li> F. edinin tularensis sallayarak inkübatör kültürler ve ilgili optik yoğunlukları kontrol etmek için 1 ml 500 ml her kültürden bir kısım çıkarın. F. kullanırken optimum membran ekstraksiyon ve izolasyon sonuçları bulduk 0.2 - 0.4 (~ 10 7 10 8 CFU / ml) arasında bir OD 600 ile ilişkilidir büyüme, erken logaritmik faz tularensis hücreleri . Kültürler bir OD 600 0.2 'den daha az toplam sonraki sakaroz Degradeler için membran malzeme yeterli miktarda vermeyecektir. Tersine, 0.4 (sabit faz yaklaşıyor) daha OD 600 büyük kültürlerin karma membran füzyonlar verim tespit edilmiştir. </li><li> 15 - 30 dakika için 7.500 x g kültürler Santrifüj ° C hücreleri toplamak için . Sonraki pelet süspansiyon kolaylaştırır, çünkü dört adet 250 ml santrifüj şişelerde kültürlerin santrifüj tavsiye ederiz. </li><li> Her santrifüj şişe dikkatlice medya süpernatant kaldırmak ve sıkıca aşırı büyüme ortamı kaldırmak için emici bir malzeme şişe dokunun. </li><li> Santrifüj 10 dakika sonra tamamlanması içinde, 8.75 ml 0.75 M sakkaroz (5 mM Tris, pH 7.5) her bakteriyel pelet askıya. Tüm dört bakteriyel pelet askıya alan ve 10 dakika içinde (bakteriyel süspansiyon toplam 35 ml) 250 ml steril bir balon (küçük stirbar) transfer edilmelidir. </li><li> Hücre süspansiyonu yavaşça bir stirplate karıştırma sırasında, 70 ml 10 mM disodyum EDTA (2 cilt) (5 mM Tris, pH 7.8) 10 dakika boyunca yavaş yavaş ekleyin. EDTA yükseltilmiş yerel konsantrasyonlarını önlemek için hücre süspansiyonu seviyesinin altında pipet ucu ile EDTA çözeltisi ekleyin. Stirbar iyice Köpüklenmemesine veya kabarcık oluşumuna neden yeterince hızlı hücre süspansiyonu karıştırmak değil yeterli bir hızda dönen olmalıdır. EDTA çözeltisi eklendikten sonra, çözüm için 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 30 dakika inkübasyondan sonra, 11 ml (1 / 10 hacim) nihai konsantrasyonu 200 mg / ml 2 mg / ml lizozim çözüm yavaş yavaş ekleyin . Lizozim çözüm eklenmesi sırasında hücre süspansiyonu karıştırmak için devam edin. Yukarıda da belirtildiği gibi, yüksek lizozim, yerel konsantrasyonlarda önlemek için hücre süspansiyonu sıvı seviyesinin altında pipet ile lizozim çözüm ekleyin. Stok lizozim çözümleri (2 mg / ml), tek kullanımlık alikotları olarak hazırlanmış ve 3-4 ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir. Ortaya çıkan çözüm oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> 30 dakika inkübasyon sırasında, küçük bir stirbar ve 530 ml oda sıcaklığında Cellgro Moleküler Sınıf dH 2 O (4,5 hacimleri) ile steril bir 1L şişesi hazırlayın. </li><li> Ozmotik nazik karıştırma ile 10 ila 15 dakika boyunca Moleküler Biyoloji dH 2 O (Adım 7) 530 ml yavaş seyreltme (yaklaşık 11 ml / dak akış hızı) tarafından hücre süspansiyonu (Adım 6) lyse. Çünkü bu adımı daha geniş bir çözüm hacmi, düzgün bir karışım sağlamak için stirbar hızını artırmak. Stirbar Köpüklenmemesine veya kabarcık oluşumuna neden yeterince hızlı hücre süspansiyonu iyice dağıtmak için yeterli bir kez dH 2 O bir hızla dönen ama olmalıdır. Cel yeknesak seyreltme kolaylaştırmak için, pipet ucu stirbar bitişik balonun alt dinlenme ile hücre süspansiyonu eklel süspansiyon. Biz bu adımı sırasında 25 ml pipetler en iyi iş bulduk. Seyreltme işlemi dikkatlice izlemek ve akış hızı, hücreleri, hücre kümeleri ve hücre demetleri yerel birikimleri dağıtmak için gerekli kesme. Ortaya çıkan çözüm oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bu deney genel başarı için en zorlu ve kritik bir adım olarak göründüğünü unutmayın. </li><li> 10 az 30 dakika için 7500 xg'de 30 dakika inkübasyondan sonra, 50 ml konik tüpler ve santrifüj içine 40 ml alikotları osmotik lizis çözüm transfer ° C sağlam hücreleri ve enkaz kaldırmak için. </li><li> Santrifüj sonrasında, dikkatli bir şekilde her konik tüp ve havuz süpernatantlar süpernatant 27-30 ml steril bir 1L balonuna kaldırmak </li><li> 200.000 2 saat, 4 x g (F50L 8x39 FiberLite ultrasantrifüjdeki rotor 44.400 rpm) ° C 16 ultrasantrifüjdeki tüpler ve santrifüj içine, her 25 ml toplanmış süpernatant transfer Her rotor 8 tüpleri tutan unutmayın, bu adımın iki rotorlar ve iki ultrasantrifüjler gerektirir. Alternatif olarak, ikinci sette 8 tüpler santrifüj ° C ye kadar 4 düzenlenen olmalıdır. </li><li> Ultrasantrifüjdeki vadede tamamlanması 10 dakika içinde, membran tabanda tampon modifiye hazırlar. Membran süspansiyon tampon 8 ml (% 25 ağırlık / ağırlık] sakaroz, 5 mM Tris, 30 mM MgCl 2) steril bir tüpe aktarın ve EDTA-proteaz inhibitörü kokteyl ve 375 U Benzonase 1 tablet. Proteaz inhibitörü tablet çözülür çözüm yavaşça karıştırınız. </li><li> Ultrasantrifügasyon ardından, dikkatle, süpernatantlar kapalı dökün emici bir malzeme ultrasantrifüjdeki tüpler ters ve sıkıca fazla süpernatant kaldırmak için tüpler dokunun. Görselleştirme yardım için bir işaretleyici ile her membran pelet yerini işaretleyin. 