Name: Riboprobes kullanarak Kelebek pupa Wings in situ Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Keşfedin, Bicyclus anynana kelebek pupa kanatlarında riboprobes kullanarak in situ hibridizasyon protokolünü. Bu yöntem, gen ifadesi analizi ve gelişimsel biyoloji araştırmaları için optimize edilmiştir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Jayne Selegue Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadiç Bob Reed, Roche Teknik Destek Bu protokol sorunları giderme konusunda yardım için teşekkür ederim. Biz de film düzenleme William Piel tavsiye için teşekkür ederim.

1. GÜN <ol><li> Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: <ul><li> 10x PBS </li><li> 1x PBS </li><li> 1x PBT </li><li> GKD 2 O <ul><li> % 0.1 &#39;lik toplam hacmi DEPC ekleyin ve şiddetle çözümler sallamak. </li><li> Otoklav. </li></ul></li><li> % 4 Paraformaldehit Fix - PBS-DEPC </li><li> Proteinaz K çözüm çökelti varsa, vorteks şiddetle kısım çıkarmadan önce </li><li> Sindirim Durdur Tamponu </li><li> Prehybridization Tampon </li><li> 50:50 PBT: Prehybridization Tampon </li><li> Hibridizasyon Tampon <ul><li> Çözümler RNaz ücretsiz tutulmalıdır. Ya da pişmiş cam eşya (4 saat 250 ° C) ya da atılabilir plastik kullanın. Serolojik pipetler çözümleri yapmak için çok kullanışlıdır </li></ul></li></ul></li><li> PBS içinde kanatları teşrih zaman aşamalı pupa </li><li> Oda sıcaklığında 24 kuyu kültür plaka kuyularda Tampon saptamak için doğrudan kanatları hareket ettirme </li><li> 2 saat için diskler Fix </li><li> PBT olarak 5 x 5 dakika yıkayın </li><li> Proteinaz K çözüm, 3 dakika boyunca kanatları inkübe </li><li> Sindirim Durdur Tamponu 2 x durulayın </li><li> PBT olarak 5 x 5 dakika yıkayın </li><li> 50:50 PBT 2 x 5 dakika Yıkama: PHB </li><li> PHB olarak 1 x 10 dakika yıkayın </li><li> PHB en az 1 saat inkübe 55 ° C. </li><li> Isı doğasını RNA prob (20 50ng de her ihtiyaç) (80 ° C 5 dakika) ve hibridizasyon tamponu (ul 100 de ortalama gerekli) </li><li> Kuyulara prob ekleyin ve 55 az 48 saat inkübe ° C </li></ol> 3. GÜN <ol><li> 4 x 5 dakika yıkayınız 55 ° C PHB </li><li> 55 PHB gece inkübe ° C </li></ol> 4. GÜN <ol><li> Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: <ul><li> Antikor Blok Tamponu </li></ul></li><li> PHB: 50:50 PBT 1 x 5 dakika yıkayın </li><li> PBT içinde 4 x 5 dakika yıkayın </li><li> 4 Blok Tampon 1 saat inkübe kanatları ° C </li><li> 4 geceleme anti-Kazı antikor 1:2000 dilüsyon kanatları inkübe ° C </li></ol> 5. GÜN <ol><li> Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: <ul><li> Algılama Tampon </li></ul><ul><li> Gelişmekte olan Çözümü - ışığa karşı hassastır (folyo ile sarın) </li></ul></li><li> Oda sıcaklığında PBT 3 x 5 dakika yıkayın </li><li> PBT yıkayın 7 x 5 dakika </li><li> Algılama Tampon kanatları iki kez durulayın </li><li> Çözüm Geliştirme 1 ml kanatları geliştirin gelişme zamanı her zaman kontrol edilmelidir gelişmekte kez aynı probları ve gelişmekte olan çözümü kullanırken bile değiştirebilirsiniz genellikle gecede aralıklarla kadar artırmaya sonra 5-10 dakika sonra kontrol edin ve. Plaka örnekleri kontrol ışığa maruz önlemek için folyo sarılı olmalıdır. </li><li> Gelişmekte olan Durdur Tampon beş kez durulayın </li><li> Kanatları Dağı. </li></ol>

