Name: Nasıl Kültür, Kayıt ve mikro-elektrot Diziler Sinir Ağları Teşvik (ÇÇA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Öğrenin mikro-elektrot diziler üzerinde sinir ağı kültürü, kayıt ve uyarım yöntemlerini. Embriyonik sıçan kortikal nöronları kullanarak ağ dinamikleri ve öğrenme süreçlerini in vitro ortamda detaylı şekilde araştırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz protokol sağlamak için paha biçilmez bir yorum Potter grup üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Amerikan Nöroloji Vakfı Akademisi CMH klinik araştırma eğitim bursu, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS bir burs tarafından finanse edildi <a href="http://www.nigms.nih.gov/">http://www.nigms.nih.gov/</a> JDR (GM08169) ), NIH Ulusal Nörolojik Hastalıklar Enstitüsü ve hibe Stroke (NS054809), JDR için bir Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü (NS060392), bir NSF EFRI hibe (0.836.017), Coulter Vakfı Translasyonel Araştırma Ödülü, ve JDR translasyonel araştırma bursu (NS007480).

<ol><li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).</li>
<li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+thick+brain+slices%3A+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+dynamic+attractors+in+activity+patterns+of+cultured+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E+Stat+Nonlin+Soft+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).</li>
<li>Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+long-term+correlations+in+dissociated+cortical+neuron+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Neural+Syst+Rehabil+Eng%22%5BJournal%5D)">Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings.</a> IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).</li>
<li>Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+recurring+spatiotemporal+activity+patterns+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks.</a> Phys Biol. 4, 181-193 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).</li>
<li>Hofmann, F., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+recordings+with+microelectrode+arrays%3A+studies+of+transcription-dependent+neuronal+plasticity+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration.</a> J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).</li>
<li>Gortz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reduction+of+spontaneous+neuronal+network+activity+by+sublethal+amyloid+beta+%281-42%29+peptide+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations.</a> J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).</li>
<li>Koito, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+brain+aggregate+cultures+for+neuron+and+glia+development+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies.</a> J Vis Exp. 31, (2009).</li>
<li>Brewer, G. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+growth+of+hippocampal+neurons+in+defined+medium+at+low+density%3A+advantages+of+a+sandwich+culture+technique+or+low+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen.</a> Brain Res. 494, 65-74 (1989).</li>
<li>Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cells+mature+faster+on+polyethyleneimine+coated+plates+than+on+polylysine+coated+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates.</a> J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).</li>
<li>Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+transplant+staining+with+DiI+and+vital+imaging+by+2-photon+laser-scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Microsc+Suppl%22%5BJournal%5D)">Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy.</a> Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).</li>
<li>Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost+multielectrode+system+for+data+acquisition+enabling+real-time+closed-loop+processing+with+rapid+recovery+from+stimulation+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts.</a> Front Neuroengineering. 2, (2009).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+all-channel+stimulator+for+electrode+arrays%2C+with+real-time+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control.</a> J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).</li>
<li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neurosci. 7, (2006).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+multi-channel+stimulus+artifact+suppression+by+local+curve+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting.</a> J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+activity-dependent+plasticity+of+action+potential+propagation+delay+and+amplitude+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks.</a> PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+induction+of+pathway-specific+potentiation+and+depression+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons.</a> Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. , 2nd ed, MIT Press. Cambridge, Mass. (1998).</li>
</ol>

CMH ifşa etmek için hiçbir ilgisi yoktur.<br /&gt; JDR ve SMP Axion Biosystems için danışmanlar ödenir.<br /&gt; Bu yazı ve video gönderme ücretleri ve video işleme ücretleri nezaketle Multi-Channel Sistemleri tarafından desteklenen edildi.