600 ul değiştirilmiş membran tabanda tampon yavaşça sekiz membran pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Steril bir tüp nazikçe bu sekiz pelet ve havuz membran resuspensions tekrar süspansiyon, sonraki sekiz tüplerin her membran tabanda aktarın. Tüp duvar uzak peeling kadar pelet membranlar tekrar süspansiyon zor, bu yüzden, pelet üzerine değiştirilmiş membran tabanda tampon geçen devam. Genellikle tüp duvar ve yardım tabanda sürecinde kapalı zar pelet kazımak mikropipet ucu kullanmak için gerekli. Pipetleme, Köpüklenmemesine önlemek veya kabarcık oluşumu. Bu deney genel başarı için en zorlu ve kritik bir adım olarak göründüğünü unutmayın. </li><li> Membran pelet yeniden süspanse ve 16 tüplerinden söküldükten, modifiye membran tabanda tampon 600 ul her dört tüpler yıkayın. Yıkama, her tüp (membran pelet) etrafında işaretli alana odaklı olmalıdır. Yıkama membran tabanda tüp içine aktarın. Yıkama adım dört tüpler kalan üç set tekrarlayın. </li><li> Yün malzeme azaltılması, DNA ve yardım aşağılamak için oda sıcaklığında 30 dakika için hafif sallanan membran tabanda inkübe edin. </li><li> Membran süspansiyon küçük bir kısım çıkarın ve toplam membran verimi belirlemek için protein kantifikasyon gerçekleştirmek. Biz genellikle sulandırılmamış hazırlamak, 1:1 (% 2.5 SDS) seyreltilmiş, 01:03 90 (% 2.5 SDS) membran örnekleri, ısı örnekleri seyreltilmiş ° C de 10 dakika ve ölçmek BioRad DC Protein Testi membran tabanda protein konsantrasyonu. Toplam protein verimi genellikle 1.0 mg / ml ve 1.6 mg / ml arasında. Isı ve SDS kullanımı, daha doğru bir protein kantifikasyon değer elde edilebilir, böylece çıkarılan membranlar OMPs serbest bırakmak için gereklidir. </li><li> :% 55,% 50,% 45, aşağıdaki sırayla 14 x 95 mm Ultra Clear ultrasantrifüjdeki tüpler içine katman 1.8 ml sakkaroz çözümleri (ağırlık / ağırlık, 5 mM EDTA, pH 7.5) tarafından doğrusal sakaroz gradyanlar hazırlayın % 40,% 35,% 30. Sakaroz degradelerin Katmanlama bir ampul değil, otomatik bir pipet pipet kullanırken gerçekleştirmek için kolay. </li><li> Membran proteini tabanda kantifikasyon (Adım 16), katman her degrade üstüne membran tabanda 1.5 mg geçerli. Her 14 x 95 mm ultrasantrifüjdeki tüp 10.8 ml Adım 17 sakaroz çözümleri ile muhasebeleştirilir verilen maksimum kapasitesi ve 12.5 ml, degrade başına membran tabanda 1.7 ml den fazla yük olmamalıdır. Bütün tüpler aynı kiloda (± 0,01 g), böylece her sukroz gradient tüpün son ağırlığı (membran tabanda ekleyerek veya kaldırarak) ayrı ayrı tartmak ve dikkatli bir şekilde ayarlayın. </li><li> 256,000 en az 17 saat, 4 x g (38.000 rpm) ° C SW-40Ti sallanan bir kepçe rotor ve santrifüj Transfer sakaroz gradyanlar </li></ol> 4. Gün: sukroz gradient kesirler Koleksiyon <ol><li> Santrifüj 17 saat sonra, santrifüj vadede durdurmak ve SW-40Ti rotor sakaroz gradyanlar dikkatli bir şekilde kaldırın. </li><li> % 70 etanol ile sakaroz degrade tüp alt ponksiyon dikkatlice temizleyin21g bir iğne ile tüpün alt ve steril mikrofuge'de tüpler içine degrade sıralı 500 ul kesirleri toplamak. Sonraki Degradeler için tekrarlayın. Degrade yerçekimi akışı ile damla izin verilmelidir, bu nedenle gibi sukroz gradient rahatsız etmek değil. Ancak, damlama degrade tüp alt sona ermesi halinde, küçük bir miktar baskı parmağını kullanarak tüp üst olabilir. </li><li> Kırılma indisi refraktometre kullanılarak her sakaroz degrade fraksiyonu belirlemek ve kırılma indisi 1 g / ml belirli bir yoğunluk ile ilişkili. Nitroselüloz transfer, SDS-PAGE ayırma ve immunoblotting; temsilcisi sukroz gradient fraksiyonları (1.11 g / ml 1,26 g / ml, 0.01 yoğunluk artışlarla) hazırlarken protein yerelleştirme değerlendirin. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar hem Tipi IM ve OM veziküller tam ayrımını doğru yapılan bu yordamı sonuçları (örneğin SchuS4) ve B Tipi F. (örneğin LVS) suşları tularensis. Şekil 1, F. temsilcisi immunoblots gösterilen tularensis OMPs yoğunlukları arasında 1.17 ve 1.20 g / ml yerelleştirilmesine. Karşılaştırma IMPS yoğunlukları arasında 1.13 ve 1.14 g / ml yerelleştirilmesine. <img src="/files/ftp_upload/2044/2044fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 F., İmmünoblotting tularensis sakaroz yoğunluğu gradyanlar. Sıralı kesirler gradyanlar ve yoğunluğu (g / ml), refraktif indeksleri dayalı hesaplandı toplanmıştır. Proteinler, SDS-PAGE ile ayrılmış nitroselüloz transfer ve OMP ve IMP fraksiyonasyon algılamak için immunoblotted. mw, boyutları (kDa) her leke sol tarafında not ile molekül ağırlığı standartları prestained. F. LVS, tüm hücre lizatları tularensis LVS. Ilgili sukroz gradient fraksiyonu yoğunlukları kendi şerit yukarıda belirtilmiştir. Sol kenar boşluğu belirtildiği gibi OMPs ve IMPS, poliklonal, Monospesifik antiserumlar ile tespit edildi. F. Benzer sonuçlar elde edilmiştir tularensis SchuS4.

