Name: Fare önbeyin içine Ultrason Rehberliğinde Mikroenjeksiyon In Utero E9.5 az (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Öğrenin fare önbeynine ultrason rehberliğinde retroviral vektör mikroenjeksiyonu yöntemini. Bu teknik gen ifadesi manipülasyonu ve nörogenez öncesi gelişimsel nörobilim araştırmaları için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bölüm 1. Cerrahi Alan hazırlayın <ol><li> Biyolojik tehlikeli reaktifler (örneğin retroviral vektörler) ile çalışıyorsanız, ameliyat, bir Biyogüvenlik II kabini (BSC) içinde yapılmalıdır. BSC içinde transdüser ultrason geri yansıma mikroskobu (UBM), BSC yanında oturur, ve özel olarak tasarlanmış bir cerrahi sahnede bir motor kontrollü desteği ile yerinde tutulur. On line video gösterildiği sahne oluşturmak için gerekli bileşenleri listelenmiştir. Bu liste, çeşitli açılarda (istek üzerine) sahne görüntüleri ile birlikte, inşaat izin vermelidir. </li><li> Laparotomi açılış ve kapanış (karın boşluğu, iç organlar erişime izin vermek için açık kesilir cerrahi işlem), genellikle plastik desteğiyle bir emici ped üzerine yapılır. Ameliyat öncesinde tüm gerekli araçları (örneğin, jilet, cerrahi makas, forseps, yüklü AutoCLIP uygulayıcısı, vb) ve malzeme (örneğin PBS, dikiş, anestezi, fare tutucu ve örten plaka, vb.) Sterilize edilmiş ve yerleştirilmiş olmalıdır cerrahi alan. Kesi açıktır süreyi sınırlandırılması cerrahi ile başarı şansı maksimize etmek için önemlidir. Bütün hayvan işleme çözüm MB-10 veya eşdeğeri ile dezenfekte edilmiş eldiven ile yapılmalıdır. Tekrarlanan dezenfeksiyonu, steril eldiven sağlamak için gerektiği gibi yapılmalıdır. </li></ol> Bölüm 2. Fare Anestezi <ol><li> 1 cc şırınga, 1 kısım Nembutal (50 mg / ml pentobarbital) PBS içinde 25 mg / ml magnezyum sülfat sterilize süzülmüş 4 parça içeren anestezik solüsyonu ile doldurun. 10 mg / mg / ml magnezyum sülfat pentobarbital ve 20 ml'lik bir çözüm neden olacaktır. Her fare bireysel ağırlıklı, ve vücut ağırlığı pentobarbital kg 90 mg ile enjekte edilmelidir (örneğin, 28 gram fare, 250 mcL ile enjekte edilir). </li><li> Cilt ve karın kas hem penetran karın hamile bir fare embriyonik gün (E) 9.5 (intraperitoneal, ip) (gerektiği gibi diğer yaşları kullanabilirsiniz) içine enjekte edilir. Fare için 8-12 dakika sigara duyarlı olmaya izin ver. Yeterli anestezi hayvanın rahat bir duruş tarafından onaylandıktan sonra, kuyruk ve ayak tutam yanıt olarak hareket azlığı olmalıdır. Hafifçe parmak tırnakları arasındaki kısma çok hassastır ve herhangi bir yanıt gibi pinching eksikliği, hayvanların yeterli anestezi olduğunu gösterir. Kuyruk ve ayak tutam tamamen tepkisiz olan hayvanlar, hatta bazı zamanlar ilk cerrahi kesi yanıt biraz seğirme unutmayın. Ancak, bu refleksif bir tepki ve yetersiz anestezi anlamına gelmez. Ameliyat sırasında kurumasını önlemek için petrol bazlı oftalmik melisa fare gözler için uygulanmalıdır. </li><li> Fare anestezi olmak için beklerken set-up cerrahi alan ve ultrason makinesi. Retrovirüs veya lentivirüs kullanımını gerektirir BSL2 çevreleme, viral enjeksiyonları yukarıda belirtildiği gibi bir Biyogüvenlik II Kabinesi yapılmalıdır. Buna ek olarak, virüs ile temas gelen tüm çözümler ve tek kullanımlık malzemeler,% 10 çamaşır suyu çözeltisi ile dekontamine edilmelidir. MB-10 (sterilizasyon solüsyonu ile tedavi edilmelidir cerrahi aletler ve ultrason cihazları <a href="http://www.quiplabs.com/mb10.htm">http://www.quiplabs.com/mb10.htm</a> ), ya da söz konusu tesisi tarafından kullanılan bir eşdeğer. </li></ol> Bölüm 3. Embriyolar, Pozlama <ol><li> Mümkünse verilen hayvan tesis ve kullanılabilir alan kısıtlamaları bağlı cerrahi alan ayrı bir yerde cerrahi hazırlık alanı olduğu için tercih edilir. Bu hayvanlar arasında çapraz kontaminasyon olasılığını en aza indirecektir. Ameliyat başlatmak için, hayvanın sırtına steril emici bir yüzeye yerleştirin ve karın bölgesinde% 70 etanol ile iyice yıkayın. Daha kapsamlı cerrahi öncesi tedaviler (örneğin, ardışık Betadine mermi ve% 70 etanol yıkar) istihdam, ancak deneyimlerimiz bu kemirgen sağkalım cerrahi bu tür için gerekli değildir olabilir. Bir çift kenar jilet kullanarak, karın yaklaşık 1 inç genişliğinde ve 1,5 santim uzunluğunda bir alanda saç tıraş. Yaklaşık 45 derecelik bir açıyla, ustura ile kısa hızlı hareketleri kullanın. Cerrahi alanında uygun şekilde tedavi edilmesi önemlidir, ama aşırı ıslatma tabi değil, bu hayvanın gereksiz tüyler ürpertici neden olabilir ve hatta hipotermi. </li><li> Ince cerrahi makas kullanarak hayvan (ikinci bir kesi ile yardımcı olacaktır bağ dokusu ile kesme, kas cilt tutan) karın kas yoluyla ilk olarak deri yoluyla 1 "longitudinal kesi yapmak. Not prosedürü bakım boyunca cerrahi aletler steril kalır ve gerektiği gibi araç ipuçları non-ste ile temas gelirsen dezenfektan ile tedavi (yani yapılan olmalıdır sağlamak için alınacak) malzeme rile. </li><li> Kullanarak forseps rahim boynuzları dikkatle çizmek ve her iki tarafta embriyo sayısı kaydetmek. Hayvan geri uterin boynuz en fazla iki komşu maruz kalan embriyoların (iki her iki tarafta yapılandırma bağlıdır hangi seçim), yerini terk ederken. Annesi onu geri kalırken, bu bağlamda, iki embriyo belli bir süre maruz ve PBS içinde yıkanıyor. </li><li> (Figure1A) ameliyat sırasında nerede olacak pleksiglas sahibinin sırtında hayvan koyun *. Sonra, bir çift yeşil silastik membran (L RTV silikon kauçuk tabanı kullanılarak yapılan ve üzerinden biraz yerleştirilir forseps, anne üzerinde aşağı düşük (kullanmak için önce MB-10 ile dezenfekte edilmelidir) 10cm doku kültürü çanak ** kür ajanı; Dow Corning ürün numaraları sırasıyla 3142761 ve 2156946). Hayvan üzerinde plaka aşağıya düşürmek gibi, rahim dokusu enjekte edilecek iki embriyo arasında kavrama forseps kullanımı, ve nazikçe onları zarından çekin. Aynı zamanda, plaka sahibinin üzerine tamamen aşağı indirdi ve raptiyeler bir yerde tutmak için itilir. Önceden ısıtılmış (37 ° C) PBS embriyolar daha sonra tamamen kapsayacak şekilde çanak eklenir. </li><li> Maruz kalan embriyoların rahim duvarına (Figure1B) üzerinden gerçek zamanlı görüntü oluşturmak için ultrason probu (Figure1A) altındaki hayvan ve maruz kalan embriyoları içeren enjeksiyon aşamasında yerleştirin. Prob daha sonra PBS banyoya (motorlu kontrollerini kullanarak) doğrudan yansıması embriyolar üzerinde düşürülür. Probu yaklaşık 2-3 mm uzaklıkta embriyolardan görüntüler elde edilebilir. Bu görüntüleri toplamak için ileri ve geri dolaşacaktır sondadan embriyoların isabet etmediğini emin olmak için çok önemlidir. </li></ol> * Annesi ameliyat sırasında aittir tutucu bir makine atölyesi tarafından kolayca yapılabilir. Bu, üst üste yapıştırılmış iki pleksiglas iki tarafla da geniş bir pleksiglas tabanı, ve aralarında bir boşluk (fare için yeterince geniş sırtında yatarken sığdırmak için) içermelidir. Taraflar, daha sonra siyah balmumu (diseksiyon tepsiden) ile dolu bir vadi zemini, olmalıdır. O balmumu raptiyeler embriyoların enjeksiyon sırasında yıkanmış olduğunu PBS plaka basılı basıldığında içine malzeme olarak hizmet vermektedir. : ** 10cm bakteriyel yemekler alt merkezi (Heavy Duty Taşınabilir Punch ve inci 13/16 inç dairesel kalıp ile yapılabilir delikli bir delik (çapı yaklaşık 2 cm) olmalıdır <a href="http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm">http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm</a> ). Buna ek olarak, orta deliğin (uzakta yaklaşık 1.5cm) her iki tarafında iki küçük delik bir alev ısıtılmış iğne (ya da tabii bir matkap ile yapılmış olabilir) ile yanmış olmalıdır. Bu delikler daha sonra vakum yağ ile kaplıdır ve plaka sahibinin üzerine tutun raptiyeler aracılığıyla siyah mum içine itmek olacaktır. Vakum gres PBS dışarı sızmasını önlemek için. Bölüm 4. Mikroenjeksiyon İğne içine Virüs Yükleme <ol><li> Bir 1mm (iç çapı) pah Moda mikroenjeksiyon iğne, cam kapiller çekti. Iğne keskinliğini kritik ve yeterince keskin bir iğne ile çalışan amnionic kesesi, rahim duvarı ve penetrasyonu ciddi tehlikeye sokabilir ve deneysel yetmezliğine yol açabilir. Bilenmiş iğne daha sonra boru üzerinden manuel bir infüzyon / çekme pompası (diğer cihazlar iğne yükleme ve boşaltma düzenlemek için kullanılan, ancak bu ne monte edilmiş 25 mcL mikroenjektör bağlı pipet tutucu, içine yerleştirilir video gösterilir). Mikroenjektör, tüp ve iğne en iyi yanıt (bir hava dolu sistemi ile ilgili genişleme ve sıkıştırma önlemek için) için, mineral yağ ile doldurulması gerekir. </li><li> Önce iğne yükleme şırınga sistem hiçbir hava kabarcıkları iğne ucu kadar tüm yol vardır emin olun. Sonra virüs yükü başlamadan önce iğne (1-2 mm uzunluğunda) küçük bir hava kabarcığı geri çekmek. Bu hava cebi virüs ve madeni yağ arasındaki mesafeyi korumaya yardımcı olur. Enjekte edilecek viral stoku son bir 0.08 mg / ml konsantrasyonu (virüs üretimi konusunda daha fazla bilgi için kaynak 1, 2 bakınız) polybrene içermelidir. Titresi 10 kat damlasına kadar konsantre retroviral stokları genelde bulaşıcı malzeme çoğunluğu içeren partikül madde, önemli miktarda içerir ve bu yüzden 5 olmadan filtre olamaz. Ayrıca, hazırlık bağlı olarak, viral stok parçalanmış ambalaj hücrelerin genomik DNA (özellikle doğrudur MLV / VSV pseudotyped virüs üretmek için 293 hücreleri kullanılarak,) viskoz olabilir. Virüs kısım viskoz ise, küçük bir miktarda DNAz ve stok gevşetmek için ilave edilmelidir, ya da yükleme iğne son derece zor olacaktır. A viral stok (8-10 mcL) damlacık iğne yükleme için hazırlık parafilm steril bir parçası üzerinde yer almalıdır. Daha sonra, geri çekilmesi pompa kullanarak, takunya önlemek için dikkatli bir şekilde iğne ödeme dikkat yük. Embriyoların