Bu protokol, kültürü ile ilgili talimatlar gösterir ve nöron ağlarının yanı sıra mikro-elektrod kayıt ve nöron ağları uyarıcı bir giriş korumak. ÇÇA kayıt daha yaygın sorunlardan bazıları da MEA sorun giderme bölümünde ele alındı. Boyunca tartışılmış ve çoğu zaman bu değişiklikler bazı deneysel tasarımları gerektirdiği özel koşullar optimize etmek için kullanıldığı gibi, protokolde zaman zaman farklılıklar vardır. Burada sunulan kayıt ve MCS preamp NeuroRighter 15 tasarlanmış özel oluşan uyarıcı sistem olmasına karşın, birden fazla nöron ağları ile bir arayüz sağlayabilir diğer sistemler vardır. Belirli bir kurulum seçimi spesifik deneysel gereksinimlerine bağlı olacaktır. Ancak bu kültürlerin ÇÇA üzerinde basit bir kayıt ve stimülasyon örnekleri sinaptik aktivite ve nöronal ağ bağlantısı ile ilgili karmaşık sorular içgörü sağlamak için kullanılabilir, bu protokolde verilmiştir. Yukarıda belirtildiği gibi, devam eden çalışmaları hücresel plastisite gibi süreçleri incelemek için bu teknolojiyi kullanan, geliştirme, eksitotoksisitesi ve nörodejenerasyon 6-10 Örneğin, bizim laboratuvarda yeni bir yayın tekrarlanabilir hedefe, gerçek zamanlı kapalı döngü stimülasyonu ile in vitro öğrenme yönetti gösterdi nöronal ağ etkinliği 3 yanıt. MEA kültürler genellikle finicky ve hassas olmasına rağmen, basitlik ve erişilebilirlik (sağlam hayvanlara kıyasla) sayesinde, bir ağ düzeyinde nöronal aktivitenin çalışmak için güçlü bir model sağlar.