<ol><li>Price, C. A. Centrifugation in density gradients. , Academic Press. 335-335 (1982).</li>
<li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> J Biol Chem. 247 (12), 3962-3962 (1972).</li>
<li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+outer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation of outer membranes.</a> Methods Enzymol. 235, 225-225 (1994).</li>
<li>Mizuno, T., Kageyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> J Biochem. 84 (1), 179-179 (1978).</li>
<li>Huntley, J. F., Conley, P. G., Hagman, K. E., Norgard, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Francisella+tularensis+outer+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Francisella tularensis outer membrane proteins.</a> J Bacteriol. 189, 561-561 (2007).</li>
<li>Huntley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+outer+membrane+proteins+protect+mice+against+pulmonary+challenge+with+virulent+type+A+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis.</a> Infect Immun. 76 (8), 3664-3664 (2008).</li>
<li>Bevanger, L., Maeland, J. A., Naess, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agglutinins+and+antibodies+to+Francisella+tularensis+outer+membrane+antigens+in+the+early+diagnosis+of+disease+during+an+outbreak+of+tularemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Agglutinins and antibodies to Francisella tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia.</a> J Clin Microbiol. 26 (3), 433-433 (1988).</li>
<li>Hubalek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+proteome+database+of+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Towards proteome database of Francisella tularensis.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 149-149 (2003).</li>
<li>Pavkova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Francisella+tularensis+live+vaccine+strain%3A+proteomic+analysis+of+membrane+proteins+enriched+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Francisella tularensis live vaccine strain: proteomic analysis of membrane proteins enriched fraction.</a> Proteomics. 5 (9), 2460-2460 (2005).</li>
<li>Sandstrom, G., Tarnvik, A., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunospecific+T-lymphocyte+stimulation+by+membrane+proteins+from+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis.</a> J Clin Microbiol. 25 (4), 641-641 (1987).</li>
<li>Sjostedt, A., Tarnvik, A., Sandstrom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T-cell-stimulating+17-kilodalton+protein+of+Francisella+tularensis+LVS+is+a+lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The T-cell-stimulating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein.</a> Infect Immun. 59 (9), 3163-3163 (1991).</li>
<li>Twine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Francisella+tularensis+proteome%3A+low+levels+of+ASB-14+facilitate+the+visualization+of+membrane+proteins+in+total+protein+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Francisella tularensis proteome: low levels of ASB-14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts.</a> J Proteome Res. 4 (5), 1848-1848 (2005).</li>
</ol>

