Name: Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: Öğrenin, ChIP yöntemiyle insan hücrelerinde histon modifikasyonlarını ve transkripsiyon faktörü işgalini nasıl analiz edeceğinizi. Bu teknik, gen ifadesi düzenlemesini ve STAT1 sinyal yolunu incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Virginia Üniversitesi, Virginia Üniversitesi Kanser Merkezi ve Thomas F. ve Kate Miller Jeffress Memorial Trust tarafından desteklenmektedir. James E. Darnell Lab (Rockefeller Üniversitesi) Robert Ross Lab (Fordham Üniversitesi), hücre hatları için teşekkür ederiz.

PLANLAMA ChIP deney planlanan gün önce, hücrelerin yeterli sayıda kullanılabilir, böylece kültüre olmalıdır. Her ChIP saflık ~ 1-1.5 x 10 7 hücre gerektirdiğini varsayalım. Her zaman negatif (IgG) ve pozitif (pan histon antikor) denetimleri ve yinelenen deneyler yapmak için plan. İpucu - 2FTGH hücreler için, her ChIP tahlil% 80 confluency yaklaşık 15 cm doku kültürü çanak gerektirir. BÖLÜM 1: Kromatin HAZIRLANMALI VE UYGULAMAYA ChIP <ol><li> Kültür ortamı çıkarın ve 20 ml% 10 kozmik buzağı serumu (CCS) / 5 ng / ml IFN-gamma içeren DMEM gerekli kez hücrelerinin neden. CCS / DMEM yanı sıra% 10 20 ml uninduced plakaları medya değiştirin. </li><li> Davlumbaz, 15 cm çanak medya 20 ml (% 1 final konsantrasyon) 540 mcL% 37 formaldehit ekleyin. İpucu - Tilt plaka ve sonra ortam havuzu formaldehit - kaya levhası eşit bir şekilde yayılması için. </li><li> Crosslinking oda sıcaklığında 10 dakika boyunca devam etmek için izin ver. </li><li> Crosslinking durdurmak için 0.125 M final konsantrasyon glisin ekleyin. </li><li> Medya aspire Vakum ve 10 ml buz gibi fosfat ile hücreler bir kez yıkayın tamponlu salin (PBS). </li><li> ~ 7 mL PBS içinde hücre kazıyıcı ile hücreleri toplamak ve buz üzerinde 50 ml konik tüp içinde aynı tedavi edildi (6 plakalardan) hücreleri birleştirmek. </li><li> 4 1800 devirde santrifüj (Beckman Coutler Allegra 12-R Santrifüj) ° C ve 5 dakika PBS aspirat. İpucu - Snap donma hücre pelletini buraya durdurma ve -80 saklamak ° C. </li><li> 4 mL Şişme Buffer (25 mM HEPES pH 7.8, 1.5 mM MgCl 2, 10 mM KCl,% 0.1 NP40 1 mM DTT, Komple proteaz inhibitörleri ve kullanmadan önce buz üzerinde soğuk ekle) hücre pelletini tekrar ve 15 transfer ml konik tüp. İpucu - Bu şişme tampon hacmi 6 plaka havuzu (~ 6-9 x 10 7 hücre) için uygun. Daha fazla veya daha az tampon douncing verimliliği değişebilir. </li><li> 10 dakika boyunca buz üzerinde hücre süspansiyonu inkübe edin. </li><li> Önceden soğutulmuş 15 mL douncer (Wheaton) süspansiyon transferi ve havaneli A. ile 20 vuruş Dounce </li><li> Transfer buz üzerinde 15 ml konik tüp geri hücreleri dounced. </li><li> 2500 rpm'de 5 dakika Santrifüj 4 ° C ve süpernatantı atmak. </li><li> Sonikasyon Tampon 3 mL nükleer pelet (6 plakaları ~ 200 mcL) (15 pelet hacimleri) (50 mM HEPES pH 7.9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 1 Triton X-100,% 0.1 Sodyum deoksikolatın, yeniden süspanse % 0.1 SDS) kullanımdan hemen önce buz üzerinde komple proteaz inhibitörleri ve soğuk ekleyin. İpucu - Bu sonication tampon hacmi 6 plaka havuzu (~ 6-9 x 10 7 hücreleri) için uygun. Daha fazla veya daha az tampon sonication verimliliğini değişebilir. </li><li> Mikrotip ile donatılmış bir Misonix sonikatör 3000 ile 10 döngü (20 saniye (8) ayarı on/40 saniye açık / kapalı genlik) buz çekirdekleri süspansiyon sonikasyon. Bu genellikle boyutu 200-1000 bps ortalama kromatin parçaları sonuçlanır. İpucu - sonicators değişir Çünkü, sonication etkinliği deneysel olarak tespit edilmelidir. Bunu yapmak için, her sonication döngüsü sonication önce ve sonra 