Sarf Malzemeleri <ul><li> Tek kullanımlık şişe top filtresi (150ml, 0.2μm gözenek boyutu; Nalgene # 565-0020) </li><li> Embriyonik gün 18 zamanlı hamile kadın sıçan </li><li> Mikroelektrod diziler (B1, protokol açıklamayı görmek) </li><li> Mikroelektrod dizi kapakları (protokol, B3 açıklama bakınız) </li><li> Naylon hücre süzgeç (40μm, BD Falcon, # 352.340) </li><li> Polipropilen konik şişeleri (steril, 15ml) </li><li> Polistiren Petri kapları (35mm, steril ve 100x15mm) </li><li> Pipetleyin ipuçları (steril 20μl, 200μl ve 1000μl) </li><li> Serolojik pipetleri (5ml) </li></ul> Ekipman: <ul><li> Biyolojik güvenlik kabini / laminer akış kaputu </li><li> Hücre sayıcı </li><li> Santrifüj </li><li> Buz konteyner </li><li> Diseksiyon makas ve forseps (steril) </li><li> Laminer akış kaput mikroskop Diseksiyon </li><li> Taşınabilir elektrik Pipetman </li><li> Hemasitometre </li><li> Isofluorane ve gaz odasında </li><li> Işık mikroskobu </li><li> El Pipetman (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl)) </li><li> MEA kayıt sistemi (bkz. protokol, D1 açıklama) </li><li> Kemirgen Giyotin </li><li> Tri-gaz inkübatör (protokol, B15 açıklama bakınız) </li><li> Vakum şişesi kaputu bağlı aspiratör </li><li> Girdap </li><li> Su banyosu (35-37 ° C) </li></ul> Çözümler ve Reaktifler: BSA çözüm: % 5 BSA fosfat (Sigma A-9418) tuzlu pH 7.4 ve 0.2μm süzülmüş tamponlu. Bu çözüm, 4 ° C&#39;de birkaç ay önceden hazırlanan ve saklanan olabilir. Cep Orta: 90 ml Dulbecco&#39;nun Kullanıcı modifiye Eagle Kullanıcı orta (Irvine Bilimsel 9024), 10 ml at serumu (Gibco 16050), 1 ml sodyum piruvat (Gibco 11.360, 100 mM), 250 ul GlutaMAX (Gibco 35.050), ve insülin (final konsantrasyon birleştirin 2.5 mg / ml, Sigma I-5500) sonra 0.2 mikron filter.22 Sıcak geçmesine ve kullanmadan önce inkübatör hücre orta dengelenmesi. Diseksiyon papain çözüm hazırlamak için çözüm: 23 <table border="1"><tr><td> Diseksiyon çözüm (100ml stok) </td><td> 4, filtre 0,22 mikron ve mağaza birleştirin ° C </td><td></td></tr><tr><td> Bileşen </td><td> Cilt ml </td><td> Final Konsantrasyon (mM) </td></tr><tr><td> Çift distile su </td><td> 91,175 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 0,58 </td><td> 5.8 mM </td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2 </td><td> 0,025 </td><td> 0,25 mm </td></tr><tr><td> 0,5 M Hepes </td><td> 0,32 </td><td> 1.6 mm </td></tr><tr><td> % 0.5 fenol kırmızısı </td><td> 0,2 </td><td> (% 0.001) </td></tr><tr><td> 0.1 N NaOH </td><td> 0,2 </td><td> 0.2 mM </td></tr><tr><td> 2 M Na2SO4 </td><td> 4,5 </td><td> 90 mm </td></tr><tr><td> 1 M K2SO4 </td><td> 3,0 </td><td> 30 mm </td></tr><tr><td> 0.1 M Kynurenic asit </td><td> 1,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> 5 mM APV </td><td> 1,0 </td><td> 0.05 mm </td></tr></table> Bu çözüm, 4 ° C&#39;de birkaç ay önceden hazırlanan ve saklanan olabilir. DNAz I: Invitrogen (# 18.047.019). 50μl alikotları -80 ° C&#39;de dondurulmuş flaş ve saklanır Bir kısım hücre disosiasyon süreci başlamadan önce laminer akış kaputun içindeki çözülmüş. Hank dengeli tuz çözeltisi: Sigma (# 4891). 1X çözüm steril 0.2μm süzülmüş ve 4 saklanan ° C, deiyonize su ile hazırlanır Hazırda Bekleme çözüm: Kültür, günü hazırlayın. 98 ml L-15 orta (Invitrogan 11415) 2 ml B-27 takviyesi (50X, Invitrogen # 17504) ve 0.2 mikron filtre ile birleştirin. Laminin çözüm: Kültür, günü hazırlayın. 0.02mg/ml son bir konsantrasyon için 980 ul hücre orta laminin 20μl sulandırınız (1mg/ml, Sigma L-2020). 20 ul alikotları laminin (1mg/ml) -80 ° C&#39;de saklanır ve kullanımdan hemen önce çözülmüş. Çözülme tezgah üstünde gerçekleşmesi gereken ve su banyosu gibi hızlı çözülme bazen laminin jelleşme yol. Papain çözüm: 23 30-32 Sıcak 10 ml (üstte) diseksiyonu çözüm ° C 200 adet papain ekle (Sigma P-4762) ve 1.6 mg L-sistein (Sigma C-7880). Ul yaklaşık 14 0.1 N NaOH ile pH 7.4 &#39;e ayarlayın. Çözüm cl kadar yaklaşık 30 dakika boyunca inkübekulaklar, filtre 0.2 mikron, -80, 15 ml polipropilen steril konik şişeleri ve mağaza, 2 ml alikotları sıvı nitrojen ile flash dondurma ° C 35-37 ° C protokolü başlamadan önce bir kısım çözülme. Polietilenimin (PEI) çözüm: 13 PEI, 100 ul (% 50 w / v, Sigma P-3143), bir final konsantrasyon% 0.05 w / v için 100 ml sodyum borat tamponu (0.1 M, pH 8.4, Sigma B-9876) ile seyreltilir Steril filtre 0.2 mikron. Bu, önceden hazırlanmış ve ay süreyle 4 ° C&#39;de saklanabilir. Steril de-iyonize su: Otoklav ve kullanmadan önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Tripsin (EDTA, Gibco 25200 ile% 0.25): 1ml alikotları -80 ° C&#39;de dondurulmuş flaş ve saklanır Alikot kullanılmadan önce 35-37 ° C su banyosunda çözülmüş.

