Name: IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Öğrenin, immunoprecipitation ve akış sitometrisi kullanarak protein-protein etkileşimlerini hassas bir şekilde analiz etme yöntemini. Bu teknik, genetik mühendislik gerektirmeden küçük örnek hacimleriyle çalışır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Eagles İnovasyon Ödülü (Eagles Kardeş Sipariş) ve Mayo Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Yerli protein-protein etkileşimleri ve akış sitometri multiprotein kompleksleri Yüksek hassasiyet algılama ve kantitatif analiz: ** Bu video protokolü ilişkili bir yayın 1 dayanmaktadır. Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang WA Schamel Ed Palmer. Bilim STKE 2007 (389): PL2 5 Haziran, 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2] <a href="http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/2007/389/pl2">Bu yayının görmek için buraya tıklayınız</a> . Başlamadan Önce, ardından Sulu Stok Çözümleri hazırlayın: <table><tbody><tr><td> MES Kaplin Tampon: </td><td> Mağaza 25 ° C </td></tr><tr><td> MES, pH 6.0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Su Verme / / Depolama (QBS) Tampon Engelleme: </td><td> Mağaza, 4 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Sodyum azid </td><td> % 0,02 </td></tr><tr><td> PBS, pH 7.4 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> FCM Tampon: </td><td> Mağaza, 4 ° C </td></tr><tr><td> Tris, pH: 7.4 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> Sodyum azid </td><td> % 0,02 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> % 5 </td></tr><tr><td> PBS, pH 7.4 </td><td> 1x </td></tr></tbody></table> Kullanım hemen önce hazırlayın: <table><tbody><tr><td> EDAC-MES: </td><td> MES Kaplin Tampon 50 mg / ml EDAC tozu çözülür </td></tr><tr><td> Digitonin solüsyonu (% 2 w / v): </td><td> 95 ısıtarak dH 2 O digitonin toz çözülür ° C 5min sonra buz üzerinde soğutma </td></tr><tr><td> Lizis Tampon: </td><td></td></tr><tr><td> Tris, pH: 7.4 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mm </td></tr><tr><td> Digitonin çözüm </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Proteaz inhibitörleri </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Buz üzerinde saklayın </td><td></td></tr></tbody></table> 1. Boncuk için mAb çiftlenmesi <ol><li> PBS içinde seyreltilmesi ve bir hemasitometre sayım tarafından satın alınan stok boncuk konsantrasyon belirleyin. Sayımı için boncuk 1:10000 seyreltme ile başlayın. </li><li> Pipet 18 x 1.5 ml mikrosantrifüj tüpe 10 6 boncuk. </li><li> Her yıkamadan sonra, 25 3 dakika 20.000 g ° C santrifüj, 0,5 - 1,0 ml MES Kaplin Tampon boncuk, 2 ya da 3 kere yıkayın. </li><li> 50 mcL MES Kaplin Tampon boncuklar tekrar </li><li> Taze hazırlanmış EDAC-MES 20 mcL ekleyerek boncuklar karboksil grubu etkinleştirin. </li><li> , 25 ° C'de elle yukarı ve aşağı pipetleme 15 dakika süreyle hafifçe karıştırın. </li><li> 25 3 dakika 20.000 g de santrifüj ° C Her yıkamadan sonra, 0,5 ila 1,0 ml PBS aktive boncuk, 2 ya da 3 kere yıkayın. </li><li> 50 mcL PBS içinde aktif boncuk süspanse edin. </li><li> Aktive boncuk çözüm IP mAb (0,2-1,0 mg / ml stok konsantrasyonu) 50 mcL ekleyin. </li><li> 25 ° C'de 3 ila 4 saat titreşimli çalkalayıcı tüp koyarak karıştırın. Tüpün alt boncuk yerleşme önlemek için yeterince çalkalayınız. </li><li> Yıkama mAb birleştiğinde boncuklar her yıkamadan sonra 0,5 - 1,0 mL PBS içinde 2 - 3 kez, 3 dakika 25 ° C 20.000 g de santrifüj. </li><li> 100 mcL QBS Tampon boncuklar tekrar Bu 4 ° C'de saklanabilir </li><li> Boncuk askıya iyi, PBS içinde 1:200-1:10,000 sulandırmak ve bir hemasitometre ile saymak. Konsantrasyonu her IP veya pull-down deneyde kullanılan boncuk sayısı tam olarak kontrol altına alınabilir, böylece, her preparatif parti için ölçülebilir olmalıdır. </li></ol> 2. Post-nükleer Lizat Hazırlama ve Ip Lizis yöntemi ve optimal lizis koşulları, hücre tipi ve protein-protein etkileşimleri incelenmektedir bağlıdır. Protokolleri bir dizi var ve uygulama için modifiye edilebilir. <ol><li> Lenfositler, veya 5 gibi 20 x 10 6 'küçük' hücreleri, Lyse x 10 makrofajlar ya da tümör hücrelerinin gibi 6 'büyük' ​​hücreleri, buz üzerinde 20 dk için 1.5 mL mikrosantrifüj tüp 100 mcL taze Lizis tampon . Gerektiği gibi lizis hacmi Ölçeği. </li><li> Çekirdek