20 mcL hacimde. Bu örneklerin, 4 saat boyunca 65 ° C'de ısıtın. DNA yükleme tamponu ekleyin ve DNA parçalarının görselleştirmek için bir standart% 1 agaroz / TBE jel çalıştırın.) </li><li> Transferi 4, 20 dakika boyunca bir SS34 santrifüj tüpü ve santrifüj malzeme sonicated ° genellikle küçük bir miktar hücre enkaz ne bir SS34 rotor 13000 rpm (Sorvall RC6 Plus, Santrifüj) pelet C. </li><li> Süpernatantı buz üzerinde dikkatlice 15 ml konik tüp transferi. </li><li> 360 mcL Somon Sperm DNA / Protein A veya G agaroz boncuk bulamaç ekleyerek ve en az 30 dakika süreyle 4 ° C'de sallanan Öncesi temizleyin. İpucu - Bu adım, non-spesifik bağlayıcı olaylar ortaya çıkar tayininde gürültü azalır . </li><li> 4 ° C'de 1000 rpm'de 5 dakika pelet agaroz boncuk santrifüjleyin. </li><li> Buz üzerinde başka bir 15 ml konik tüp supernatant önceden temizlenmiş aktarın. </li><li> Önceden temizlenmiş kromatin A260 birimleri ölçün ve dört (4) A260 birimleri 1 A260 birim = 0,050 mg / ml (0.2 mg / ml varsayarak) Sonikasyon Tampon ile ses seviyesini ayarlamak 190 mcL DDW 10 mcL sonication tamponu ile boş spektrofotometre - İpucu A260 birimleri ölçmek için, 190 mcL DDW önceden temizlenmiş kromatin 10 mcL sulandırmak. </li><li> Kromatin 75 mcL (4 A260 birimleri) kaydedin Giriş Örnek ve mağaza gibi 20 ° C çapraz bağları tersine çevirmek için hazır olana kadar. İpucu - Bu adım, veri analizi için çok önemli. Giriş kısım almak için ihmal etmeyin. </li><li> I kısım 1.7 ml mikrofuge'de tüpler için hazırlanan kromatince, 1 ml alikotları olarak. İpucu - burada durma, -80, kuru buz ve mağaza hazırlanan kromatin dondurmak ek bileşenini ° C Not: Eğer mümkünse depolanmış kromatin optimum sonuçlar daha az üreten düşürebilir, bu yüzden önlemek. </li><li> Kaynaklı ve uninduced örnekleri ChIP dereceli antikorlar çift ayarlar. Negatif ve pozitif kontrol olarak tetiklenen ve uninduced örnekleri setleri IgG (2 mg) ve pan Histon H3 antikor (15 mcL) ekleyin. İpucu - antikor miktarı deneysel olarak belirlenen veya önerilen miktarlar için tedarikçinin ürün sayfasına bakınız olmalıdır. Genellikle 1-2 mg ChIP dereceli antikor iyi çalışır. Uygun hacmi, serum olarak verilir antikorları için ampirik olarak tespit edilmelidir. </li><li> Rock tüm tüpler gecede 4 ° C </li></ol> BÖLÜM 2: immün TOPLA <ol><li> Tüm tüpler Somon Sperm DNA / Protein veya protein G agaroz boncuk bulamaç 60 mcL ekleyin. İpucu Kullanım Protein fare monoklonal antikorlar için tavşan poliklonal antikorlar ve Protein G. </li><li> 4 ° C'de en az 60 dakika süreyle Rock. </li><li> 2000 rpm'de 4 hafifçe microfuging Pelet immün (agaroz boncuk) ° C, 3 dakika. </li><li> Süpernatant aspire. </li><li> 1 ml, 10 dakika için aşağıdaki Yıkama Tamponlar her ile 4 ° C'de sallanan immün yıkayın 2000 rpm'de 3 dakika mikrofuge'de 4 ° C, her yıkama ve aspirat süpernatant arasında. Buz üzerinde soğutulmuş örnekleri tutun. Kullanımdan hemen önce PMSF ekleyin. <ul><li> Düşük Tuz Yıkama -% 0.1 SDS,% 1 Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF </li><li> Yüksek Tuz Yıkama -% 0.1 SDS,% 1 Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM PMSF </li><li> LiCl Yıkama - 0.25 M LiCl,% 1 NP-40,% 1 Sodyum deoksikolatın, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM PMSF </li><li> TE Yıkama - TE Tampon -10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF İKİ yıkar </li></ul></li><li> Son TE Tampon yıkama çıkarın ve boncuklar, 500 mcL Elüsyon Buffer (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA,% 1 SDS) ekleyin. İpucu - Elüsyon Tampon taze hazırlanmış olmalıdır. </li><li> 65 az 30 dakika süreyle Elüsyon Tampon ve