iğne veya ultrason probu kırmak için değil dikkatli olmak yüklenen iğne, enjeksiyon alanında mikromanipülatör konuma yerleştirin. Not iğne enjeksiyon oluşmaya önce bazı nedenlerden dolayı önemli ölçüde yüklü ise enjeksiyon başlamadan önce taburcu edilebilir ucu içine küçük bir miktar hava çekmek için yararlı olabilir. Bu hava boşluğuna iğne ucu (hemen hemen her zaman bu yüklü bir iğne yararsız hale getirecek bir olay) viral stok kuruma karşı koruyabilirsiniz. </li></ol> Bölüm 5. Ultrason Rehberli Viral Enjeksiyon <ol><li> , Ultrason probu ile oluşturulan gerçek zamanlı görüntü, video monitör görüntülenmiştir ve embriyo içine mikroenjeksiyon iğne rehberlik etmek için kullanılabilir. , Bu sistemi virüsü kullanarak E8.5 amniyon kesesi içine enjekte veya E9.5-E11.5 (Figure1B) amniyotik kese veya ventriküler sistemi olabilir. Bu prosedürün en zor parçası olan ve (araştırmacı bağlı olarak 5-20 saat sipariş üzerine) usta eller deneyim önemli bir miktarda gerektirir. Ekranda parlak nokta olarak ultrason görüntüsünü iğne ucu açıktır, y ve z düzlemleri motorlu kontrollerini kullanarak prob pozisyon ayarlamaları (uygun hareket görülebilir ve x manuel kontrol düzlemi). Bu prob salınım yönü iğne uzunluğu paralel olması büyük önem taşımaktadır. Bu hareketleri sırasında embriyo içine enjeksiyon için iğne ucu konumlandırmak için görüntü düzlemi kalmasını sağlayacaktır. </li><li> Embriyo, hedef bölge (Bu durumda, ön beyin ventrikül) kolayca görünür ve öyle ki yerleştirilmiş iğne rahim malzemenin en az enjeksiyon yolu ile ulaşılabilir olmalıdır. Buna ek olarak, plasenta yoluyla enjekte etmek için kritik öneme sahiptir. Hedef beyin bölgesi iğne ilerleme yönü (mikromanipülatör düğmeyi kullanarak) ile kaplı olduğu, iğne rahim duvarına dokunmadan olmalı ve daha sonra kısa bir hızlı aşısı ileri dokuya nüfuz gerekir. Benzer bir yaklaşım amnionic kese ve beyne nüfuz etmek için kullanılır. Bazı durumlarda, özellikle iğne çok keskin ve deneyimli araştırmacı, tek bir hareket ventrikül vurabilir. Mekanik, hareketli prob, iğne ve embriyolar (anne sahnede hareket ettirerek), pratik eğitim master gerektirir. </li><li> İstenilen sayıda embriyo enjekte edildikten sonra, 5.0 ipek sütürler ile karın duvarına yakın. Sütür mekaniği bu tip ameliyatlar özgü değildir. Son olarak, karın kas dikiş üzerinde birlikte cilt zımba veteriner autoclips kullanmak. Fare dikiş çiğnemek, çünkü cilt dikilmesi tavsiye edilmez. Analjezi uyanır gibi fare ile ağrının miktarını azaltmak için kesi bölgesine uygulanmalıdır. % 0.25 bupivakain solüsyonu (0.8 ml / kg veya 2 mg / kg) subkutan kesi boyunca her birkaç milimetre enjekte edilmesi tavsiye edilir. </li><li> Fare kurtarır ederken yavaşça temiz bir kafes içinde bir jel paketi (beslenme ve hidrasyon kolaylaştırmak için) içeren emici kağıt üzerinde hayvan yatıyordu. 37 slayt sıcak setine kafes yerleştirin ° C vücut ısısını korumak için. Uyandığı zaman, temiz bir kafesin içine fare ve jel paketi ve hayvan raf dönün. </li><li> Ertesi gün bütün bunlar kürtaj gösterir herhangi bir vajinal kanama, karın kasılmaları, ve / veya genel bir sıkıntı bakmak için fareyi kontrol edin. Bu durumda, hemen fare euthanize. Bakımlı saç ve genel bir sağlıklı görünümünü cerrahi başarılı kurtarma göstermektedir. Enjekte edilen embriyoların daha fazla analiz için embryonically veya postnatal kurban edilebilir. Virüs gibi insan alkalen fosfataz (PLAP) veya GFP gibi bir muhabir gen, ifade, bir boyama pozitif viral enfeksiyon (Figure1C) alanları ortaya koyacaktır. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Enjekte embriyolar 1-2 gün yetişkinliğe enjeksiyon yolu feda edilebilir. Virüs PLAP veya GFP gibi bir muhabir gen, ifade, o muhabir ifade viral enfekte olmuş hücreleri ve bu hücrelerin klonları tanımlamak için hizmet vermektedir. Örneğin, Şekil 1C gösterilen retroviral vektör ifade PLAP E9.5 in utero bulaşmış olan bir postnatal beyin doku bölümü. Enfekte hücreler sonra mor kümeler histokimyasal boyama olarak görünür. Viral enfekte hücreler tespit ek olarak, muhabir ifadede bir hücre morfolojisi ve pozisyonu yanı sıra, gen ekspresyonu durumunu incelemek için olanak sağlar. nt "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2047/2047fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 E9.5 fare önbeyin ventriküller içine Viral enjeksiyon. A. anestezi hayvan enjeksiyon sahnede yer alır. Iki embriyo (ok) ultrason probu altında maruz kalan ve yerleştirilmiş olacaktır. Virüs dolu mikroenjeksiyon iğne embriyolar yakınında ve ultrason probu ile dizilmiş. B. Ekran E9.5 fare embriyo gerçek zamanlı ultrason görüntüsü yakalama. V, ventrikül;; UW AS, amniyon kesesi, rahim duvarına. C. Embriyolar E10.5 bir PLAP ifade virüs enjekte edildi. PLAP için histokimyasal boyama, viral enfeksiyon olayların yerini ortaya koymaktadır.