ve çözünmez hücresel enkaz kaldırmak için, 20.000 g de 10 dakika 4 ° C lizat santrifüj Süpernatantı tutun ve pelet iptal. </li><li> Karıştırmak için hafifçe pipetleme 0.5 x 10 açıklık lizat 5 ila 2,5 x 10 5 mAb çiftli boncuk, ekleyin. Minimum hacim için kullanabileceğiniz5 mcL tek bir IP gerçekleştirmek. </li><li> Dikey dönen bir tekerlek 4 saat gecede soğuk bir odaya yerleştirin. Boncuk yerleşmesini önlemek için yeterli hızına ayarlayın. Bu dönüşü sırasında tüpün alt kalmaya, düşük hacimli IP sıvı için kabul edilebilir. </li></ol> 3. Boncuk çekilen Protein Florokrom konjuge antikorlar ile problama <ol><li> 4 20.000 g santrifüj ° C Her yıkamadan sonra 3 dakika, 0,2 ila 1,0 mL buz FCM Tampon IP boncuk iki kez yıkayın. </li><li> Beş veya daha fazla bir baca alt plakası 1.5 mL mikrosantrifüj tüpler veya kuyuların her birine 100 mcL FCM Tampon ve kısım 20 mcL boncuk tekrar </li><li> Örnekleri florokrom-konjuge mAbs ekleyin. FCM üreticinin talimatlarına göre veya ampirik olarak tespit yoğunluklarına göre leke gerçekleştirin. Tüp başına ya da iyi bir başlangıç ​​noktası olarak, hisse senedi antikor çözüm 0,2-1 mcL (0,2-1,0 mg / ml) ekleyin ve 40 dakika buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Yıkama 1,0 mL buz FCM Tampon 4 20.000 g de santrifüj 1.5 ml tüpler iki kez boncuk probed ° C her yıkamadan sonra 3 dakika. Yavaşça, boncuklar rahatsız etmemek için özen, her yıkamadan sonra süpernatantı çıkarın. Baca alt plaka, 4, 5 dakika boyunca 1000g santrifüj, 0.2 ml buz FCM Tampon ile iki kez yıkamak ° C Her yıkamadan sonra. Bir çok kanallı pipet bu adım için yararlıdır. Bir baca alt plakası boncuk süpernatant kaldırmak için, plaka 'hareketiyle bir kez, sonra, hala baş aşağı iken, kuyuların kenarlarında herhangi bir damlar kurulayın. Her kuyuda rezidüel hacim, boncuklar içeren yaklaşık 20 mcL. </li><li> Numune başına 200 mcL FCM Tampon boncuklar tekrar Etiketli FACS tüpler aktarın. Örnekleri FCM hazır. </li></ol> 4. FCM Acquisition Bu protokol açıklanan KML boncuklar, çapı 3 ila 5 mikron, suskun bir fare lenfosit çapı yaklaşık yarısı. Bu nedenle, bu ölçekte kayıt boncuk olayların nüfus için elle Forward Scatter (FSC) amfi kazanç ve Side Scatter (SSC) gerilimi artırmak için gerekli olabilir. Bireysel IP boncuk tek bir sıkı kümelenmiş nüfus oluşturmalıdır. Ayarları ve kapı boncuk çiftlerin ve enkaz dışlamak için ayarlanabilir olmalıdır. <ol><li> Önce çalışan boncuk boncuk standartları, bazı sitometrelerinde numune girişi çevreleyen damlacık çevreleme kol çıkarın. Bu giriş temizlemek ve başka bir örnek üzerinden yürütülmektedir boncuk önleyecek şekilde kılıf sıvı örnekleri arasında damla izin verin. </li><li> Negatif ve pozitif floresan aşırı log ölçekli x ekseni aynı anda görünecek şekilde ayarlarını etiketsiz boncuk, floresan bir negatif kontrol ve Rainbow Kalibrasyon Parçacıklar (RCPs), floresan bir pozitif kontrol, kullanın. Bu deneysel örneklerinden floresan ölçekli olacağını garanti eder. Böylece FSC ve SSC parametrelerin yanı sıra kapı konumu, geçici olarak bu örnek için değişiklik gerekebilir RCPs KML boncuk daha küçük olduğunu unutmayın. </li><li> RCPs ile kalibrasyon tamamlandıktan sonra etiketsiz-boncuk ayarlarına geri dön. Örnek başına sadece bir floresan prob kullanılması durumunda, hiçbir floresan tazminat gereklidir. Genel olarak, tek başına bir FCM örnek florokrom-konjuge mAb ile multiprotein kompleksleri probu, ve çeşitli alt birimden özel mAbs paralel boncuk örnekleri boyama ile birden fazla etkileşim ortakları incelemek. </li><li> Floresan veri dosyaları Edinme ve kaydedin. Analizi sonra flow sitometri gibi CellQuest, FlowJo yazılım veya CFlow kullanılarak yapılabilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2066/2066fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Fare suşu TCR/CD3 multiprotein kompleksi için IP-FCM T hücreleri BALB / c 1% digitonin parçalanan, ve anti-CD3ε boncuklar kullanarak IP-FCM lizat maruz kaldı. Yakalanan kompleksleri TCR-β önemli miktarda (mor bölge) bulunan ve co-ilişkili CD3-ε (yeşil), ancak yakın gibi Thy1.2 gibi diğer proteinlerin arka plan düzeyleri (alakasız immünglobulin probu, pembe iz tarafından tanımlanan), CD45, ya da H-2K (d) (kahverengi, turuncu ve mavi izleri, sırasıyla). Daha önce yayınlanmış benzer sonuçlar: 1-6.