ısı agaroz boncuk karıştırmak için Vortex ° C İpucu - Bu 30 dakika boyunca her tüp, en azından her 10 dakikada bir girdap . </li><li> 2000 devirde 30 saniye mikrofuge'de ve yeni bir mikrofuge'de boru Eluent transfer. İpucu - yürütülmesi sırasında, giriş örnekleri Çözülme ve her biri için 500 mcL Elüsyon Tampon ekleyin. Ileriye dönük tüm adımları bu örnekler içerir. </li><li> Tüm örnekler ve vorteks 200 mM nihai konsantrasyonu 5 M NaCl ekleyin. </li><li> 65 ° C'de gece (ya da en az 4 saat). </li></ol> BÖLÜM 3: ISLAH ChIP'd VE GİRİŞ DNA <ol><li> Kapakları üzerinde yoğunlaşma toplamak için 30 saniye için tüm örnekler mikrofuge'de. </li><li> 15 dakika oda sıcaklığında inkübe her tüp ve 1μL RNAse A (10 U / ml) ekleyin. </li><li> 10 mcL 0,5 M EDTA, 40 mcL 0.5 M Tris-Cl, pH 6.5, 2 mcL Proteinaz K (10 mg / ml) ekleyin ve 45 ° C'de 60 dakika inkübe edin. İpucu Bu reaktiflerin bir ana karışımı hazırlayın ve her bir tüpe 52 mcL ekleyin. </li><li> Fenol / kloroform / izoamil alkol özü ve kloroform / izoamil alkol sonra numunelerin ayıklayın. </li><li> 2 mcL glikojen (25 mg / ml) ve 3M Na asetat, pH 5.2 ve vorteks 0.1 hacimleri ekleyin. </li><li> 2.5 hacim% 100 etanol ve vorteks ekleyin. </li><li> 20 ° C'de bir gece inkübe edin. </li></ol> BÖLÜM 4: ISLAH ChIP'd VE GİRİŞ DNA DEVAM <ol><li> 4 13000 rpm'de 20 dakika en az mikrofuge'de örnekleri ° C DNA / glikojen pelet çöktürmek için. </li><li> 1 ml% 70 Etanol ile DNA / glikojen pelet ile yıkayın. </li><li> Hava DNA Savant hız vakum santrifüj veya hızlı kuru pelet kurulayın. İpucu - DNA üzerinde kuru değil. </li><li> 200 mcL TE Tampon DNA / glikojen pelet tekrar </li><li> Real-time PCR ile DNA (1 mcL) ölçümü için hazır. 20 Mağaza kalan DNA ° C İpucu - 1 mcL fazla DNA kullanarak gerçek zamanlı PCR reaksiyonları inhibe edebilir, bu yüzden dikkatli büyütmek. </li></ol> Bölüm 5: TEMSİLCİSİ SONUÇLAR: ChIP ve Giriş DNA örnekleri ilgi gen lokusu için spesifik primerler kullanılarak Real-Time PCR 7,8 (Uygulamalı Biyosistem 7500 Hızlı Real-Time PCR Sistemi) ile sayısal. Hedef genom dizisi bilinen zenginleştirilmiş veya test olan histon modifikasyonları eksik o Astarlar, pozitif ve negatif kontrollerin yanı sıra kullanılabilir. Veri Giriş yüzdesi olarak sunulmaktadır. ChIP prosedürü tamamen olmalıdır rüç epeated biyolojik histon modifikasyonları bildirilen değişiklikler istatistiksel olarak anlamlı sağlamak için çoğaltır. DNA, astar tasarım, PCR verimlilik ve giriş ve normalizasyon işlemleri yüzde hesaplamak için uygun bir yol da dahil olmak üzere ölçmek için gerçek zamanlı PCR kullanarak birçok önemli sorunlar vardır. Histon değişiklik bir gen üzerinde doluluk profil, PCR verimliliği tüm primer çiftleri arasında tutarlı olmalıdır. Gerçek zamanlı PCR sistemi üreticisi, gerekli bilgi ve eğitim sağlayabilir. Şekil 1 kromatin temsilcisi sonuçlar IFN-γ tarafından tetiklenen IRF1 gen 9 STAT1 etkinleştirme sırasında immunoprecipitated gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2053/2053fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. STAT1, RNA Polimeraz II ve H3K36me3 doluluk IRF1 gen STAT1 etkinleştirme sırasında dinamiktir. (A, B, C), α-H3K36me3, α-STAT1 ve kromatin α-Pol II 2FTGH hücreleri toplanan ChIP, IFN-γ (kırmızı kareler) 30 dakika, 1.5 saat (mavi daireler), 5 saat ( ile indüklenen yeşil üçgenler) veya uninduced (siyah elmas). IgG negatif kontrol (gri çarpılar) (D) Pan H3 pozitif kontrol ve bağlı (mavi daireler) lokus üzerinde histon doluluk ve uninduced koşulları (siyah elmas) gösterir. -5 Bp etrafında dalış transkripsiyon başlangıç ​​siteleri bulunan nucleosome tükenmesi nedeniyle.