<ol><li>Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-titer+pseudotyped+retroviral+vectors+with+very+broad+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range.</a> Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).</li>
<li>Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li>
</ol>

Amniyotik kese ve ventriküler sistemi E9.5-E11.5 enjekte edilebilir ultrason eşliğinde sadece amniyon kesesi E8.5 enjekte edilebilir E8.5-E11.5, Viral enjeksiyonları yapılabilir. Doğru yapıldığında, ultrason eşliğinde ventriküler sistemi enjekte viral parçacıkların bu nedenle, ön beyin (neokorteks, bazal ganglionlar, diensefalon, göz, vb), orta beyin çeşitli yapılar bulaşabilir, ventriküler sistemi döşeyen hücrelere ve ve arka (Figure1C). Amniyon kesesi içine enjekte Virus embriyonun dış hücrelere erişim vardır. Virüse karşı ek olarak, ultrason rehberliği de gelişmekte olan embriyo hücreleri enjekte etmek için kullanılacak. Bu nedenle, bu teknik bir deney tasarımı (gelişimsel süre, yapı, virüs / hücreleri) seçim için birden fazla seçenek sağlar. Enjekte virüs veya hücreleri enfekte / enjekte edilen hücrelerin kolay tanımlama için bir muhabir ifade kritik öneme sahiptir. Tarihsel olarak, insan plasental alkalen fosfataz (PLAP) veya GFP kullanılmaktadır. Deneyim, biz PLAP histokimyasal ve immünohistokimyasal hem keskin ve belirgin bir tek hücre, hücre morfolojisi ve pozisyon analiz etmek için izin veren leke ve klonal bir analiz yapmak için verimleri nedeniyle PLAP çok yararlı bir muhabir gen olabilir bulduk. Viral GFP ifade soluk olabilir, GFP muhabiri doku boyama için ideal olmayabilir, ama bir tek hücre floresan aktif hücre sıralama (FACS) elde etmek istiyorsa yararlıdır.