nasıl kültür, kayıt ve mikro-elektrot diziler sinir ağları teşvik (ÇÇa)

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

Geçen yüzyıl boyunca, dünyanın pek çok Nörobilimadamları nöral ağların nasıl çalıştığını anlamak için hayatlarını adamış ve çeşitli hastalıkların neden çalışmayı durdurur. Çalışmalar nöropatolojik gözlem, genetik etiketleme ile floresan mikroskopi ve ayrışmış nöronlar ve dilim hazırlıkları hem de hücre içi kayıt dahil ettik. Bu protokol, mikro-elektrot dizileri (aynı zamanda multi-elektrot diziler, ÇÇA denir) ayrışmış nöronal kültürlerin büyüyen içeren bir başka teknoloji tartışıyor. Diğer teknolojilere kıyasla, bu sistemi kullanarak birden fazla avantajı vardır. ÇÇA üzerindeki kontrol grubuyla nöronal kültürlerin ağ aktivite dizinin birden fazla elektrotlar üzerinden elektrik stimülasyonu dizileri ile manipüle edilebilir olan basitleştirilmiş bir model sağlar. Ağ küçük olduğundan, stimülasyon etkisi gözlemlenebilir alanları, bozulmadan hazırlıklarında söz konusu değildir sınırlıdır. Çeşitli görüntüleme teknikleri ile izlemek için morfolojisi kolay değişiklik yapmadan bir tek tabaka hücreleri büyümek. Son olarak, in vitro olarak bir yıl boyunca diğer kültür teknikleri ile doğasında herhangi bir net zaman sınırlamaları kaldırır ÇÇA üzerindeki kültürleri hayatta. 1 Dünya çapında laboratuvar ve diğerleri nöron ağları hakkında önemli sorular sormak için bu teknolojiyi kullanıyor. Bu protokolün amacı, bakımını kurma gelen kayıt ve elektriksel uyarıcı ÇÇA üzerindeki kültürleri için gerekli bilgileri sağlamak için, ağ fizyolojik ilgili sorular soran ve daha iyi anlaşılmasına yol açan hücre düzeyine için bir araç sağlayan in vitro ağlarda beyin fonksiyonu ve disfonksiyonu.

Bu protokol kurmak, bakımını, kayıt ve elektriksel uyarıcı ÇÇA üzerindeki kültürleri için gerekli bilgileri sağlar.<em&gt; In vitro</em&gt; Ağlar, ağ ve hücre düzeyine beyin fonksiyonu ve disfonksiyonu daha iyi anlaşılmasına yol açan fizyolojik ilgili sorular sorarak için bir araç sağlar.

Nasıl Kültür, Kayıt ve mikro-elektrot Diziler Sinir Ağları Teşvik (ÇÇA)