<ol><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+division+and+death+are+segregated+by+mutation+of+TCRbeta+chain+constant+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains.</a> Immunity. 21, 515-526 (2004).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+T+Cell+receptor+signals+determine+CD8%2B+memory+versus+effector+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development.</a> Science. 323, 502-505 (2009).</li>
<li>Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctate+is+a+key+element+in+calcium+entry+induced+by+activation+of+InsP3+receptors+and%2For+calcium+store+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion.</a> J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).</li>
<li>Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+engagement+by+peptide-MHC+ligands+induces+a+conformational+change+in+the+CD3+complex+of+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes.</a> J Exp Med. 201, 517-522 (2005).</li>
</ol>

Protein-protein etkileşimleri hakkında bilgiler, sinyal iletimi, soy olgunlaşma, hücre döngüsü ilerlemesi, ve apoptozis kaskadlar gibi birçok hücresel süreçlerin analiz son derece alakalı. IP FCM proteinlerin etkileşimi incelemek ve kendi ana yapısındaki multiprotein kompleksleri üyeleri tanımlamak için, hızlı, kantitatif ve hassas bir şekilde sağlar. Boncuk ve hücre lizatları ile inkübe birleştiğinde, bir günde ve probed ve ertesi gün analiz edilebilir olabilir. 96-plaka biçimi, etkin veri toplama, istatistik veya tarama amacıyla sağlamak için bir anda analiz edilmesi gereken çok sayıda numune sağlar. Floresan boncuk standartlarını kullanarak, her bir boncuk tarafından yakalanan proteinlerin sayısını tahmin edilebilir. Çok küçük kaynak materyal yakalama ve tespiti için gerekli, bu yüzden sınırlı örnekler ve kıt analitler hala çok etkileşim için analiz edilebilir. IP-FCM fizyolojik olmayan bir ortamda proteinlerin karıştırma, genetik mühendisliği, epitop etiketleme, denatürasyon, ya da in-vitro gerektirmese de, uygulanabilirliği ile erişilebilir ve değerli bir araç, bu ve diğer teknikler ile birleştiğinde olabilir birçok biyolojik sistemler. Sorun Giderme: Birçok IP FCM deneyler yararlı protein etkileşim verileri ilk kez denenir üretir. Ancak, IP-FCM optimizasyonu, boncuk, protein kompleksi yakalama ve bağlayıcı floresan prob antikor konjugasyon artırabilir. IP antikor konjugasyon verimliliği doğrudan bir anti-immünglobulin antikor ile birleştiğinde boncuk problama tarafından tespit edilebilir. Bu verimliliği düşükse, kaplin reaksiyon sırasında antikor konsantrasyonunu arttırarak daha fazla IP antikorları her boncuk takmak için izin verebilirsiniz. Bu analitlerin gelişmiş yakalama ve algılama, IP boncuk toplu bağlama kapasitesi artırabilir. Diğer birincil amin içeren moleküllere (örneğin Tris, sığır serum albumin), bu düşük mAb kaplin boncuk eki ve sonuç için mAb ile rekabet gibi kaplin reaksiyon sırasında mevcut olmamalıdır. Boncuk mAb konjugasyon başka nedenlerden dolayı sorun olursa, boncuk yerine avidin / streptavidin birleştiğinde olabilir ve biotinlenmiş antikorlar daha sonra non-kovalent bağlı immunprecipitation için kullanılan olabilir. Iyi antikor konjugasyon rağmen, boncuk ilişkili floresan ilk algılama düşük olabilir. Birincisi, karmaşık yakalama kendisi düşük olabilir. IP-FCM, birim lizis hacim başına parçalanan hücrelerin sayısı artan analit konsantrasyonuna bağlı olduğundan analit yakalama ve algılama artırabilir. Ayrıca, yakalama, yakalanan az boncuklar arasında kompleksleri, ve probed boncuk başına ortalama floresan sonuçları dağıtır lizat ile inkübe IP boncuk sayısının azaltılması artabilir. İkincisi, yakalanan kompleksleri prob antikor erişim sterik immunoprecipitating antikor tarafından engellendiği mümkündür. Bu durumda, sorun ve / veya prob yakalamak için farklı antikorları kullanarak ele alınabilir.

