Nasıl Kültür, Kayıt ve mikro-elektrot Diziler Sinir Ağları Teşvik (ÇÇA)

Bu prosedürün genel amacı, mikro elektrot dizileri üzerindeki nöronal ağları kültürlemek, kaydetmek ve uyarmaktır. Bu, önce kültür için reaktifler ve mikro elektrot dizileri hazırlanarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, kortikal nöronları 18 günlük bir sıçan embriyosundan ayırmaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, nöronları mikroelektrot dizileri ve kültürü üzerine iki ila üç hafta boyunca plakalamaktır. Prosedürün son adımı, mikroelektrot dizilerinden uyarma ve kaydetme yoluyla nöronal ağlarla deney yapmaktır. Sonuç olarak, Mikroelektrot dizileri üzerinde titiz hücre kültürü ile kayıt ve stimülasyon yazılımları ile nöronal ağlarda spontan ve uyaran uyarılmış aktivite gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Profesör Steve Potter. Georgia Tech'te Biyomedikal Mühendisliği Kültür Bölümü'nde Nöro Mühendislik Laboratuvarı'nın direktörüyüm. Bu bölüm Emory Üniversitesi Tıp Fakültesi ile paylaşılmaktadır.

Ve ben Chad Hales, Dr. Potter'ın laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım. Aynı zamanda Emory Üniversitesi Tıp Fakültesi Nöroloji Bölümü'nde bilişsel davranışçı bir araştırmacıyım. Bugün size çoklu elektrot dizilerinde nöronların nasıl kültürleneceğini ve bakımının nasıl yapılacağını göstereceğiz.

Bunlar gibi. Bunları in vitro öğrenme ve hafızayı ve ağ bilgi işlemeyi incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım: Laminer akış başlığında, elektrotlara zarar vermemek için 100 milimetrelik bir Petri kabında dinlendirilen temiz ve steril bir MEA'nın merkezine 100 mikrolitre polietilen amin pipetleyen çok kanallı sistemler mikro elektrot dizisini veya MEA'yı hazırlamaya başlayın.

MEA yüzeyine asla katı nesnelere dokunmayın. Çanağı steril bir kapakla hafifçe örtün, gaz geçirgen bir Teflon membran ile donatın ve davlumbazda 30 dakika inkübe edin. Teflon membran kapak, minimum buharlaşma ile gaz değişimi ve daha düşük nemli ortamlarda kültür yeteneği sağlar.

Daha düşük nem, inkübatörde hassas elektroniklerin kullanılmasına izin verir ve kirlenme oranlarını azaltır. PEI'yi aspire edin, MEA'yı bir ila iki mililitre steril deiyonize su ile üç kez durulayın. Kapağı kapalıyken en az 30 dakika veya tamamen kuruyana kadar kurumaya bırakın.

Bu protokolün metin bölümünde açıklandığı gibi bir E 18 kortikal nöron ayrışmasını tamamlayın. Süzdükten sonra hücreleri süzün. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücre süspansiyon hacmini hücre ortamı ile dikkatlice dört mililitreye getirin.

Hücre süspansiyon santrifüjünün altına 500 mikrolitre %5'lik bir BSA solüsyonunu altı dakika boyunca 200 Gs'de yerleştirin. Hücreler dönerken, MEA'nın tamamen kuru olduğunu kontrol edin. 20 mikrolitre laminat çözeltisini MEA'nın merkezine dikkatlice pipetleyin.

Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının ve tüm elektrotların kaplandığından emin olun. Lamininin buharlaşmasını önlemek için Teflon kapağı yavaşça MEA'nın üzerine yerleştirin. Kapak yerleştirildiğinde MEA tamamen düz bir yüzeyde olmalıdır.

Aksi takdirde, basınç dizinin cam tabanını çatlatabilir. Çanağı 35 ila 37 santigrat derece, %5 karbondioksit, %9 oksijen ve %65 nemde 20 dakika inkübe edin. Şimdi bükülmüş hücreleri davlumbaza aktarın.

Tüpün dibinde bir hücre peleti görünmelidir. Eksik peletleme durumunda süpernatanı çıkarın ve rezerve edin. Peleti yavaşça yeniden askıya alın.

Bir hemo sitometre üzerindeki süspansiyonun 10 mikrolitresindeki hücre sayısını sayın ve süspansiyonu istenen konsantrasyona seyreltin. Tipik olarak hücre ortamı ile mikrolitre başına 1000 ila 3000 hücre. Dizinin laminat inkübasyonu tamamlandığında, damlacığı hemen aspire edin.

MEA'nın laminat kaplı alanı üzerine 15 ila 20 mikrolitre hücre süspansiyonu pipetleyin. Çanağı Teflon kapakla örtün ve 30 dakika boyunca inkübatöre koyun. Bir faz kontrast mikroskobu altında, hücrelerin yapıştığından ve tüm elektrotları kapladığından emin olmak için çanağı inceleyin.

Kapsam eksikse, daha fazla hücre ekleyin ve yeniden inkübe edin. Çanağı yavaşça bir mililitre ısıtılmış dengeleyici hücre ortamı ile doldurun. Teflon kapağı değiştirin ve tabağı 24 saat boyunca inkübatöre geri koyun.