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

Bu prosedürün genel amacı, mikro elektrot dizileri üzerindeki nöronal ağları kültürlemek, kaydetmek ve uyarmaktır. Bu, önce kültür için reaktifler ve mikro elektrot dizileri hazırlanarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, kortikal nöronları 18 günlük bir sıçan embriyosundan ayırmaktır.Prosedürün üçüncü adımı, nöronları mikroelektrot dizileri ve kültürü üzerine iki ila üç hafta boyunca plakalamaktır. Prosedürün son adımı, mikroelektrot dizilerinden uyarma ve kaydetme yoluyla nöronal ağlarla deney yapmaktır. Sonuç olarak, Mikroelektrot dizileri üzerinde titiz hücre kültürü ile kayıt ve stimülasyon yazılımları ile nöronal ağlarda spontan ve uyaran uyarılmış aktivite gösteren sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, ben Profesör Steve Potter. Georgia Tech'te Biyomedikal Mühendisliği Kültür Bölümü'nde Nöro Mühendislik Laboratuvarı'nın direktörüyüm. Bu bölüm Emory Üniversitesi Tıp Fakültesi ile paylaşılmaktadır.Ve ben Chad Hales, Dr. Potter'ın laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım. Aynı zamanda Emory Üniversitesi Tıp Fakültesi Nöroloji Bölümü'nde bilişsel davranışçı bir araştırmacıyım. Bugün size çoklu elektrot dizilerinde nöronların nasıl kültürleneceğini ve bakımının nasıl yapılacağını göstereceğiz.Bunlar gibi. Bunları in vitro öğrenme ve hafızayı ve ağ bilgi işlemeyi incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım: Laminer akış başlığında, elektrotlara zarar vermemek için 100 milimetrelik bir Petri kabında dinlendirilen temiz ve steril bir MEA'nın merkezine 100 mikrolitre polietilen amin pipetleyen çok kanallı sistemler mikro elektrot dizisini veya MEA'yı hazırlamaya başlayın.MEA yüzeyine asla katı nesnelere dokunmayın. Çanağı steril bir kapakla hafifçe örtün, gaz geçirgen bir Teflon membran ile donatın ve davlumbazda 30 dakika inkübe edin. Teflon membran kapak, minimum buharlaşma ile gaz değişimi ve daha düşük nemli ortamlarda kültür yeteneği sağlar.Daha düşük nem, inkübatörde hassas elektroniklerin kullanılmasına izin verir ve kirlenme oranlarını azaltır. PEI'yi aspire edin, MEA'yı bir ila iki mililitre steril deiyonize su ile üç kez durulayın. Kapağı kapalıyken en az 30 dakika veya tamamen kuruyana kadar kurumaya bırakın.Bu protokolün metin bölümünde açıklandığı gibi bir E 18 kortikal nöron ayrışmasını tamamlayın. Süzdükten sonra hücreleri süzün. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücre süspansiyon hacmini hücre ortamı ile dikkatlice dört mililitreye getirin.Hücre süspansiyon santrifüjünün altına 500 mikrolitre %5'lik bir BSA solüsyonunu altı dakika boyunca 200 Gs'de yerleştirin. Hücreler dönerken, MEA'nın tamamen kuru olduğunu kontrol edin. 20 mikrolitre laminat çözeltisini MEA'nın merkezine dikkatlice pipetleyin.Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının ve tüm elektrotların kaplandığından emin olun. Lamininin buharlaşmasını önlemek için Teflon kapağı yavaşça MEA'nın üzerine yerleştirin. Kapak yerleştirildiğinde MEA tamamen düz bir yüzeyde olmalıdır.Aksi takdirde, basınç dizinin cam tabanını çatlatabilir. Çanağı 35 ila 37 santigrat derece, %5 karbondioksit, %9 oksijen ve %65 nemde 20 dakika inkübe edin. Şimdi bükülmüş hücreleri davlumbaza aktarın.Tüpün dibinde bir hücre peleti görünmelidir. Eksik peletleme durumunda süpernatanı çıkarın ve rezerve edin. Peleti yavaşça yeniden askıya alın.Bir hemo sitometre üzerindeki süspansiyonun 10 mikrolitresindeki hücre sayısını sayın ve süspansiyonu istenen konsantrasyona seyreltin. Tipik olarak hücre ortamı ile mikrolitre başına 1000 ila 3000 hücre. Dizinin laminat inkübasyonu tamamlandığında, damlacığı hemen aspire edin.MEA'nın laminat kaplı alanı üzerine 15 ila 20 mikrolitre hücre süspansiyonu pipetleyin. Çanağı Teflon kapakla örtün ve 30 dakika boyunca inkübatöre koyun. Bir faz kontrast mikroskobu altında, hücrelerin yapıştığından ve tüm elektrotları kapladığından emin olmak için çanağı inceleyin.Kapsam eksikse, daha fazla hücre ekleyin ve yeniden inkübe edin. Çanağı yavaşça bir mililitre ısıtılmış dengeleyici hücre ortamı ile doldurun. Teflon kapağı değiştirin ve tabağı 24 saat boyunca inkübatöre geri koyun.Ertesi gün. Faz kontrast mikroskobu altında, kültürlenmiş hücrelerin yapıştığını ve uygun bakım ve besleme ile döküntü ve hücre ölümü miktarının sınırlı olduğunu kontrol edin. Ekteki metinde açıklandığı gibi, bu şekilde kültürlenen nöronlar bir yıldan fazla hayatta kalabilir.