<table><tbody><tr><td>karboksilat modifiyeli polistiren lateks (CML) boncuklar (5mm sürfaktan içermeyen)</td><td>Reaktif</td><td>Interfacial Dynamics</td><td>2-5000</td><td>4&amp;#x00B0;C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Gökkuşağı Kalibrasyon Partikülleri</td><td>Reaktif</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>RCP-30-5A</td><td>4&amp;#x00B0;C'de saklayın.</td></tr><tr><td>2-[N-Morfolino] etansülfonik asit (MES)</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-5287</td><td></td></tr><tr><td>1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodimid HCl (EDAC)</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22980 E-6383</td><td>-20&amp;#x00B0;C'de, kurutucu koşullar altında saklayın.</td></tr><tr><td>AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64 ve Leupeptin içeren Genel Kullanım Proteaz İnhibitör Kokteyli</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2714</td><td> H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O içinde 100x stok çözelti hazırlayın. Alikotlayın ve -20&amp;#x00B0;C'de saklayın. Eldivenle kullanın.</td></tr><tr><td>PCR plakaları, 96 kuyucuklu 0,2mL, doğal, yüksek bacalı</td><td>Reaktif</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-230</td><td>FCM boyama sırasında mikro santrifüj tüpleri yerine kullanılmak üzere</td></tr></tbody></table>

ip fcm: sitometrisi ile algılandı immunoprecipitation

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Flow sitometri (IP-FCM) tarafından tespit Immunoprecipitation protein-protein etkileşimleri tespit edilmesi ve ölçülmesi için etkili bir yöntem. Temel ilke yakalanan birincil analit multiprotein kompleksleri içinde fiziksel olarak ilişkili diğer molekülleri ile birlikte tespit edilebilir neyin sandviç ELISA uzanır. Prosedürü, monoklonal antikorlar (mAb) belirli bir protein ilgi immunoprecipitating hücre lizatları bu boncuklar kuluçka florokrom-konjuge problar ile yakalanan protein kompleksleri sondalama ve boncuk ilişkili floresan flow sitometri analiz ile polistiren lateks mikro kovalent kaplin içerir. IP-FCM, son derece duyarlı, kendi ana (denatüre) devlet proteinlerin analizi sağlar ve iki yarı-kantitatif veya kantitatif analiz için uygun. IP-FCM ek avantajlar olarak, bir akış sitometresinde dışında hiçbir genetik mühendisliği ya da özel ekipman gerektirir ve yüksek hacimli uygulamalar için kolayca adapte edilebilir.

Genetik mühendisliği ya da büyük örneklem büyüklüğü gerektirmeden, hassas bir doğal protein-protein etkileşimleri, sağlam, biyokimyasal değerlendirme sağlar IP-FCM yöntem sunulmuştur.

IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation

Akış sitometrisi ile saptanan immünopresipitasyon (IP-FCM), protein-protein etkileşimlerini saptamak ve niceliksel olarak belirlemek için verimli bir yöntemdir. Temel ...

IP FCM deneylerinde, birlikte etkileşime giren farklı proteinleri tanımlamak ve incelemek amacıyla protein kompleksleri boncuklar üzerinde yakalanır. İlk olarak, ilgi duyulan proteine özgü bir immünopresipite edici antikor, polistiren lateks boncuklara kovalent olarak bağlanır. İkinci adımda, bu boncuklar hücre lizatları ile inkübe edilerek spesifik proteinin ve etkileşen proteinlerin boncuklara bağlanması sağlanır.Boncuklar, yakalanan proteinlerle birlikte yıkanır ve ardından immün çöktürülmüş proteinle ilişkili olabilecek çeşitli moleküllere özgü floresan işaretli antikorlar ile problanır. Son olarak, floresan işaretli boncuklar, yakalanan komplekslerde hangi proteinlerin mevcut olduğunu veya hangilerinin eksik olduğunu belirlemek için akış sitometrisi ile analiz edilir. Bu tekniğin, immün çöktürme sonrası western blotting gibi diğer yöntemlere göre avantajı, I-P-F-C-M'nin genetik mühendisliği veya büyük örnek boyutları gerektirmeden doğal protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesine olanak tanımasıdır.I-P-F-C-M, küçük hacimler ve düşük analit konsantrasyonları ile gerçekleştirilebildiği için analiz için çok az biyomalzeme mevcut olduğunda bile yüksek bir sinyal-gürültü oranı sağlayabilir. Bu prosedüre başlamak için şu tamponları hazırlayın: MES kenetleme, tampon söndürme bloklama saklama tamponu (kısaca QBS) ve akış sitometrisi veya FCM tamponu. Karboksilat modifiyeli polistiren lateks boncukların veya CML boncuklarının konsantrasyonunu, PBS ile seyrelterek ve bir hemositometre ile sayarak belirleyin.Boncukların konsantrasyonu belirlendikten sonra, 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne 18 × 10⁶ boncuk pipetleyin. Boncukları, oda sıcaklığında 20.000 ×g'de üç dakika santrifüj ederek 0,5 ila 1 mL MES kenetleme tamponu ile iki ila üç kez yıkayın. Her yıkamadan sonra boncuklar santrifüj edilirken.Boncukların aktivasyonunda kullanmak üzere taze e dac MES tamponu hazırlayın. Yıkama işlemleri tamamlandığında, tamponu oda sıcaklığında veya buz üzerinde muhafaza edin. Son yıkamadan sonra, boncukları 50 µL MES kenetleme tamponu içinde yeniden süspande edin.Ardından, boncuk süspansiyonuna 20 µL EEC MES ekleyin. Boncuklar üzerindeki karboksil gruplarını aktive etmek için, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca manuel olarak sürekli pipetleyerek nazikçe karıştırın. Bu adım zahmetli olsa da, bu karıştırma yöntemi karıştırma sonrası en iyi sonuçları verir.Aktifleşmiş boncukları, oda sıcaklığında üç dakika boyunca 20.000 ×g hızında santrifüj ederek 0,5 ila 1 mL PBS ile iki ila üç kez yıkayın. Son yıkama işleminin ardından, IP antikorunu boncuklara bağlamak için aktifleşmiş boncukları 50 µL PBS içinde yeniden süspanse edin. 0,2 ila 1 mg/mL arası stok konsantrasyondaki IP monoklonal antikorundan 50 µL ekleyin.Antikor dışında primer amin içeren hiçbir molekülün bulunmadığından emin olun. Tris veya sığır serum albümini gibi amin içeren bu moleküller, boncuklara bağlanma konusunda antikor ile rekabete girer. Boncuk-antikor süspansiyonunu oda sıcaklığında, titreşimli bir çalkalayıcı üzerinde üç ila dört saat boyunca karıştırın.Boncukların tüpün dibine çökmesini önlemek için yeterince çalkalayın. Bağlanma işleminden sonra, antikor kaplı boncukları 0.5 ile 1 mL PBS içinde 20.000 ×g'de santrifüj ederek