Ertesi gün. Faz kontrast mikroskobu altında, kültürlenmiş hücrelerin yapıştığını ve uygun bakım ve besleme ile döküntü ve hücre ölümü miktarının sınırlı olduğunu kontrol edin. Ekteki metinde açıklandığı gibi, bu şekilde kültürlenen nöronlar bir yıldan fazla hayatta kalabilir.

İki ila üç hafta sonra, kültürler sabit bir aktivite durumuna ulaşmıştır ve bu videodan kaydedilebilir, şimdi özel yapım nöro yazar programı ile kayıt gösterilecektir. Çanağı tekrar 35 ila 37 santigrat derece, %5 karbondioksit, %9 oksijen ve %65 nemde tutulan kayıt inkübatörüne aktarın. İdeal sıcaklığı ve pH'ı korumak için, tabağı hareket ettirirken yere paralel olarak taşıyın ve hücreleri alt tabakadan çıkarabilecek hızlı hareketlerden kaçının.

MEA'yı çanaktan kaldırın ve çok kanallı sistemlere yerleştirin. Preem amplifikatörünü kaydedin, dahili topraklamayı Preem amplifikatör topraklaması ile düzgün bir şekilde eşleştirdiğinizden emin olun. Ön amplifikatör, ekteki metinde açıklandığı gibi ısıyı dağıtma işlevi gören bir post cihazı üzerinde oturuyor, ön amplifikatör inkübatörden çıkarıldı.

Yemeğin düzgün oturmasını daha iyi gösterin. Dizinin çevresindeki temas noktalarını temizlemek için %70 etanol ile nemlendirilmiş bir mendil kullanın. MEA'nın düzgün bir şekilde oturduğundan emin olun, kapağı indirin ve kilitleyin.

Gerekirse dizinin temas noktalarını hizalamak için pamuklu çubuk kullanın. Neuro writer'da, deney için uygun ayarları seçin. Kayıt anahtarı yukarı çevrilmelidir.

Verileri bir dosyaya yazmak için, kayda başlamak üzere başlat düğmesine tıklayın. Ani artış ekranı artık ara sıra hareket potansiyelleri ve etkinlik patlamaları ile birlikte çalışan etkinlik izlerini ve arka plan gürültüsünü gösterecek. Bir elektrot çok fazla gürültü gösteriyorsa, ön amplifikatör kapağında yanlış hizalanmış bir pim, küçük bir çöp parçası, bir damla orta, bozulmuş bir elektrot yüzeyi veya kapağı üst üste binen ve teması bozan şeffaf bir zar olabilir.

Kontak pimini kontrol edin ve gerekirse %70 etanole batırılmış bir pamuklu çubukla ayarlayın. Ekran görünümünü, aksiyon potansiyellerinin statik üç milisaniye uzunluğundaki pencerelerde görüntülendiği ani yükselme algılama moduna değiştirmek için ani yükseliş dalga biçimi sekmesine tıklayın. MEA'daki nöronal ağı uyarmak için, stimülasyon artefaktını sınırlamak için kayıt ayarları sekmesi altındaki salpa algoritmasını eğitin, çevrimiçi ayarlar sekmesinde salpa'yı etkinleştirin.

Kayıt başladıktan sonra, bir elektrodu uyarmak ve çanaktaki tepkileri izlemek için açık döngü programını kullanmak üzere uygun bir stimülasyon paradigması oluşturmak için STEM sekmesine tıklayın. Açık döngü bölümünde uygun ayarları seçin ve ardından başlat'a basın. Ana ani artışlar sekmesinde ve ani dalga formları sekmesinde yanıtları görselleştirin.

Bu film, gelişmekte olan in vitro yedinci gün nöronlarını ve glial hücreleri, büyüdükçe ve mikro elektrotlar için bir MEA üzerinde bağlantılı bir ağ oluştururken tasvir ediyor. Bu, bir nöronal ağdan iki dakikalık spontan aktivitenin raster bir grafiğidir. Her siyah nokta bir aksiyon potansiyelini temsil eder.

Mavi oklarla iki aktivite patlaması gösterilir. Birden fazla elektrot üzerinden yanıt, ağ bağlantısının bir işlevidir. İşte 16 saniyelik uyaranla uyarılmış aktivitenin raster grafiği.

Kırmızı yıldızlar uyaranları temsil eder. Kırmızı oklar, birden fazla elektrot boyunca sinaptik aktivite patlamalarını başarıyla indükleyen beş uyaranı göstermektedir. Bazen bir uyaran bir patlamaya neden olmaz.

Burada mavi okta, size mikro elektrot dizileri üzerindeki nöronal ağlardan nasıl kültür kaydı yapılacağını ve uyarılacağını gösterdik. Muhtemelen endişelenilen en önemli şey, kültürlerin enfekte olmasını önlemek ve buharlaşmayı azaltmaktır. Bunun gibi yarı geçirgen zarlara sahip kapaklar kullanılırsa, sızdırmaz hale gelirler ve buharlaşmayı ve enfeksiyonu önlerler ve kültürleri aylarca, belki de bir yıldan fazla bir süre boyunca kültürleyebilirsiniz.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.