<ol><li>Levy, D., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling%3A+Stats%3A+transcriptional+control+and+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).</li>
<li>Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+STATs+in+transcriptional+control+and+their+impact+on+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function.</a> Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).</li>
<li>Hu, X., Ivashkiv, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+signaling+pathways+by+interferon-gamma%3A+implications+for+immune+responses+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases.</a> Immunity. 31, 539-550 (2009).</li>
<li>Campos, E. I., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histones%3A+annotating+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histones: annotating chromatin.</a> Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+fluorescence+monitoring+of+rapid+cycle+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.</a> Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).</li>
<li>Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).</li>
<li>Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+IRF-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Activities of IRF-1.</a> J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).</li>
<li>Ross, R. A., Spengler, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neuroblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">Human neuroblastoma stem cells.</a> Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).</li>
</ol>

Ana hatlarıyla ChIP protokol laboratuarda tahlil yirmiden fazla farklı histon modifikasyonları başarıyla kullanılmaktadır. Buna ek olarak, transkripsiyon faktörleri doluluk değişiklikler karakterize, histon değiştirerek birkaç IFN-γ kaynaklı genlerin, histon modifikasyonları ve RNA Polimeraz II transkripsiyon makine kabul enzimler, proteinler. Ayrıca, kanser kök hücre 10 farklılaşması sırasında histon modifikasyonları değişiklikleri karakterize etmek için prosedürü kullandık . ChI...

<table><tbody><tr><td>%37 Formaldehit</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform/İzoamil alkol</td><td>Acros Organics</td><td>AC32715-5000</td><td></td></tr><tr><td>Komple Mini Proteaz İnhibitörleri</td><td>Roche Group</td><td>1836153</td><td></td></tr><tr><td>Kozmik Buzağı Serumu</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04N</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco Products, Inc.</td><td>zp1110EP</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Roche Group</td><td>100149</td><td></td></tr><tr><td>Glikojen</td><td>Roche Group</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>IFN-gamma</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-005-003</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Asetat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Deoksikolik Asit Sodyum Tuzu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histon H3, CT, pan</td><td>EMD Millipore</td><td>07-690</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/kloroform/izoamil</td><td>Fisher Scientific</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>EMD Millipore</td><td>50-230-0316</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>5 PRIME</td><td>2500140</td><td></td></tr><tr><td>RNAz A</td><td>5 PRIME</td><td>2500130</td><td></td></tr><tr><td>Somon Spermi DNA/Protein A Agaroz</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>Somon Spermi DNA/Protein G Agaroz</td><td>EMD Millipore</td><td>16-201</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-STAT1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-345X</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RNA Polimeraz II</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-899</td><td></td></tr></tbody></table>

kromatin immunoprecipitation İnsan hücrelerinde aktif gen İfadesi testi dinamik histon modifikasyon (chip)

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

STAT (sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörü) ekstrasellüler ligandların çeşitli yanıt olarak, transkripsiyon faktörleri hızla onlar tek bir tirozin kalıntısı 1 fosforilasyon ile aktive olan hücre yüzey reseptörleri sitoplazmada gizli devlet işe alınırlar. Daha sonra hedef genlerin transkripsiyon sürücü, büyüme, farklılaşma, homeostazı ve immün yanıtı etkileyen çekirdeği dimerize ve yerini değiştirmek. Beklendiği gibi, normal hücre süreçlerini yaygın tutulum verilen, İST fonksiyonu disregülasyonu özellikle 2 ve otoimmün hastalıklar 3 kanserleri, insan hastalığına katkıda bulunur. Bu transkripsiyon 4,5 kromatin şablonunda değişiklik tarafından düzenlenir kurulmuştur. Bu değişiklikler, ATP-bağımlı komplekslerinin yanı sıra kovalent histon modifikasyonları ve DNA metilasyon 6 faaliyetleri içerir . STAT aktivasyon gen ekspresyonu hem hızlı ve hem de geçici olduğundan, İST-bağımlı gen lokuslar modüle kromatin şablon için özel mekanizmalar gerektirir. Bu mekanizmalar tanımlamak için, histon modifikasyonları ve enzimatik faaliyetleri STAT sinyalizasyon cevap gen lokuslar onları oluşturmak karakterize eder. Bu protokol kromatin immunoprecipitation, İST aktif gen ekspresyonu kromatin sinyalizasyon çalışması için değerli bir yöntem açıklanmıştır.