iki ila üç kez yıkayın.Her yıkamadan sonra oda sıcaklığında üç dakika boyunca çöktürün. Son olarak boncukları 100 µL QBS tamponunda yeniden süspande edin. Monoklonal antikorların CML boncuklarına bağlanması, boncukların IgG'ye karşı florokonjuge antikorlarla boyanmasıyla kontrol edilebilir.FCM analizinin ardından, monoklonal antikor ile kaplanmış boncuklar, bir IP deneyinde kullanılmaya hazır hale gelene kadar dört derece santigrat sıcaklıkta saklanabilir. Öncelikle, boncukları PBS içinde 1/200 ile 1/10.000 arasında iyi bir şekilde seyreltip süspansiyon haline getirin ve bir hemositometre ile sayın. Her bir IP deneyinde kullanılan boncuk sayısı hassas bir şekilde kontrol edilebilmesi için her hazırlık grubunun konsantrasyonu ölçülmelidir.Ardından, su içerisinde %2 ağırlık/hacim oranında taze digestion çözeltisi hazırlayın. Beş dakika boyunca 95 °C'ye ısıtın. Daha sonra buz üzerinde soğutun.Taze hazırlanmış liziz tamponu ile hacim başına %1 ağırlık oranında seyreltin ve buz üzerinde bekletin. Liziz edilecek hücre sayısını belirlemek için kılavuz olarak gösterilen tabloyu kullanın. Ancak, gerekli hücre sayısı ilgilenilen proteine göre değişir ve ampirik olarak belirlenmelidir.Burada, küçük lenfositik tümör hücre hattından 30 × 10⁶ hücre kullanılır. Gerekli hücre süspansiyon hacmini 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri 20.000 ×g'de çöktürün.Dört santigrat derecede 30 saniye boyunca santrifüjleyin ve medyumu aspire edin. Pellet üzerine uygun miktarda taze hazırlanmış dig lizis tamponu ekleyin ve pipetle aşağı yukarı hareket ettirerek nazikçe karıştırın.Ardından hücrelerin buz üzerinde 20 dakika boyunca liz olmasını bekleyin. Hücre tipine ve çalışılan protein-protein etkileşimlerine bağlı olarak hücre liz koşullarının değişebileceğini ve liz işleminin tamamlandığının ampirik olarak belirlenmesi gerektiğini unutmayın. Lizatı 20.000 ×g hızında santrifüj ederek çekirdekleri ve çözünmeyen hücresel kalıntıları uzaklaştırın.Dört derece santigrat sıcaklıkta 10 dakika boyunca yer çekimi ile çöktürün. Hedef proteini antikor kaplı boncuklara bağlamak için SNA'yı saklayın ve peleti atın. Berraklaştırılmış lizata, nazikçe pipetleyerek 50.000 ile 250.000 arasında monoklonal antikor bağlı boncuk ekleyin.Tek bir IP için kullanılan minimum lizat hacmi beş mikrolitredir. Berraklaştırılmış lizat ve boncuk karışımını, boncukların çökmesini önleyecek yeterli hızda ayarlanmış bir soğuk odadaki dikey döner tekerleğe dört saatten gece boyunca kalacak şekilde yerleştirin; rotasyon sırasında sıvı tüpün dibinde kalabilir. Hedef proteinin IP antikoruna bağlanmasının ardından.İmmün kompleksin floresanla işaretleme işlemine geçin. IP boncuklarını, 4 °C'de üç dakika boyunca 20,000 ×g'de santrifüj ederek bir mililitre buz gibi soğuk FCM tamponu ile iki kez yıkayın. Her yıkamadan sonra boncukları 100 µL FCM tamponu içinde yeniden süspanse edin ve beş veya daha fazla tüpe 20 µL'lik porsiyonlar halinde paylaştırın.1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpleri veya konik tabanlı bir plakanın kuyucukları. Her ikisi de burada gösterilmiştir. Florokrom konjuge monoklonal antikorları numunelere ekleyin.FCM boyamasını tedarikçinin talimatlarını izleyerek veya başlangıç noktası olarak ampirik olarak belirlenen konsantrasyonlara göre gerçekleştirin. Tüp veya kuyucuk başına, konsantrasyonu en az 0,1 mg/mL olan stok antikor çözeltisinden 0,2 ila 1 µL ekleyin ve buz üzerinde 40 dakika inkübe edin. Problanmış boncukları 1,5 mL'lik tüplerde, 1 mL buz soğuk çözelti ile iki kez