&quot;Aşağıdaki ultrason geri yansıma mikroskoplar biri kullanılmasına rağmen video Paradigma-Tıbbi P40, P40, artık ticari olarak kullanılabilir. Bu prosedür için kullanılan olabilir, P60, benzer fiyatlı ve yerini almıştır aynı uygulama için kullanılır. Paradigma-Tıbbi cihaz (lar) ile kullanmak için, sahne yapımı için açıklanan ek malzeme. Vevo 2100 küçük hayvan görüntüleme donanımları ile birlikte gelir. <ol><li> P60 Paradigma Medikal Ultrason BioMicroscope (UBM) ( <a href="http://www.paradigm-medical.com/ubms.html">http://www.paradigm-medical.com/ubms.html</a> ). </li><li> VisualSonics gelen Vevo 2100 ( <a href="http://www.visualsonics.com/">http://www.visualsonics.com/</a> ) </li></ol> Anestezik ve analjezik Bulter Schein Hayvan Sağlığı (pentobarbital 50 mg / ml enjektabl sodyum; Abbott laboratuarları tarafından üretilen) Nembutal bir çözüm elde edilebilir. Not bu bir program II kontrollü madde ve Uyuşturucuyla Mücadele Ajansı (DEA) elde etmek için lisans gerektirir. Bupivakain solüsyonu (% 0,25; diğerleri arasında Hospira, Inc tarafından üretilen), Moore Tıp da dahil olmak üzere, distribütörlerin bir dizi elde edilebilir.