Bu protokol bir spheroplasting, osmotik lizis değişimi ve sakaroz yoğunluk gradient santrifüj diğer hücre bileşenleri 2, 3, 4 fiziksel ayırma ve Gram-negatif bakteriyel OMS zenginleştirilmesi için &quot;altın standart&quot; açıklamaktadır. Daha önce hem Türü OMS izole etmek için bu yöntemin uygulama açıklanan Oysa F., A ve B Tipi suşları tularensis 5, bu tanıtımı OM izolasyonu için daha detaylı ve optimize edilmiş bir prosedür sunmaktadır . Gerçekten de, bu ölümcül patojen potansiyel yüzey maruz kalan ve olası virülans faktörlerinin belirlenmesi için önemli bir ilerlemedir. Bu prosedürün önemini öldürücü bir F. karşı önemli bir koruma sağladığı saflaştırılmış OMPs farelerde bağışıklama gösteren laboratuvar çalışmalarda gösterilmiştir tularensis pulmoner sorun 6. Bakteri hücreleri, osmotik lizis sırasında dikkatle izlenmesi ve membran pelet nazik tabanda Yukarıda da belirtildiği gibi, büyüme aşamasında bu membran ayırma işlemi başarı / başarısızlık ile ilişkilendirmek için kritik adımlar. Optimize edilmiş bu yöntem, titiz ve deneysel değişkenlik tabi iken, ortaya çıkan OMS deterjan kullanımı, lityum klorür, sodyum karbonat, 7, 8, 9, 10, 11 aldı, bu gibi dikkat çekecek derecede gelişmiş saflık gibi görünüyor. 12.