Bu protokol, kromatin immunoprecipitation (ChIP) bir sinyal iletim yolu ile indüklenen transkripsiyonu düzenleyen kromatin şablon dinamik değişiklikleri incelemek için nasıl kullanıldığını açıklar.

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

Çeşitli hücre dışı ligandlara yanıt olarak, STAT (sinyal iletici ve transkripsiyon aktivatörü) transkripsiyon faktörleri hızla mobilize edilir...

Chip deneyi, STAT1 aktive edilmiş gen ekspresyonu değişiklikleri sırasında meydana gelen histon modifikasyonlarındaki dinamik değişimleri izlemek için kullanılır; transkripsiyon faktörlerinin, histon modifiye edici komplekslerin ve transkripsiyon mekanizmasının kendisinin işgalindeki değişiklikler de bu şekilde analiz edilebilir. Analize başlamak için, STAT1 sinyalini aktive etmek amacıyla hücreler interferon gama ile indüklenir; ardından hücreler formaldehit ile çapraz bağlanır ve toplanır. İzole edilen çekirdekler sonikasyona tabi tutulur, bu işlem kromatini yaklaşık 200 ila 1000 baz çifti uzunluğundaki fragmanlara ayırır. Sonrasında, hedeflenen proteine veya histon modifikasyonuna özgü bir antikor eklenir ve ardından immünokompleksler çöktürülür.İmüno kompleksler yıkanır, çapraz bağlar geri döndürülür ve DNA saflaştırılır. Histon modifikasyonlarındaki değişiklikler veya proteinlerin bir genin spesifik bölgelerine yerleşimi, immünopresipite edilen DNA'nın kantitatif gerçek zamanlı PCR analizi temel alınarak belirlenebilir. Merhaba, ben Dr. Melissa Hendrickson'ın laboratuvarından ve Virginia Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden Lauren Borow.Bugün size kromatin immünopresipitasyon prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, STAT one sinyalleri sonrası transkripsiyon sırasında meydana gelen dinamik histon modifikasyonlarını incelemek için kullanıyoruz. Hadi başlayalım.Bu prosedüre başlamadan bir gün önce, burada kullanılan iki FTGH hücresi için yeterli sayıda hücre mevcut olacak şekilde hücre kültürü yapın. Her bir çip analizi için %80 konfluens düzeyinde bir adet 15 santimetre doku kültürü kabı hazırlayın. Her deneye bir negatif IgG kontrolü, bir pozitif pan histon antikor kontrolü ve tekrarlar ekleyin.Bu prosedüre başlamak için kültür ortamını uzaklaştırın. Bunun yerine, %10 kozmik buzağı serumu ile desteklenmiş ve mililitre başına beş nanogram interferon gamma içeren 20 mililitre DMEM ekleyin. Ayrıca, indüklenmemiş plaklardaki ortamı 20 mililitre %10 C-C-S-D-M-E-M ile değiştirin.Sonraki işlemleri çeker ocak içerisinde gerçekleştirin. 15 santimetrelik doku kültürü kabını eğerek 20 mililitre besiyerine 540 mikrolitre %37'lik formaldehit çözeltisi ekleyin. Ardından, çözeltiyi eşit şekilde yaymak için plakayı sallayın.Çapraz bağlanmanın oda sıcaklığında 10 dakika boyunca gerçekleşmesini sağlayın. Ardından, çapraz bağlanma reaksiyonunu durdurmak için 125 millimolar final konsantrasyona ulaşacak şekilde glisin ekleyin. Besiyerini vakumla aspire edin ve hücreleri hücre kazıyıcı kullanarak 10 milliliters buz soğukluğunda PBS ile bir kez yıkayın, hücreleri yaklaşık yedi milliliters PBS içinde toplayın ve altı adet 15 santimetre platındaki aynı şekilde işlem görmüş hücreleri buz üzerinde 50 milliliters konik bir tüpte birleştirin.Son olarak, toplanan hücreleri 4 °C'de beş dakika boyunca 1.800 RPM hızında santrifüjleyin ve PBS'yi aspire edin. İşleme burada ara verilecekse, çapraz bağlama sonrası hücre pelletini hızlı dondurun ve -80 °C'de saklayın. Bir sonraki adım kromatinin hazırlanmasıdır.Buz üzerinde soğutulmuş şişirme tamponuna bir milimolar DTT ve komple proteaz inhibitörleri ekleyerek başlayın. Altı plakadan elde edilen pellet'i, dört mililitre şişirme tamponu içinde resüspande edin ve 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Daha