yıkayın.FCM tamponu ile, 4 °C'de üç dakika boyunca 20,000 ×g hızda santrifüjleyin. Her yıkamadan sonra, boncukları rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı nazikçe uzaklaştırın.Alternatif olarak, bir chimney (baca) için, alt plakayı 4 °C'de beş dakika boyunca 1000 ×g'de santrifüj ederek 0.2 µL buz gibi soğuk FCM tamponu ile iki kez yıkayın. Her yıkamadan sonra, her yıkamadan sonra. Süpernatantı boncuklardan uzaklaştırmak için plakayı bir kez hafifçe sallayın, ardından plaka hala ters durumdayken kuyucukların kenarlarındaki damlaları kurulayın.Boncukları içeren her kuyucukta yaklaşık 20 µL kalıntı hacim kalacaktır. Örnek başına 200 µL FCM tamponu içerisinde süspande edilen boncukları etiketli faks tüplerine aktarın. Örnekler artık Becton Dickinson akış sitometreleri ile akış sitometrisi veya FCM analizi için hazırdır.Numune girişini veya emiş ucunu çevreleyebilecek olan damlacık tutma kılıfını çıkarın. Numuneler arasında emiş ucunun damlamasına izin verin; bu, boncukların bir numuneden diğerine taşınmasını önleyecektir. Burada kullanılan CML boncukları üç ila beş mikrometre çapındadır ve bu değer, durgun bir fare lenfositinin çapının yaklaşık yarısına denk gelir.Bu nedenle, boncuk olayları popülasyonununle sitometrede kaydedilebilmesi için ileri saçılım amplifikatör kazancı ve yan saçılım voltajının manuel olarak artırılması gerekebilir. Burada bu işlem, işaretlenmemiş veya boş boncuklar kullanılarak yapılır. Okuma işleminden önce, boncukları, dubletleri ve döküntüleri hariç tutmak için kapılama ayarları düzenlenir.Deneysel örnekler, floresansın ölçekle uyumlu olmasını sağlar. İşaretlenmemiş boncuklar floresans için negatif kontrol görevi görür ve gökkuşağı kalibrasyon partikülleri veya RCP'ler floresans için pozitif kontrol olarak kullanılabilir. RCP'ler, CML boncuklarından daha küçük olduğundan, söz konusu örnek için ileri saçılım ve yan saçılım parametrelerinin yanı sıra geçiş pozisyonunun geçici olarak değiştirilmesi gerekebilir.Bu kalibrasyonların ardından, negatif ve pozitif floresans uç noktaları logaritmik bir eksende görselleştirilir. RCP'ler ile kalibrasyon tamamlandığında, ileri ve yan saçılım (forward and side scatter) için etiketsiz boncuk ayarlarına geri dönün. Burada gösterilen deneyde olduğu gibi, örnek başına yalnızca bir floresan prob kullanıldığı sürece floresans kompanzasyonuna gerek yoktur.Şimdi, hücre Quest veya FlowJo gibi akış sitometrisi yazılımları kullanılarak daha sonra gerçekleştirilecek olan analiz için floresan veri dosyalarını edinin ve kaydedin. Burada, %1 digit toin içindeki fare T-hücresi LY'sinin bir IP FCM analizinin sonucu yer almaktadır. TCR CD three non-protein kompleksi, anti CD three epsilon boncukları ile çöktürülmüştür.Yakalanan kompleksler, önemli miktarlarda TCR beta ve beraberinde ilişkili CD three epsilon içerir. İlgisiz bir immünoglobulin probu veya TH 1.2, CD 45 veya H two KD proteinlerine karşı antikorlar kullanılarak yapılan belirlemelerde, diğer proteinlerin arka plan seviyelerine yakın miktarlarda olduğu tespit edilmiştir. Bu tekniğin, immünopresipitasyon ve ardından gelen western blotting gibi diğer yöntemlere göre avantajı, I-P-F-C-M'nin genetik mühendisliği veya büyük örneklem boyutlarına ihtiyaç duymadan doğal protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesine olanak tanımasıdır. I-P-F-C-M, küçük hacimlerle ve düşük analit konsantrasyonlarıyla gerçekleştirilebildiği için, analiz için mevcut biyomalzeme miktarı çok az olduğunda bile yüksek sinyal-gürültü oranları sağlayabilir.