<table><tbody><tr><td>Donör buzağı serumu</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>IsoVitaleX</td><td>BD Biosciences</td><td>211876</td><td></td></tr><tr><td>Cellgro moleküler derece dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>38.5 ml polikarbonat şişe</td><td>FiberLite</td><td>010-0514</td><td></td></tr><tr><td>F50L-8x39 ultrasantrifüj rotoru</td><td>FiberLite</td><td>096-087051</td><td></td></tr><tr><td>Complete mini EDTA-free proteaz inhibitör kokteyli</td><td>Roche Group</td><td>04693132001</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>DC protein analizi</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear 14x95mm santrifüj tüpleri</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>344060</td><td></td></tr><tr><td>SW-40Ti salıncak kova rotoru</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>Abbe masaüstü refraktometre</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-964-10</td><td></td></tr></tbody></table>

yalıtım için yöntem francisella tularensis dış membranlar

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Francisella tularensis Gram-negatif, hücre içi coccobacillus ve zoonotik hastalık tularemi etkeni . Diğer bakteriyel patojenler, son derece düşük bulaşıcı doz (&lt;10 CFU), hızlı hastalığın ilerlemesi, ve yüksek morbidite ve mortalite oranları Francisella öldürücü suşlar roman virülans faktörleri kodlamak öneririz ile karşılaştırıldığı zaman. Yüzey maruz kalan moleküller, yani dış membran proteinleri (OMPs), bakteri barındırmayan bağlayıcı hücre, giriş, hücre içi sağkalım, virülans ve bağışıklık kaçakçılığı teşvik etmek için ortaya konmuştur. OMPs eğitim için önemi daha da bakteriyel hastalıklara karşı koruyucu aşılar olarak hizmet gerçeğinin altını çiziyor. OMPs gram-negatif bakteriler, santrifüj ve / veya deterjan çıkarımı izledi hücrelerinin sonication dahil olmak üzere toplu membran çıkarma teknikleri aracılığıyla elde edilebilir Oysa, bu hazırlıkların çoğu periplazmik ve / veya sitoplazmik (iç) membran (IM) kirleticiler ile kontamine olmuş. Yıl boyunca, gram-negatif IM ve dış membran biyokimyasal ve biyofiziksel ayrılması için &quot;altın standart&quot; yöntemi (OM), sakaroz yoğunluk gradiyenti santrifüj spheroplasting ve osmotik lizis tabi bakteri olmuştur. Sukroz gradient katmanlı, OMS, batmaz yoğunlukları farklılıklar dayalı anlık mesaj ayrılmış OM lipopolisakkarid (LPS) varlığını büyük ölçüde esas olduğuna inanılan olabilir. Burada, biz, ayıklamak, zenginleştirmek ve F. izole etmek için titiz ve optimize edilmiş bir yöntem tarif tularensis dış membranlar ve bunlarla ilişkili OMPs.

Iç ve dış zarı ayırmak için bir protokol<em&gt; Francisella tularensis</em&gt; Spheroplasting, osmotik lizis ve sukroz yoğunluk gradiyenti Ultrasantrifügasyon.