fare önbeyin içine ultrason rehberliğinde mikroenjeksiyon in utero e9.5 az

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Utero sağkalım cerrahisinde farelerde gen ekspresyonu gelişimi sırasında moleküler manipülasyon izin verir. Ancak rahim duvarına erken embriyogenez sırasında opak çünkü, mikroenjeksiyon için embriyonun belirli bölümlerine hedef yeteneğini büyük ölçüde sınırlıdır. Neyse ki, yüksek frekanslı ultrason görüntüleme, görüntüleri gerçek zamanlı olarak kullanılabilir ilgi embriyonik bölgeye mikroenjeksiyon iğne kılavuzu nesil izin verir. Burada embriyonik gün fare önbeyin ventriküler sistemi (E) 9.5 retroviral vektörlerin enjeksiyon rehberlik etmek gibi görüntüleme kullanımını tanımlamak. Bu yöntem rahim boynuzları erişim, görüntülü ve enjekte edilir, tuzlu su içinde banyo yapıyor olmak, ev sahibi embriyolar izin veren bir özel olarak tasarlanmış bir plaka izin vermek için laparotomi kullanır. Başarılı ameliyatlar genellikle çoğu veya enjekte edilen tüm embriyoların ilgi sonraki herhangi bir zaman noktasında (embryonically veya postnatal) hayatta neden olabilir. Burada açıklanan ilkeler E8.5 embriyoların amnionic sıvısı (nöral tüp, henüz kapatılmamış olan anterior posterior ölçüde boyunca böylece enfeksiyon izin) içine enjeksiyon hafif değişiklikler yapmak için kullanılabilir, veya ventriküler sistemi içine E10.5/11.5 az beyin. Ayrıca, nörojenik orta yaşlarda (~ E13.5), ultrason görüntüleme, viral enfeksiyon ya da hücre nakli için özel beyin bölgeleri içine direkt enjeksiyon olabilir. Farelerde utero enjeksiyonları kılavuzu ultrasonografi kullanımı, aksi takdirde son derece zor imkansız olmasa da olurdu yollarını fare embriyoları moleküler ve hücresel bir manipülasyon izin derece güçlü bir tekniktir.

Utero sağkalım cerrahisinde farelerde gen ekspresyonu gelişimi sırasında moleküler manipülasyon izin verir. Burada, yüksek frekanslı ultrason görüntüleme embriyonik gün fare beyin (E) 9.5 retroviral vektörlerin enjeksiyon kılavuzunu kullanımı açıklanmaktadır.

Fare önbeyin içine Ultrason Rehberliğinde Mikroenjeksiyon In Utero E9.5 az

Farelerde utero hayatta kalma cerrahisi, gelişim sırasında gen ekspresyonunun moleküler manipülasyonuna olanak tanır. Ancak, rahim duvarı opak olduğu için...