fazla veya daha az tampon kullanmak, çözünme verimliliğini değiştirebilir.Hücre süspansiyonunu buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Buz üzerindeki inkübasyon tamamlandığında, süspansiyonu önceden soğutulmuş 15 mililitrelik bir dounce homogenizer'a aktarın. PESTLE A ile 20 kez dövdükten sonra hücreleri buz üzerinde 15 mililitrelik konik bir tüpe geri aktarın; 4 °C'de beş dakika boyunca 2.500 RPM'de santrifüjleyin ve nükleer peleti bırakarak süpernatantı uzaklaştırın.Buz üzerinde soğutulmuş sonikasyon tamponuna komple proteaz inhibitörleri ekleyin. Altı plaka, yaklaşık 200 microliter nükleer pelet Resus sağlar. Peleti, 15 pelet hacminde veya üç mililitre sonikasyon tamponunda süspande edin.Bu hücre miktarı için farklı bir hacim kullanmak, sonikasyon verimliliğini değiştirebilir. Sonikasyon verimliliği, laboratuvarınızdaki cihaz için önceden belirlenmelidir. Burada, mikroçip ile donatılmış bir Miss Sonic sonicate 3000 kullanılmıştır.Çekirdek süspansiyonunu buz üzerinde, sekiz genlik ayarında, 20 saniye açık ve 40 saniye kapalı olacak şekilde 10 döngü boyunca sonikasyona tabi tutun. Bu işlem, sonikasyon tamamlandığında genellikle ortalama 200 ila 1000 baz çifti boyutunda kromatin fragmanları ile sonuçlanır. Sonike edilen materyali bir SS 34 santrifüj tüpüne aktarın ve dört derece Celsius'ta 20 dakika boyunca 13,000 RPM'de santrifüjleyin.Genellikle az miktarda olan hücre döküntülerini çöktürmek için SS 34 rotorunda santrifüjleyin. Süpernatantı buz üzerinde 15 mililitrelik konik bir tüpe dikkatlice aktarın. Spesifik olmayan bağlanma olaylarından kaynaklanan arka planı azaltmak için çip aşamasına geçin.İlk olarak, 360 µL somon spermi DNA protein A veya G agro bead süspansiyonu ekleyip 4 °C'de en az 30 dakika sallayarak kromatin preparasyonunu ön temizlemeden geçirin. Agro bead'leri çöktürmek için 4 °C'de 1000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin. Ardından, ön temizlemeden geçmiş süpernatantı buz üzerinde başka bir 15 mL konik tüpe aktarın.Ardından, kromatinin 260 nanometredeki absorbansını veya A 260 birimlerini ölçün. 10 µL ön işlem görmüş kromatini 190 µL çift distile su ile seyreltin. Kör örnek için 10 µL sonikasyon tamponunu 190 µL çift distile su ile birleştirin.Örnek hacmini, sonikasyon tamponu ile dört A 260 birime ayarlayın. Çöktürme öncesi temizlenmiş kromatinin dört A 260 biriminden 75 µL kısmını, girdi örneği olarak ayırın ve çapraz bağlar tersine çevrilene kadar -20 °C'de saklayın. Bu adımın veri analizi için kritik olduğunu unutmayın.Bu nedenle giriş alikotunu almayı ihmal etmeyin; geri kalan kromatin preparatını, buz üzerinde 1,7 mL'lik mikro santrifüj tüplerine 1 mL'lik alikotlar halinde dağıtın. Burada durulacaksa, hazırlanan kromatini kuru buz üzerinde şok dondurun ve -80 °C'de saklayın.Bununla birlikte, saklanan kromatin degrade olabildiğinden, ip ile devam etmek en iyisidir. Şimdi, indüklenmiş ve indüklenmemiş örnek setlerine chip grade antikorları ekleyin. Düplike olarak.Genellikle bir ila iki mikrogram antikor iyi sonuç verir, ancak miktar önceden ampirik olarak belirlenmelidir. İndüklenmiş ve indüklenmemiş örnek setlerine negatif ve pozitif kontroller olarak iki mikrogram IgG ve 15 mikrolitre pan histone H3 antikoru ekleyin. Antikorlarla yapılan gece boyu inkübasyonun ardından immün kompleksleri izole etme aşamasına geçmeden önce, tüm tüpleri dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca çalkalayın.Tüm tüplere 60 µL somon spermi DNA protein A veya protein G boncuk süspansiyonu ekleyin. İmmün komplekslerin boncuklara bağlanması için 4 °C'de en az 60 dakika boyunca bekletin.Agros boncuklara bağlı immün kompleksleri 4 °C'de, 2000 RPM'de üç dakika boyunca hafifçe santrifüjleyerek