Yalıtım için Yöntem Francisella tularensis Dış Membranlar

*Francisella tularensis*, Gram-negatif intrasellüler bir kokobasildir ve zoonotik bir hastalık olan tulareminin etkenidir. Diğer ... ile karşılaştırıldığında

Francis Cellis dış membran veziküllerinin ve bunlarla ilişkili dış membran proteinlerinin izolasyonu, bakteriyel hücrelerin ozmotik lizizi ile başlar. Logaritmik fazdaki bakteriler, deiyonize su ile yavaşça seyreltilmeden önce sırasıyla hipertonik sükroz, EDTA ve lizozim çözeltileri ile işlem görür. Elde edilen bakteri lizatları, hücresel kalıntıları ve parçalanmamış hücreleri uzaklaştırmak için düşük hızlı santrifügasyona, ardından membran veziküllerini çöktürmek için yüksek hızlı santrifügasyona tabi tutulur.Ardından, iç membran (IM) ve dış membran (OM) veziküllerini ayırmak amacıyla toplam membran vezikülleri sükroz yoğunluk gradyanlarına katmanlanır. OM vezikülleri, büyük ölçüde OM'deki lipopolisakkarit (LPS) varlığına dayandığı düşünülen yüzer yoğunluk farklarına göre IM veziküllerinden ayrılabilir. Sükroz yoğunluk gradyanlarından alınan ardışık fraksiyonların immünoblotlanması, iç membran proteinlerinin dış membran proteinlerinden mekansal olarak ayrıldığını göstermektedir. Merhaba, ben Dr. Michael Norgaard ve yanımda Dallas'taki UT Southwestern Tıp Merkezi Mikrobiyoloji Bölümü'nden Dr. Jason Huntley var.Bugün Dr. Huntley, Francisella celluli dış membranlarının ve bunlarla ilişkili membran proteinlerinin ekstraksiyonu, zenginleştirilmesi ve izolasyonu için bir prosedür gösterecek. Hücre içi bir bakteriyel patojen olan bu organizma için, dış membrana yerleşmiş ve potansiyel olarak yüzeye açığa çıkmış molekülleri incelemek amacıyla laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz. Yoğun bir günümüz var, hadi başlayalım.Bu prosedüre başlamak için, beraberindeki yazılı protokolde açıklandığı şekilde iki adet 500 mililitre FCI bakterisi kültürü hazırlayın ve büyütün. Bakteri kültürlerini çalkalayıcı inkübatörden çıkarın ve OD ölçümü için her kültürden bir mililitre alıkonun; büyümenin erken logaritmik fazındaki hücreler, 0,2 ile 0,4 arasındaki bir OD 600 değerine karşılık gelir. Kültürler istenen OD 600 değerine ulaştığında, optimal membran ekstraksiyonu ve izolasyon sonuçları elde edilir.Hücreleri toplamak için dört adet 250 mililitrelik santrifüj şişesi kullanarak kültürleri 15 degrees Celsius'de, 30 dakika boyunca 7, 500 Gs'de santrifüjleyin. Santrifüjden sonra, her bir santrifüj şişesindeki medya süpernatanını dikkatlice uzaklaştırın ve fazla büyüme ortamını temizlemek için şişeleri emici bir malzemeye sertçe vurun. Santrifüj işlemi tamamlandıktan sonraki 10 dakika içinde, her bir bakteri peletini beş millimolar triss pH 7.5 içinde 8.75 mililitre 0.75 molar sükrozda süspanse edin.Her bir pelet süspanse edildikten sonra, çözeltiyi küçük bir manyetik karıştırıcı çubuk içeren steril 250 mililitrelik bir erlene aktarın. Toplam 35 mililitre bakteri pelet süspansiyonu elde edene kadar işlemi dört bakteri peleti için de tekrarlayın. Hücre süspansiyonunu bir manyetik karıştırıcı üzerinde iyice ancak çok hızlı olmayacak şekilde karıştırın.Yavaşça karıştırırken köpürmeyi veya kabarcık oluşumunu önlemek için, 10 milimolar EDTA'dan 70 mililitreyi 10 dakika boyunca çözeltiye ekleyin. EDTA'nın yerel konsantrasyonlarının yükselmesini önlemek için pipet ucunu hücre süspansiyon seviyesinin altında tutun. EDTA'yı ekledikten sonra, çözeltiyi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, yavaşça karıştırmaya devam ederken, 200 µg/mL nihai konsantrasyona ulaşmak için 2 mg/mL'lik lizozim çözeltisinden 11 mL ekleyin. Lizozim çözeltisi eklenirken hücre süspansiyonunu karıştırmaya devam edin. Daha önce olduğu gibi, ucu hücre süspansiyonu seviyesinin altında tutun.Hücreleri, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca lizozim ile inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında, küçük bir manyetik karıştırma çubuğu ve 530 mililitre oda sıcaklığındaki hücre büyütme amaçlı moleküler dereceye sahip deiyonize su içeren steril bir litrelik erlenmayer hazırlayın.Hücrelerin inkübasyonu tamamlandığında, manyetik karıştırıcının yanındaki flask tabanında dinlenen hücre süspansiyonunu 25 mililitrelik bir pipet kullanarak ozmotik olarak liz edin; ardından hücreleri, 10 ila 15 dakika boyunca nazikçe karıştırarak bir litrelik flask içindeki suya yavaşça seyreltin. Bu adım zorlayıcıdır ve deneyin genel başarısı için kritik öneme sahiptir. Karıştırma hızı, hücre süspansiyonunu tamamen dağıtacak kadar hızlı, ancak köpürmeye veya kabarcık oluşumuna yol açmayacak düzeyde olmalıdır.Uygun karışımı sağlamak için manyetik karıştırıcı hızını yavaşça artırın. Seyreltme sürecini dikkatle izleyin ve hücrelerin lokal birikimlerini, hücre kümelerini ve hücre liflerini dağıtmak için gerektiğinde akış hızını ayarlayın veya balonu döndürün. Tüm hücreler eklendikten sonra, karışımı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin; inkübasyon sonunda, osmotik lizis solüsyonundan 40 milliliter'lik alikotları 50 milliliter'lik konik tüplere aktarın ve 10 degrees Celsius'ta 30 dakika boyunca 7, 500 Gs'de santrifüjleyin.Santrifügasyon sonrası sağlam hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için, her konik tüpten dikkatlice 27 ila 30 mililitre süpernatant alın ve süpernatantları steril bir litrelik bir erlenmayerde birleştirin. Birleştirilen süpernatanttan 25 mililitreyi 16 adet ultrasantrifüj tüpünün her birine aktarın ve dört derece Celsius sıcaklıkta, iki saat boyunca 