Bu prosedürün genel amacı, fare ön beyninde nörogenez başlamadan önce retroviral vektörleri bu bölgeye iletmektir. Bu yöntem, germinal zon hücrelerinin ilgi duyulan genlerle transduksiyonuna olanak sağlayacaktır. Bu yöntem kullanılarak diğer viral vektörler veya hücreler de enjekte edilebilir.Bu işlem, öncelikle anestezi uygulanmış gebe bir fareye, embriyolara erişim sağlayan bir laparotomi yapılarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, gebe fareyi ultrason dönüştürücüsünün altındaki enjeksiyon tablasına yerleştirmektir. Ardından embriyolar, enjeksiyon için plaka üzerine konumlandırılır.Prosedürün üçüncü adımı, mikroenjeksiyon iğnesini enjeksiyon hedef bölgesine yönlendirmek için gerçek zamanlı ultrason görüntüsünü kullanmaktır. İstenilen sayıya ulaşana kadar embriyolara seri şeklinde enjeksiyon yapılır. Prosedürün son adımı, fareyi enjeksiyon düzeneğinden çıkarmak ve vücut duvarı, kas ve ciltteki insizyonları kapatmaktır.Ardından hayvanın iyileşmesine izin verilir. Sonuç olarak, doku kesitlerinde belirli bir raporlayıcı genin saptanması ve hücre tipine özgü belirteçlerle etiketleme yoluyla, enfekte hücrelerin konumu ve fenotipik özelliklerini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, ben Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi Nörodejenerasyon programındaki Nick Guyano laboratuvarından Taryn Pier Fois.Bugün size, embriyonik 9,5. günde fare beynine in utero retroviral vektörlerin mikroenjeksiyonuna rehberlik etmek için ultrason görüntüsünün kullanıldığı bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, beyin gelişimi sırasında gen ekspresyonunun manipüle edilmesinin nöral kök ve progenitör hücre davranışı ile kader belirleme üzerindeki etkilerini incelemek için kullanıyoruz. Hadi başlayalım.Enjeksiyonlar mühendislik ürünü viral vektörler içerecekse, işlem bir biyogüvenlik seviye 2 kabininde gerçekleştirilmelidir. Anestezize edilmiş gebe bir fareyi sırt üstü yerleştirin. Orta hat boyunca cilt üzerinden bir inçlik boyuna bir kesi yapmak için ince cerrahi makaslar kullanın.İnsizyonu çevreleyen deri ve kas arasındaki bağ dokusunu kesin. Ardından, forseps ile abdominal kas boyunca biraz daha kısa bir insizyon yapın. Uterin hornları nazikçe dışarı çekin.Her iki taraftaki embriyo sayısını kaydedin. Hayvanı pleksiglas enjeksiyon tablasına transfer edin. Embriyoları korumak için.Sadece yan yana duran iki embriyoyu dışarıda bırakarak, uterus boynuzlarının çoğunu hayvanın içine geri yerleştirin. Embriyoları nemli tutmak için, iki küçük raptiye deliği ve scholastic membran parçasıyla kapatılmış iki santimetrelik bir merkez deliği bulunan 10 santimetrelik bir Petri kabı kullanın. Bir pens yardımıyla scholastic membranı hafifçe iterek işlemi gerçekleştirin.Kapçığı annenin üzerine indirin. Kapçık indirilirken, seçilen iki embriyo arasındaki uterus dokusunu kavrayın ve kapçık yerleştiğinde embriyoları nazikçe membrandan çekerek çıkarın.Küçük deliklerden geçirerek iki raptiye ile balmumuna sabitleyin. Embriyoları nemli tutmak için kabı 37 °C sıcaklıkta 1X PBS ile doldurun. Embriyoları, annenin uzunluğuna paralel olacak şekilde yönlendirin.Enjeksiyon aşamasını ultrason probunun altına yerleştirin. Probu embriyoların yaklaşık iki ila üç milimetre üzerine indirin. Net ultrason görüntüleri elde etmek için, prob başlığının ileri geri salınım yaparken embriyolara çarpmaması kritik önem taşır.Görüntüleri toplarken, iğneyi manuel bir infüzyon çekme pompasına monte edilmiş 25 µL'lik bir mikro şırıngaya bağlayın. Eğimli ve bilenmiş bir mikro enjeksiyon iğnesini bir pipet tutucuya yerleştirin. Stop musluğunun üst kısmındaki mineral yağıyla doldurulmuş 10 cc'lik bir şırıngaya hafifçe basınç uygulayarak yağı tüplere, mikro enjeksiyon iğnesi tutucusuna ve iğneye gönderin ve mikro şırıngaya yağ çekin.Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. İğneye bir ila iki milimetre uzunluğunda bir hava kabarcığı çekin. Mineral yağ ile virüs arasındaki ayrımı korumak için, iğneyi virüs solüsyonuyla dikkatlice doldurmak üzere geri çekme pompasını kullanın.Çözeltiyi yavaşça ve pürüzsüz bir şekilde çekin ve tıkanıklık oluşmamasına dikkat edin. Yüklü iğneyi, enjeksiyon alanındaki mikro manipülatör konumuna yerleştirin. Bu sırada iğnenin embriyolara veya ultrason probuna çarparak kırılmamasına özen gösterin.Enjeksiyon iğnesini uterus duvarından bir ila iki milimetre uzaklıktaki konuma getirin. Yaklaşık 45 derecelik bir açıyla, ultrason probu tarafından oluşturulan görüntüler bir video monitöründe görselleştirilir. İğne ucu, ekrandaki en parlak nokta olarak görünür.Probun salınım yönünün iğnenin uzunluğuna paralel olduğundan emin olun. Video monitöründeki ultrason görüntüsünü kullanarak embriyoyu, hedef bölgenin (bu durumda dördüncü beyin ventrikülü) kolayca görülebileceği ve iğne ile erişilebilir olacağı şekilde konumlandırın. Hedef beyin bölgesini, iğnenin ilerleme yönüyle hizalayın.İğnenin ucunu rahim duvarına değdirecek şekilde getirmek için mikromanipülatörü kullanın. Rahim dokusuna nüfuz etmek için iğneyi hızlıca ileriye doğru batırın. Amniyotik kese ve beyni delip embriyoya uygun hacimde virüs enjekte etmek için benzer şekilde birden fazla batırma işlemi gerekebilir.Başarılı bir enjeksiyonda, ventriküle partikül şeklinde bir pus girer ve ventriküler alan hafifçe genişleyebilir; bir sonraki embriyoyu enjekte etmeden önce iğneyi yaklaşık beş milimetre geri çekin. Her iki embriyo da enjekte edildikten sonra, sonraki iki embriyoyu scholastik membrandan çekmek için pens kullanın ve enjekte edilen embriyoları tekrar abdomen içine geri yerleştirin. İstenen sayıda embriyo enjekte edilip abdominal kaviteye geri itildiğinde, fareyi enjeksiyon tablasından alarak emici bir pedin üzerine taşıyın.İnsizyonu kapatmak için hayvanın temiz ve ısıtılmış bir kafeste iyileşmesini bekleyin. E 9.5 fare embriyosundan alınan bu gerçek zamanlı ultrason görüntüsü ekran görüntüsünde, enjeksiyonlara rehberlik etmek için kullanılabilecek çeşitli anatomik özellikler görülmektedir. Burada V ventrikülü, amniyotik kese ve uw ise uterus duvarını temsil etmektedir.Enjeksiyon iğnesi, görüntünün sağındaki parlak noktadır. Bu görüntüde, A-P-L-A-P eksprese eden virüs enjekte edilmiş bir embriyo, gelişmekte olan beyin içerisinde PLAP pozitif viral enfekte hücreler göstermektedir. Enfeksiyondan birkaç hafta sonra reporter ekspresyonu, hücre morfolojisinin ve hücre konumunun incelenmesine ve ayrıca klonal analize olanak tanır. Embriyonik gün 9,5'te, fare embriyolarına utero konumunda retroviral vektörün ultrason eşliğinde mikroenjeksiyonunun nasıl yapılacağını gösterdik. Bu prosedürü gerçekleştirirken, cerrahi sırasında fare ne kadar kısa süre manipüle edilirse hayatta kalma olasılığının o kadar yüksek olması nedeniyle hızlı hareket etmenin önemli olduğunu unutmayın. Ayrıca retroviral vektörler gibi biyotehlikeli materyalleri kullanırken dikkatli olmanın da önemli olduğunu unutmayın.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