çöktürün ve süpernatanı aspire edin. Ardından, önce düşük tuzlu yıkama, ardından yüksek tuzlu yıkama ile başlayan bir dizi tampon yıkama işlemi gerçekleştirin. Son olarak lityum klorür yıkaması yapın.Son olarak, her bir yıkama tamponuna iki kez TE yıkaması uygulayın. Kullanımdan hemen önce PMSF ekleyin; 4 °C'de sallama ile 10 dakika boyunca 1 mL tamponla yıkayın, ardından 4 °C'de 2000 RPM hızında 3 dakika boyunca santrifüjleyin ve örnekleri buz üzerinde soğuk tutarak süpernatantı aspire edin. Son TE tamponu yıkamasını kaldırdıktan sonra, boncuklara 500 µL taze hazırlanmış lizis tamponu ekleyin, Aros boncuklarını lizis tamponu içinde karıştırmak için vorteksleyin ve 65 °C'de 30 dakika boyunca ısıtın.Numuneler elüe olurken her 10 dakikada bir vorteksleyerek, giriş numunelerini çözün ve her birine 500 µL elüsyon tamponu ekleyin. Bu numuneleri sonraki tüm adımlara dahil edin. Numunelerin 65 °C'deki inkübasyonu tamamlandığında, 2000 RPM'de 30 saniye boyunca mikro santrifüjleyiniz ve EENT'yi yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.Son olarak, çapraz bağlamayı geri çevirin. Tüm örneklere, nihai konsantrasyonu 200 millimolar olacak şekilde beş molar sodyum klorür ekleyin ve 65 degrees Celsius'ta en az dört saatten gece boyuna kadar vorteks inkübatörde bekletin. İmmün komplekslerin çapraz bağları geri çevrildiğinde, 65 degrees Celsius'taki inkübasyon tamamlanınca bağlı DNA geri kazanılabilir.Numuneleri 30 saniye boyunca mikro santrifüjleyin. Kapaklardaki yoğunlaşmayı toplamak için, her tüpe 10 µL 0.5 M EDTA, 40 µL 0.5 M tris klorür pH 6.5 ve 2 µL proteinaz K'den oluşan veya bir master mix'ten toplam 52 µL ekleyerek her tübe RNAse işlemi uyguladıktan sonra her tüpe bir mikrolitre RNAse A ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin; ardından 45 °C'de 60 dakika inkübe edin. Numuneleri fenol kloroform, izopropil alkol ve ardından kloroform izopropil alkol ile ekstrakte edin.Ardından DNA'yı çöktürmek için, her örneğe iki µL glikojen ve 0,1 hacim üç M sodyum asetat (pH 5.2) ekleyip vorteksleyin; 2,5 hacim %100 etanol ekleyip vorteksleyin ve -20 °C'de gece boyunca inkübe edin. Örnekleri geri alın ve 4 °C'de 20 dakika boyunca 13.000 RPM'de santrifüjleyin.DNA glikojen peletlerini bir mililitre %70 etanol ile yıkayın ve havada kurutun. Peletleri kurutmak için ya havada bekletin ya da hızla vakumlu santrifüj kullanın. DNA'yı aşırı kurutmayın; peletleri 200 µL TE tamponu içinde yeniden süspande edin ve real-time yöntemiyle en fazla bir mikrolitresini nicelendirin.Burada gösterilen PCR, H3K36me3 dinamiklerini takip eden bir ChIP deneyinin sonuçlarıdır. IRF1 geninin interferon gama indüksiyonu sırasında, interferon gama ile 30 dakika, 1,5 saat ve beş saat boyunca indüklenmiş 2FTGH hücrelerinden toplanan kromatini çöktürmek için H3K36me3 antikoru, negatif kontrol olarak IgG ile birlikte kullanılmıştır. STAT1 doluluğu ve RNA polimeraz II doluluğu da bu zaman noktalarında belirlenmiştir.IRF one gen lokusu boyunca histon doluluğu, aynı zamanda pozitif kontrol olarak da hizmet eden pan histon üç antikoru kullanılarak indüklenmemiş ve indüklenmiş koşullar için belirlenmiştir. Eksi beş baz çifti civarındaki düşüş, transkripsiyon başlangıç bölgelerinde bulunan nükleozom eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Size kromatin immünopresipitasyon prosedürünü göstermiş olduk.Bu analiz, aktive edilmiş gen transkripsiyonu sırasında meydana gelen kromatin modifikasyonlarını gözlemlemek için kullanışlıdır. Bu prosedürü uygularken, bir ChIP deneyine başlamadan önce kromatin için parçalama prosedürünü danışmanınızla birlikte belirlemeniz önemlidir. Ayrıca, input örneklerinizi almayı unutmayın.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