<ol><li>Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+and+eyespot+determination+in+butterfly+wings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings.</a> Science. 265, 109-114 (1994).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+in+formamide+protects+RNA+from+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Solubilization in formamide protects RNA from degradation.</a> Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).</li>
<li>Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+a+hedgehog+regulatory+circuit+in+butterfly+eyespot+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution.</a> Science. 283, 532-534 (1999).</li>
<li>Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+transformation+of+the+butterfly+Bicyclus+anynana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+%28Suppl%29%22%5BJournal%5D)">Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana.</a> Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).</li>
<li>Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+insights+into+questions+of+lepidopteran+wing+pattern+homology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology.</a> BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).</li>
<li>Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+control+of+transgene+expresson+using+laser+induction+of+the+hsp70+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter.</a> BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).</li>
<li>Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+function+in+butterfly+wings+and+the+evolution+of+insect+wing+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns.</a> 9, 109-115 (1999).</li>
</ol>

Mevcut protokollerin optimizasyonu Larva kanat disklerine yerinde döllemeler başarıyla Precis coenia kelebekler diskler kullanılarak yapılmıştır (Carroll ve ark 1994; Keys ve ark 1999; Weatherbee ve ark 1999). Protokolü larva kanat renklendirmeler Carroll Lab isteği üzerine ayrıntılı bir yazılı protokol adapte edilmiştir. Yapılan değişiklikler, larva ve pupa kanat dokular arasındaki farklılıkları barındırmak için hizmet vermektedir. Pupa hindwing diseksiyonlar sırasında peripodial membran kuyuları dahil edilmelidir. Protokolünde ilk...

<table><tbody><tr><td>Fiksasyon Tamponu</td><td></td><td></td><td></td><td>PBS içinde %4 Paraformaldehit</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td></td><td>PBS içinde %0.1 Tween 20</td></tr><tr><td>Proteinaz K çözeltisi</td><td></td><td></td><td></td><td>PBT içinde 2.5&amp;#109;g/ml Proteinaz K</td></tr><tr><td>Sindirim Durdurma Tamponu</td><td></td><td></td><td></td><td>PBT içinde 2 mg/ml glisin</td></tr><tr><td>Pre-Hibridizasyon Tamponu</td><td></td><td></td><td></td><td>50 ml PHB için: 12 ml DEPC işlem görmüş su + 25 ml Formamid + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml somon spermi (Rnase içermeyen, çözeltiye eklenmeden önce ısı ile denatüre edilmiş).</td></tr><tr><td>Hibridizasyon Tamponu</td><td></td><td></td><td></td><td>Pre-hibridizasyon tamponuna 1 mg/ml glikojen ekleyin</td></tr><tr><td>Bloklama Tamponu</td><td></td><td></td><td></td><td>50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, %0.5 IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA</td></tr><tr><td>Anti-DIG</td><td>Ab</td><td>Roche Group</td><td>11 093 274 910</td><td>Alkalin Fosfataz konjuge</td></tr><tr><td>DIG Yıkama ve Bloklama Tampon Seti</td><td></td><td>Roche Group</td><td>11 585 762 001</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Mount Aqueous Mounting Medium</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0612</td><td>Kapatma Mediumu </td></tr></tbody></table>

riboprobes kullanarak kelebek pupa wings in situ protokolü

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

Burada, video formatı, riboprobes kullanarak kelebek Bicyclus anynana pupa kanatları in situ döllemeler için bir protokol mevcut. Yerinde döllemeler, gelişim biyolojisi bir dayanak noktası, transkripsiyon düzeyinde, gelişmekte olan dokularda gen ekspresyonu mekansal ve zamansal desen çalışması için faydalıdır. Gen transkripsiyonu ve protein ürünleri hedef alan antikorlar henüz geliştirilen ve / veya mevcut antikorlar kullanılarak ayırt edilemez genomunda belli bir protein birden fazla gen kopyaları bulunmaktadır edilmemiştir varsa, situs yerine kullanılabilir. Larva kanat diskler için yerinde teknik bir kaç yıl için kelebek topluluk olmasına karşın, mevcut protokol daha büyük ve daha kırılgan bir pupa kanatlar için optimize edilmiştir.

Bicyclus anynana pupa kanat dokusu gen ekspresyonu incelemek için, riboprobes kullanarak yerinde döllemeler için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Biz de bu protokolün diğer lepidopteran türlerin pupa kanatları kullanmak için daha fazla optimizasyon için yönergeler sağlar.

Riboprobes kullanarak Kelebek pupa Wings in situ Protokolü

Burada, riboproblar kullanılarak kelebek *Bicyclus anynana*'nın pupa kanatlarında in situ hibridizasyon için bir protokolü video formatında sunuyoruz. In situ...