İki ila üç hafta sonra, kültürler sabit bir aktivite durumuna ulaşmıştır ve bu videodan kaydedilebilir, şimdi özel yapım nöro yazar programı ile kayıt gösterilecektir. Çanağı tekrar 35 ila 37 santigrat derece, %5 karbondioksit, %9 oksijen ve %65 nemde tutulan kayıt inkübatörüne aktarın. İdeal sıcaklığı ve pH'ı korumak için, tabağı hareket ettirirken yere paralel olarak taşıyın ve hücreleri alt tabakadan çıkarabilecek hızlı hareketlerden kaçının.MEA'yı çanaktan kaldırın ve çok kanallı sistemlere yerleştirin. Preem amplifikatörünü kaydedin, dahili topraklamayı Preem amplifikatör topraklaması ile düzgün bir şekilde eşleştirdiğinizden emin olun. Ön amplifikatör, ekteki metinde açıklandığı gibi ısıyı dağıtma işlevi gören bir post cihazı üzerinde oturuyor, ön amplifikatör inkübatörden çıkarıldı.Yemeğin düzgün oturmasını daha iyi gösterin. Dizinin çevresindeki temas noktalarını temizlemek için %70 etanol ile nemlendirilmiş bir mendil kullanın. MEA'nın düzgün bir şekilde oturduğundan emin olun, kapağı indirin ve kilitleyin.Gerekirse dizinin temas noktalarını hizalamak için pamuklu çubuk kullanın. Neuro writer'da, deney için uygun ayarları seçin. Kayıt anahtarı yukarı çevrilmelidir.Verileri bir dosyaya yazmak için, kayda başlamak üzere başlat düğmesine tıklayın. Ani artış ekranı artık ara sıra hareket potansiyelleri ve etkinlik patlamaları ile birlikte çalışan etkinlik izlerini ve arka plan gürültüsünü gösterecek. Bir elektrot çok fazla gürültü gösteriyorsa, ön amplifikatör kapağında yanlış hizalanmış bir pim, küçük bir çöp parçası, bir damla orta, bozulmuş bir elektrot yüzeyi veya kapağı üst üste binen ve teması bozan şeffaf bir zar olabilir.Kontak pimini kontrol edin ve gerekirse %70 etanole batırılmış bir pamuklu çubukla ayarlayın. Ekran görünümünü, aksiyon potansiyellerinin statik üç milisaniye uzunluğundaki pencerelerde görüntülendiği ani yükselme algılama moduna değiştirmek için ani yükseliş dalga biçimi sekmesine tıklayın. MEA'daki nöronal ağı uyarmak için, stimülasyon artefaktını sınırlamak için kayıt ayarları sekmesi altındaki salpa algoritmasını eğitin, çevrimiçi ayarlar sekmesinde salpa'yı etkinleştirin.Kayıt başladıktan sonra, bir elektrodu uyarmak ve çanaktaki tepkileri izlemek için açık döngü programını kullanmak üzere uygun bir stimülasyon paradigması oluşturmak için STEM sekmesine tıklayın. Açık döngü bölümünde uygun ayarları seçin ve ardından başlat'a basın. Ana ani artışlar sekmesinde ve ani dalga formları sekmesinde yanıtları görselleştirin.Bu film, gelişmekte olan in vitro yedinci gün nöronlarını ve glial hücreleri, büyüdükçe ve mikro elektrotlar için bir MEA üzerinde bağlantılı bir ağ oluştururken tasvir ediyor. Bu, bir nöronal ağdan iki dakikalık spontan aktivitenin raster bir grafiğidir. Her siyah nokta bir aksiyon potansiyelini temsil eder.Mavi oklarla iki aktivite patlaması gösterilir. Birden fazla elektrot üzerinden yanıt, ağ bağlantısının bir işlevidir. İşte 16 saniyelik uyaranla uyarılmış aktivitenin raster grafiği.Kırmızı yıldızlar uyaranları temsil eder. Kırmızı oklar, birden fazla elektrot boyunca sinaptik aktivite patlamalarını başarıyla indükleyen beş uyaranı göstermektedir. Bazen bir uyaran bir patlamaya neden olmaz.Burada mavi okta, size mikro elektrot dizileri üzerindeki nöronal ağlardan nasıl kültür kaydı yapılacağını ve uyarılacağını gösterdik. Muhtemelen endişelenilen en önemli şey, kültürlerin enfekte olmasını önlemek ve buharlaşmayı azaltmaktır. Bunun gibi yarı geçirgen zarlara sahip kapaklar kullanılırsa, sızdırmaz hale gelirler ve buharlaşmayı ve enfeksiyonu önlerler ve kültürleri aylarca, belki de bir yıldan fazla bir süre boyunca kültürleyebilirsiniz.İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.