200.000 G'de santrifüjleyin. Santrifügasyon tamamlanmadan 10 dakika önce.Modifiye membran resüspansiyon süspansiyon tamponunu hazırlayın. Lizis sonrası santrifüj edilen hücrelerin ardından, sekiz mililitre membran süspansiyon tamponunu, bir tablet EDTA içermeyen proteaz inhibitör kokteyli ve 375 ünite Benzonase ile steril bir tüpte birleştirip nazikçe karıştırın. Membran peletinin geri kazanımı aşamasına geçin.Lizlenmiş hücrelerin ultrasentrifüj işlemi tamamlandığında, süpernatantı dikkatlice dökün, ardından tüpleri emici bir malzemeye ters çevirin ve sertçe vurun. Fazla süpernatantı uzaklaştırmak için, görselleştirmeye yardımcı olması amacıyla her bir membran peletinin konumunu bir markörle işaretleyin. Sekiz membran peletini, her birine 600 µL modifiye membran resüspansiyon süspansiyon tamponu ekleyerek nazikçe resüspande edin.Membran peletlerini yeniden süspande etmek zordur. Bu nedenle, modifiye membran Resus süspansiyon tamponunu, pelet tüp duvarından ayrılana kadar nazikçe peletin üzerinden geçirmeye devam edin. Bu, deneyin genel başarısı için zorlayıcı ve kritik olan bir başka adımdır.Gerekirse, membran peletini tüp duvarından kazımak için mikropipet ucunu kullanın. Pipetleme yaparken köpürme veya kabarcık oluşumundan kaçının; aşırı kesme kuvvetleri, membran ayrılmasını engelleyen karışık hücre oluşumuna yol açacaktır. Her bir membran resüspansiyonunu sonraki sekizli tüp setine aktarın.Kalan peletleri nazikçe yeniden süspande edin ve tüm süspansiyonları steril bir tüpte birleştirin. Tüm 16 tüpteki membran peletlerini çıkardıktan sonra, her dört tüpü 600 µL modifiye membran Resus süspansiyon tamponu ile yıkayın. Yıkama işlemini her tüpün işaretli alanında yoğunlaştırın ve yıkama sıvılarını yeniden süspande edilen membranlarla birleştirin.Yıkama işlemini geri kalan tüpler için tekrarlayın. DNA'yı degrade etmek ve flokülan materyal miktarının azaltılmasına yardımcı olmak için membran resüspansiyonunu oda sıcaklığında, hafif sallama ile 30 dakika inkübe edin. Ardından, membran süspansiyonundan küçük bir miktar alın ve protein miktar tayini yapın.Toplam membran verimini belirlemek için, membran süspansiyonunun %2,5 SDS içinde bire bir ve bire üç seyreltmelerini hazırlayın; seyreltilmemiş bire bir ve bire üç membran süspansiyonlarını 90 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın. Ekstrakt edilen membranlardan O MPS'nin salınması için SDS ve ısı gereklidir. Membran resüspansiyon protein konsantrasyonunu miktar olarak belirlemek için BioRad DC protein analizini kullanın.Toplam protein verimi genellikle mililitre başına bir ile 1,6 miligram arasındadır. Membran preparatındaki protein konsantrasyonu belirlendikten sonra, örnekler bir sükroz gradyanında ayrılabilir. EDTA içinde bir dizi sükroz çözeltisi hazırlayarak başlayın.Lineer sakkaroz gradyanlarını hazırlamak için, bir bulb pipet kullanarak her bir sakkaroz çözeltisinden 1,8 mililitreyi 14 x 95 milimetrelik UltraClear ultrasantrifüj tüplerine sırasıyla %55, %50, %45, %40, %35 ve %30 olacak şekilde katmanlar halinde ekleyin. Ardından, her gradyanın üzerine 1,5 miligram membran resüspansiyonu ekleyin. Gradyan başına 1,7 mililitreden fazla membran resüspansiyonu yüklemeyin; her tüpü ayrı ayrı tartın ve tüm tüpler aynı ağırlıkta olacak şekilde membran resüspansiyonu ekleyerek veya çıkararak final ağırlığı dikkatlice ayarlayın. Sakkaroz gradyanlarını bir SW 40 TI salınımlı kova rotoruna yerleştirin ve 4 °C'de minimum 17 saat boyunca 256.000 g'de santrifüjleyin.17 saatlik santrifüj işleminin ardından, santrifüjü durdurun ve sükroz gradyanlarını rotordan dikkatlice çıkarın. Ardından, fraksiyonları toplayın. Sükroz gradyan tüpünün alt kısmını %70 etanol ile dikkatlice temizleyin.Ardından, tüpün altına 21 gauge iğne ile delik açın ve gradyentten sırasıyla 500 microliter'lik fraksiyonları steril mikrosantrifüj tüplerine toplayın. Sükroz gradyenti bozmamak için gradyentin yerçekimi akışıyla damlamasına izin verilmelidir. Ancak, gradyent tüpünün altından damlama durursa, parmak kullanılarak tüpün üst kısmına hafif bir basınç uygulanabilir.Son olarak, her bir sakroz gradyan fraksiyonunun kırılma indisini bir refraktometre kullanarak belirleyin ve kırılma indisini mililitre başına gram cinsinden spesifik yoğunlukla ilişkilendirin. Temsili sakroz gradyan fraksiyonlarının protein lokalizasyonunu SDS-PAGE ayrımı ve immünoblotlama ile değerlendirin. Burada, lizlenmiş Freis canlı aşı suşundan ekstrakte edilen membranların ayrılması için kullanılan sakroz gradyanından alınan fraksiyonların bir immünobloti yer almaktadır; Freis dış membran proteinleri veya OMP'ler, 1,17 ve 1,2 g/mL yoğunluklar arasında lokalize olmuştur.Karşılaştırmalı olarak, iç membran proteinleri veya ip'ler mililitre başına 1,13 ve 1,14 gramlık yoğunluklar arasında yerleşmiştir. FHU dört suşu için de benzer sonuçlar elde edilmiştir. Az önce, ozmotik liz ve sükroz yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjasyonu yoluyla Francis Cellis dış membran veziküllerinin nasıl ekstrakte edileceğini ve izole edileceğini gösterdim.Bu prosedür uygulanırken, ozmotik gliko aşamasında bakteriyel hücreleri deiyonize su ile yavaş ama tutarlı bir şekilde seyreltmek için büyümenin erken logaritmik fazlarındaki bakteriyel hücrelerin kullanıldığını hatırlamak ve ultrasantrifüj membran peletlerini yeniden süspanse ederken dikkatli olmak önemlidir. Bu, membran ayırma prosedürümüzü sona erdirmektedir. İzlediğiniz için teşekkürler ve gelecek deneylerinizde başarılar dileriz.