ultrasound-guided-microinjection-into-mouse-forebrain-utero-at

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

E15 Fare Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Fare iç kulak olan gelişim programı gebelikte özenli bir taslakları kaynaklı duyu organıdır. Biz bir...

Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporasyon

Somatik kök hücre genişleme kontrolü kendi çalışma ve tedavide kullanımı engelleyen önemli bir faktördür. Burada geçici olarak fare beyin üretilen nöron sayısını artırmak için kullanılabilir geliştirme ve yetişkinlik döneminde nöral kök hücrelerinin genişlemesi, kontrol etmek için bir sistemi tanımlamak.

Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon veya Viral Stereotaksik Enjeksiyon

Hipotalamusun fonksiyonel ve tıbbi önemine...

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Burada, biz yaşam içine ultrason mikrokabarcık kontrast maddeler, izole geç gebelik sahne kemirgen embriyolar enjekte etmek için bir protokol mevcut. Bu yöntem perfüzyon parametrelerinin ve kontrastlı yüksek frekanslı ultrason görüntüleme kullanılarak embriyo içinde vasküler moleküler belirteçlerin çalışma sağlar.

Yüksek frekanslı Ultrason Kullanımı Fare Embriyolar Kontrast Görüntüleme

Bu protokol, radyal olarak göç eden kortikal nöronların doğrudan gözlenmesi için talimatlar sağlar. N utero elektroporasyonda, organotipik dilim kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme, göç eden nöronlardaki ilgi genlerinin aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun etkilerini doğrudan ve dinamik olarak incelemek ve gelişme sırasındaki farklılaşmalarını analiz etmek için birleştirilir.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

Transmisyon elektron mikroskobu ve rahimde iletim sinir sisteminin iyi ultrastructure morfolojik değişiklikler geliştirme sırasında çalışmak için güçlü bir yaklaşımdır. Bu kombine yöntem değişiklikleri içine derin anlayışlar nöroplastisite ile ilgili topografik ifadelerinin temel yapısal detayları verir.

Sonra Ultrastructural nöroplastisite parametrelerinde Utero iletim gelişmekte olan fare beyin ve omurilik değerlendirilmesi

Bu protokolde, E7.5'teki fare amniyotik boşluğunun lentivirüs ile nasıl enjekte edileceğini açıklıyoruz, bu da tüm sinir plakasının düzgün bir şekilde transdüksiyonuna yol açarak, hayatta kalma veya embriyonik gelişim üzerinde minimum zararlı etkiye sahiptir.

Embriyonik Gün 7.5'te In Utero Nano-Enjeksiyon (NEPTÜN) ile Murin Nöral Plaka Hedefleme

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Öğrenin fare önbeynine ultrason rehberliğinde retroviral vektör mikroenjeksiyonu yöntemini. Bu teknik gen ifadesi manipülasyonu ve nörogenez öncesi gelişimsel nörobilim araştırmaları için kullanılır.

Fare önbeyin içine Ultrason Rehberliğinde Mikroenjeksiyon In Utero E9.5 az

Daha fazla video keşfet