ip-fcm-immunoprecipitation-detected-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, periferik kan mononükleer hücre kültüründen genişletilen sitokin kaynaklı öldürücü T hücrelerinin, CIK hücrelerinin oranını belirlemek için akış sitometrisine dayalı bir teknik gösteriyoruz.

Akış Sitometrisi ile İnsan Sitokin ile İndüklenen Öldürücü Hücrelerin CD İşaretleyici Tanıması

Bimoleküler Floresan tamamlama akış sitometrik analizi protein-protein etkileşimleri incelemek için bir yüksek kapasiteli nicel yöntem sağlar. Bu metodoloji, eşleme protein bağlama siteleri ve protein-protein etkileşimleri düzenleyen faktörler taranması için uygulanabilir.

Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

Akış sitometresi ile bağışık hücrelerin tanımlanmış alt grupları ile nanopartikül etkileşim analizi.

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

İnflamasyon, iskemik inme patogenezinde merkezi bir rol oynar. Artan kanıtlar, erken beyin hasarını şiddetlendiren iki ucu keskin bir kılıç gibi davrandığını, ancak aynı zamanda daha sonraki onarıma da katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bu protokol, immün hücrelerin iskemik beyinden izolasyonunu ve müteakip akış sitometrik fenotiplemesini tanımlar.

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Sitometresi tabanlı hücresel bağlama tahlil anlatılan ve öncelikle bir tarama aracı olarak bir fluorescently etiketli CXC Kemokin ligand 12 (CXCL12) bağlama CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) inhibe bileşikler tanımlamak için kullanılan bir akış.

Fluorescently etiketli CXC Kemokin Ligand 12 CXC Kemokin reseptör 4 için bağlama bozabilir bileşikler tanımlamak için Akış Sitometresi tabanlı tahlil

Bu makalede bağışıklık hücreleri yağ dokusu ve daha sonraki analiz Akış Sitometresi kullanarak yalıtım tarafından yağ dokusu bağışıklık hücre içeriğini analiz etmek için bir yöntem.

Akış Sitometresi kullanarak insan yağ dokusu içinde bağışıklık hücreleri karakterizasyonu

Akış Sitometresi Imaging hücreleri, bireysel ve populational düzeyde morfolojik ve fonksiyonel İLETİMLERİNİZE algılamak için ideal bir yaklaşım sağlar. Kirletici günese maruz kalan insan dendritik hücrelerinde lipid antijen sunumu için kesintiye endositik işlevi bir kombine transcriptomic gen ekspresyonu ve protein ticareti morfolojik gösteri profil oluşturma ile gösterilmiştir.

Görüntüleme akış sitometresi ve değiştirilmiş endositik CD1d kaçakçılığı değerlendirmek için profil oluşturma Transcriptomic entegre

Diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi ile karakterizasyonu, implantlara karşı immün yanıt paterninin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu makale, diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrik analizi için boyanması için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

Bu protokol, insan nötrofilleri üzerinde β2 integrin aktivasyonunu inhibe eden küçük moleküllü ilaçları tanımlamak için akış sitometrisi tabanlı, yüksek verimli bir tarama yöntemini açıklar.

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

Bu çalışma, izole beyin mikrogliasında intranükleer akış sitometrisi kullanılarak küresel histon modifikasyonlarının ölçülmesi için bir protokolü açıklamaktadır. Çalışma ayrıca veri toplama için kullanılan mikroglia izolasyon protokolünü de içermektedir.

İzole Fare Beyni Mikrogliasında İntranükleer Akış Sitometrisi Kullanılarak Global Histon Post Translasyonel Modifikasyonların Miktar Tayini

Yaralı omuriliklerde mikroglia (MG) ve periferik infiltre makrofajları (Mø) tanımlamak zordur. Bu protokolde, sırasıyla M1 benzeri MG, M2 benzeri MG, M1 benzeri Mø ve M2 benzeri Mø'yu tanımlamak için akış sitometrisi (FCM) kullanıldı. Bu teknoloji, MG ve Mø'nun rolünü anlamak için diğer merkezi sinir sistemi hastalıklarına da uygulanabilir.

Akış Sitometrisi Kullanılarak Yaralı Omurilikteki Mikroglia ve Periferik İnfiltre Makrofajların Belirlenmesi

Öğrenin, immunoprecipitation ve akış sitometrisi kullanarak protein-protein etkileşimlerini hassas bir şekilde analiz etme yöntemini. Bu teknik, genetik mühendislik gerektirmeden küçük örnek hacimleriyle çalışır.

IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation

Daha fazla video keşfet