Bu, pupa evresindeki kelebek kanatları için hazırlanan bir ceto protokolüdür. İşleme, kafesteki prepupaları toplayarak, onları bir tepsiye yerleştirerek ve ardından time-lapse (zaman ayarlı) fotoğrafçılık kullanarak kesin PPU pupa sürelerini fotoğraflayarak başlarız. Bu yöntem, pupalasyon gerçekleştikten sonra boyamaları kesin zamanlarda yapmamıza olanak tanır.Bu durum önemlidir çünkü farklı proteinler için farklı mRNA'lar, pupasyon sonrasının farklı zamanlarında eksprese edilir. Burada, pupa kanatlarını silikon tabanlı bir Petri kabı içerisinde diseke ediyoruz; önemli olan nokta, kanatları çıkarıp fiksasyon çözeltisine çok düz olacak şekilde yerleştirmektir. Eğer bu aşamada düz olmazlarsa, bir daha asla düzleşmezler.Uygun fiksasyon süresinden sonra, fiksasyon tamponu uzaklaştırılır ve beş kez yıkama yapılır. PBT işleminde proteinaz K adımı oldukça kritiktir ve probun bağlanabilmesi için dokuları permeabilize etmek amacıyla kullanılır; bu nedenle, durulama ve yıkama işlemleriyle doğru zamanda durdurulmalıdır. Somon spermi, probun rastgele her yere bağlanmasını önlemek için ucuz bir DNA kaynağı olarak işlev görür.Sperm, pre-hibridizasyon tamponunun bileşenlerinden biridir. Burada sp

in-situ-protocol-for-butterfly-pupal-wings-using-riboprobes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Burada, biz verimli bir yüksek kapasiteli...

Yüksek Verimli In situ</emFetal Fare Alt Ürogenital Yolu mRNA İfade Desenler Karakterize> Hibridizasyon Yöntemi

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

RNA<em&gt; Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi&gt; Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış

Xenopus laevis embriyosu, büyük boyutu ve manipülasyon kolaylığı nedeniyle erken gelişim çalışmalarında son derece yararlı olmaya devam ediyor.   Bu model sistemde belirli organların tanımlanmasında kullanılabilecek tam montajlı in situ hibridizasyon protokolü için basitleştirilmiş bir protokol sağlanmıştır.

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez<em&gt; In Situ</emIçinde&gt; Hibridizasyon Protokolü<em&gt; Ksenopus</em

Biz renkli çökeltilerin zıt üç farklı mRNA dağıtım desen eşzamanlı ve belirli algılama izin bozulmamış Drosophila embriyolar bir çoklu hedef kromojenik tüm montaj in situ hibridizasyon (MC-DİLERİZ) prosedürü açıklar.

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Doğru bir şekilde transkript veya proteinler Drosophila dokularda algılama yeteneğini kendi bereket ve yerelleştirme için geliştirme süreci ile ilgili eğitim için önemlidir. Pupa kanatları incelemek için basit bir yordam açıklaması burada. Bu kanatlar örnekleri çeşitli teknikler (immünhistokimya, PCR tahlil, vb) olarak kullanılabilir.

Drosophila Immunodetections veya PCR deneyleri için uygun pupa Wings incelemek için hızlı ve etkili bir yöntem

Bu el yazması Xoluşturmak için ayrıntılı bir yöntem sunuyor-kromozom kol sonda ve kız kardeşi durumunu incelemek için performans gösteren Floresans in situ hibridizasyon (balık) Kromatit uyum içinde prometafaz ve metafaz tutuklandı Drosophila yumurta. Bu iletişim kuralı segregasyonun kol uyum bozulmamış veya kesintiye farklı genotip içinde olup olmadığını belirlemek için uygundur.

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

Bu protokol, Sipunculus nudus coelomic sıvısındaki mRNA ekspresyon düzeylerini ve hedef genlerin mekansal desenlerini saptamak için yerinde hibridizasyon yaklaşımını etkin bir şekilde tanımlar.

Sipunculus nudus Coelomic Sıvı için yerinde Hibridizasyon

Drosophila, miyogenezi düzenleyen anahtar molekülleri incelemek için iyi kurulmuş bir modeldir. Bununla birlikte, mevcut yöntemler, mRNA transkripsiyonel dinamiklerini ve sinsitya içindeki uzamsal dağılımı belirlemek için yetersizdir. Bu sınırlamayı ele almak için, mRNA'ların tek molekül ölçeğinde saptanmasına ve miktarının belirlenmesine izin veren bir RNA floresan in situ hibridizasyon yöntemini optimize ettik.

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Keşfedin, Bicyclus anynana kelebek pupa kanatlarında riboprobes kullanarak in situ hibridizasyon protokolünü. Bu yöntem, gen ifadesi analizi ve gelişimsel biyoloji araştırmaları için optimize edilmiştir.

Riboprobes kullanarak Kelebek pupa Wings in situ Protokolü

Daha fazla video keşfet