how-to-culture-record-stimulate-neuronal-networks-on-micro-electrode

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Korteks kritik devlet dinamikleri göstergesi nöronal çığ, yani uzay-zamansal ölçek değişmeyen aktivite patlamaları, çalışma için sağlam bir yol. Çığ faaliyet uzun vadeli ölçümler için tam kontrollü koşullar altında düzlemsel bütünleşik çoklu-elektrod (MEA) ile sağlar kültürlü korteks yüzeysel katmanları geliştirme kendiliğinden ortaya çıkar.

Organotipik Kültürleri nöronal Çığ Çok elektrot Dizi Kayıtlar

Bu video, hipokampal nöronlara sahip düzlemsel bir mikroelektrot dizisine bağlı bir 3D nöronal kültürün gelişimini göstermektedir. İzole edilmiş nöronlar, mikroelektrot dizisinin aktif alanı üzerinde 2 boyutlu bir ağ oluşturur ve bir zar eki olan çok kuyulu bir plakada cam mikro boncuklara yapışır. Bu nöron kaplı mikro boncukları elektroda aktardıktan sonra, birbirine bağlı bir 3D sinir ağı halinde düzenlenirler.

Mikro elektrot dizilerine bağlı üç boyutlu nöronal ağlar oluşturma

Video, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) türetilen nöronların elektrofizyolojik aktivitesini kaydetmek için bir mikroelektrot dizisinin (MEA) nasıl kullanılacağını gösterir. Bir nöron-astrosit ko-kültürü içeren çok kuyulu bir MEA'dan elde edilen elektrofizyolojik aktivite, ağdaki birden fazla nörondan gelen aksiyon potansiyellerini tespit etmek için kaydedilir ve hiPSC'lerin nöronlara başarılı bir şekilde farklılaştığını doğrular.

Mikro-elektrot dizileri kullanılarak nöronal ağların elektrofizyolojik aktivitesinin ölçülmesi

Bu video, bir çoklu elektrot dizisi (MEA) üzerinde primer murin spiral ganglion nöron (SGN) kültürlerinden spontan ve stimülasyona bağlı nöral aktivitenin kaydını göstermektedir. MEA'nın yıkanmasını ve hazırlanmasını, spontan nöral aktivitenin kaydedilmesini ve stimülasyona bağlı nöronal aktiviteyi tanımlamak için kontrollü elektriksel uyaranların uygulanmasını içerir.

Primer Murin Spiral Ganglion Nöronlarında Nöral Aktivitenin Multielektrot Dizileri Kullanılarak Analiz Edilmesi

Bu video, çok elektrotlu bir dizi veya MEA cihazı kullanılarak yakalanan, omurilik dilimlerinin organotipik ko-kültürlerinden alınan elektrofizyolojik kayıtları sunar. Bu kayıtlar, dilimler arasındaki nöronal rejenerasyonu değerlendirir. Gözlenen senkronize elektriksel aktivite, başarılı nöral rejenerasyonu doğrular.