method-for-the-isolation-of-francisella-tularensis-outer-membranes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kaynak: Cian, M. B. et. al., Acinetobacter baumannii için Teknik Ayarlamalarla Gram Negatif Bakteriler için Hücre Zarfının İç ve Dış Zar Fraksiyonlarına Ayrılması. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, sükroz gradyan ultrasantrifüjleme kullanılarak Gram negatif bakterilerin iç ve dış zar fraksiyonlarının ayrılmasını göstermektedir. Membran fraksiyonları, membrana özgü bileşenlerin hedefli analizi için saflaştırılır ve düşük sıcaklıklarda saklanır.

Gram Negatif Bakterilerin İç ve Dış Zar Fraksiyonlarının Ayrılması

Kaynak: Watson, DC, et.al. Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Ölçeklenebilir İzolasyonu ve Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, genetiği değiştirilmiş bakterilerin dış zarından türetilen hücre dışı veziküllerin (EV'ler) izolasyonunu ve konsantrasyonunu göstermektedir. İşlem, EV'leri serbest bırakmak için bakterilerin kültürlenmesini, ardından hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için sıralı santrifüjleme ve filtreleme adımlarını içerir. Son olarak,...

Dış Zar Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Bakterilerden İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Kaynak: Jung, A. L. ve diğerleri. Legionella pneumophila Dış Zar Vezikülleri: Makrofajlarda Pro-inflamatuar Potansiyellerinin İzolasyonu ve Analizi. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, Legionella pnömophila'dan dış zar veziküllerinin (OMV) ardışık santrifüj, steril filtrasyon ve ultrasantrifüjasyon kullanılarak izole edilmesini göstermektedir. Zar proteinleri ve lipopolisakkaritlerle zenginleştirilmiş saflaştırılmış OMV'ler, konak-patojen etkileşim çalışmaları için uygundur.

Legionella pnömofila dış zar veziküllerinin ultrasantrifüj tabanlı izolasyonu

Bu iletişim kuralı boğaza aşılamalar Fischer 344 sıçan ile açıklar FRANCISELLA tularensis. Bu yordamı insanlar pulmoner maruz kalma bu potansiyel biothreat Ajan taklit eder ve aşı ve tedavi edici etkinliği pulmoner Tularemi karşı test etmek için kullanılabilir.

Boğaza aşılama, Fischer 344 farelerle FRANCISELLA tularensis

Bu yöntem, özellikle Staphylococcus aureusgibi kompleks ana kaynaklardan gelen eksojen yağ asitleri dahil etmek için bir çerçeve sağlar. Bunu başarmak için, tavuk yumurtası sarısı ve kütle spektrometresi kullanan bakteriyel fosfolipidlerin sonraki yağ asidi profillerinden lipoprotein parçacıklarının zenginleşmesi için protokoller açıklanmıştır.

Membran fosfolipidler içine bakteriyel patojen yağ asidi kuruluş çalışması için tavuk yumurtası sarısı lipoprotein parçacıklarının yalıtım

Mycobacterium tuberculosis düşük demir koşullarına yanıt olarak ekstrasellüler üretimi ve salınımını gösterir. Bu çalışma, demir eksikliğine yanıt olarak salınan mikobakteriyel ekstrasellüler saflaştırma ve karakterizasyonu için düşük demir koşulları ve yöntemleri oluşturmak için bir protokol ayrıntıları.

Demir sınırlı Mycobacteria tarafından üretilen Ekstrasellüler Veziküllerin İzolasyon ve Karakterizasyonu

Gram-negatif bakteriler iki mekansal olarak ayrılmış membran üretirler. Dış zar bir periplazm ve peptidoglikan tabakası ile iç zardan bölümlenir. Bu mikropların çift iki katmanlı izole yeteneği fizyolojisi ve patogenezini anlamak için kritik olmuştur.

Gram-negatif Bakteriler için Hücre Zarfının İç ve Dış Membran Fraksiyonlarına Ayrılması Acinetobacter baumannii için Teknik Ayarlamalar

Bakteriler, biyoaktif biyolojik moleküller taşıyan nanometre boyutunda hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılarlar. EV araştırması, biyogenezlerini, mikrop-mikrop ve konakçı-mikrop etkileşimlerindeki rollerini ve bunların potansiyel terapötik uygulamalarını anlamaya odaklanmaktadır. EV araştırmalarının standardizasyonunu kolaylaştırmak için EV'lerin çeşitli bakterilerden ölçeklenebilir izolasyonu için bir iş akışı sunulmaktadır.

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Bu protokol, Mycobacterium tuberculosis hücre dışı veziküllerini kültür süpernatantlarından zenginleştirmek için kolay ve tekrarlanabilir bir teknik olan boyut dışlama kromatografisini tanımlar.

Mycobacterium tuberculosis Boyut Dışlama Kromatografisi ile Hücre Dışı Vezikül Zenginleştirme

Bu protokol, bireysel iyon kanallarını izlemek ve desteklenen lipit membranlarındaki aktivitelerini belirlemek için TIRF mikroskopisinin nasıl kullanılacağını açıklar, böylece yanal membran hareketi ile kanal fonksiyonu arasındaki etkileşimi tanımlar. Membranların nasıl hazırlanacağını, verilerin nasıl kaydedileceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini açıklar.

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Bu protokol, çözünmeyen hücre duvarı ve zar proteinlerini, izoelektrik noktaya dayalı hazırlayıcı izoelektrik odaklama (IEF) kullanarak basit fraksiyonlara (1-5 protein) ayırır ve ardından moleküler ağırlığa göre ayırır. Elde edilen fraksiyonlar, daha fazla saflaştırma olmaksızın doğrudan immünolojik ve proteomik analiz için kullanılabilir.

Hücre Duvarı ve Hücre Zarı Proteinlerinin Aşağı Akış Protein Analizi için Mycobacterium tuberculosis'ten Ayrılması ve Fraksiyonlanması

Öğrenin, Francisella tularensis dış membran veziküllerini osmotik liziz ve süroz yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjasyonu ile izole etme yöntemini. Bu protokol, bakteri virülansı ve aşı hedefleri araştırmaları için kullanılır.

Yalıtım için Yöntem Francisella tularensis Dış Membranlar

Daha fazla video keşfet