chromatin-immunoprecipitation-chip-to-assay-dynamic-histone

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

ESC farklılaşması, hücre türüne özgü yapısı değişiklikleri ve kromatin bileşimi ile çakışmaktadır. Bu değişikliklerin tespiti stemcellness ve hücre farklılaşması tanımlamak mekanizmaları içine değerli bilgiler sağlar. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) kök hücre farklılaşması altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için değerli bir yöntem temsil eder.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

Yerli birleştirerek ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile kromatin imunopresipitasyon çapraz bağlanmasıyla, ChroP yaklaşım histon modifikasyonları, çeşitleri ve fonksiyonel olarak farklı kromatin etki de synergizing olmayan histonic proteinlerin kompozit proteomik mimarisini incelemek için olanak sağlar.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Bu çalışma olgun bir fare T-hücresi hattı kullanarak kromatin immüno çökeltme (ChIP) için bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, spesifik histon marklarının belirli promotör alanlarında veya genom çapında dağılımını araştırmak için uygundur.

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Burada, Kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve ChIP-seq Kütüphane hazırlık Protokolü düşük-bereket tavuk embriyonik örnekleri küresel epigenomic profilleri oluşturmak için açıklar.

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Burada, tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeüzerinden değiştirilmiş Histon Kromatin immunoprecipitation için bir protokol açıklayın. Immunoprecipitated DNA kantitatif PCR için daha sonra bereket ve Histon translasyonel modifikasyonlar genom boyunca yerelleştirilmesini sorguya eskiden.

Histon değişiklikler Saccharomyces cerevisiae üzerinden Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Kromatin çevre düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu için gerekli temel bir işlemdir. Burada, biz gen ekspresyonu kromatin değiştirme alımı yoluyla kontrol etmek için bir yöntem tarif gene özgü ve geri dönüşümlü bir şekilde makine.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Biz tandem kromatin için adım adım bir protokol tarif immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq) hücre türüne özgü genom çapında histon değişiklik çözümleme sağlar.

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

Chromatin immünoprecipitation (ChIP) gen yönetmeliğinin moleküler mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, yöntem mekanik kesme tarafından tekrarlanabilir kromatin parçalanma elde zorlukları içerir. Burada, enzimatik sindirim kullanarak bir çip tahlil için geliştirilmiş bir protokol sağlar.

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

Histon asetiltransferaz inhibitörleri (HATs, ayrıca lizin asetiltransferazolarak da bilinir), CBP/p300 gibi, kanser tedavisi için potansiyel tedavi vardır. Ancak, bu inhibitörleri doğrulamak için sıkı yöntemler gereklidir. Doğrulama için üç in vitro yöntem rekombinant asetiltransferazlar ile HAT tahlilleri dahil, hücre kültüründe histon asetilasyon için immünoblot, ve ChIP-qPCR.

Histon Asetiltransferaz Inhibitörlerinin Doğrulanması için tahliller

Bu protokol, dondurulmuş dokulardan kromatin preparatına odaklanır ve Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ve ardından kantitatif PCR analizi (X-ChIP-qPCR) veya yeni nesil dizileme yaklaşımları (X-ChIP-seq) için uygundur.

Kromatin İmmünopresipitasyon Analizi için Dondurulmuş Kimerik Karaciğer Dokusundan Kromatin Ekstraksiyonu

Öğrenin, ChIP yöntemiyle insan hücrelerinde histon modifikasyonlarını ve transkripsiyon faktörü işgalini nasıl analiz edeceğinizi. Bu teknik, gen ifadesi düzenlemesini ve STAT1 sinyal yolunu incelemek için kullanılır.

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

Daha fazla video keşfet