Birlikte Kültürlenmiş Omurilik Dilimlerinde Nöronal Rejenerasyonları Değerlendirmek İçin Elektrofizyolojik Kayıtlar

Bu video, 3B kokültür kürelerinde sinaptik fizyolojiyi ölçmek için çoklu elektrot dizisinin (MEA) kullanılması prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, 3B küreler içindeki sinir ağı dinamiklerini ve sinaptik ağ patlama aktivitesini anlamayı sağlar.

3D Kokültür Kürelerinde Sinaptik Fizyolojiyi Ölçmek için Çoklu Elektrot Dizilerinin Kullanılması

Bu video, nöronal ağ aktivitesini kaydetmek için bir nöron-astrosit ko-kültürü oluşturmayı göstermektedir. Motor nöronların ve astrositlerin ko-kültürü bir çoklu elektrot dizisi (MEA) plakası üzerinde kurulduktan sonra, nöronal ağın senkron ritmik elektriksel aktivitesi MEA kullanılarak hücre dışı olarak kaydedildi.

Bir Nöron-Astrosit Ko-Kültüründe Nöronal Ağın Elektrofizyolojik Aktivitesinin Kaydedilmesi

Bu çalışmada, 3 boyutlu nöronal kültürlerin düzlemsel Mikro-Elektrot Dizilerine (MEA'lar) bağlandığı yeni bir deneysel model presented. 3D ağlar, nöronların üzerinde büyüdüğü ve birbirine bağlı 3B yapılar oluşturduğu cam mikro boncuklardan oluşan bir iskelede nöronların tohumlanmasıyla inşa edilir.

Mikro Elektrot Diziler 3D Engineered Nöronal Kültürler Arayüz: Yenilikçi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deneysel Model

Nöronal yanıt profillerini incelemek ve stimülasyon parametrelerini optimize etmek için çoklu elektrot dizileri üzerinde primer murin spiral ganglion nöron eksplantlarını kültürlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu tür çalışmalar, koklear implantların nöron-elektrot arayüzünü, hastalarda işitmeye ve cihazın enerji tüketimine fayda sağlayacak şekilde iyileştirmeyi amaçlamaktadır.

Çok elektrot dizilerde Spiral Ganglion Nöron Eksplantasyon Kültür ve Elektrofizyoloji

Çok elektrotlu diziler üzerinde kültürlenen fare nöronal hücreleri, elektrik stimülasyonunu takiben yanıtta bir artış sergilemektedir. Bu protokol, nöronların nasıl kültürlendiğini, aktivitenin nasıl kaydedildiğini ve uyarılma modellerine cevap vermek için ağları eğitmek için nasıl protokol oluşturacağını gösterir.

Mikro Elektrod Dizilerinde Nöronal Hücre Kültürlerinin Uyarılmasına Ağ Yanıtına Zamana Bağlı Artış

Bu iletişim kuralı mikrosıvısal aygıtlarla çalışmak için nöronal kültürler iletimde Aksiyon potansiyeli vitro elektrot dizilerin nasıl göstermek amaçlamaktadır. Veri analizi, yani algılama ve karakterizasyonu Aksiyon potansiyelleri, yayma, gerçekleştirilen yeni bir kullanarak gelişmiş, henüz Kullanıcı dostu ve serbestçe kullanılabilir, hesaplama aracı.

Nöronal iletişim ve aksonal sinyal yayma çalışmak için elektrot dizileri ile ara yüz kullanımını Havacilik

Öğrenin mikro-elektrot diziler üzerinde sinir ağı kültürü, kayıt ve uyarım yöntemlerini. Embriyonik sıçan kortikal nöronları kullanarak ağ dinamikleri ve öğrenme süreçlerini in vitro ortamda detaylı şekilde araştırın.

Nasıl Kültür, Kayıt ve mikro-elektrot Diziler Sinir Ağları Teşvik (ÇÇA)

Daha fazla video keşfet