Name: Riboprobes kullanarak Kelebek pupa Wings in situ Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Keşfedin, Bicyclus anynana kelebek pupa kanatlarında riboprobes kullanarak in situ hibridizasyon protokolünü. Bu yöntem, gen ifadesi analizi ve gelişimsel biyoloji araştırmaları için optimize edilmiştir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Jayne Selegue Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadiç Bob Reed, Roche Teknik Destek Bu protokol sorunları giderme konusunda yardım için teşekkür ederim. Biz de film düzenleme William Piel tavsiye için teşekkür ederim.

1. GÜN <ol><li> Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: <ul><li> 10x PBS </li><li> 1x PBS </li><li> 1x PBT </li><li> GKD 2 O <ul><li> % 0.1 &#39;lik toplam hacmi DEPC ekleyin ve şiddetle çözümler sallamak. </li><li> Otoklav. </li></ul></li><li> % 4 Paraformaldehit Fix - PBS-DEPC </li><li> Proteinaz K çözüm çökelti varsa, vorteks şiddetle kısım çıkarmadan önce </li><li> Sindirim Durdur Tamponu </li><li> Prehybridization Tampon </li><li> 50:50 PBT: Prehybridization Tampon </li><li> Hibridizasyon Tampon <ul><li> Çözümler RNaz ücretsiz tutulmalıdır. Ya da pişmiş cam eşya (4 saat 250 ° C) ya da atılabilir plastik kullanın. Serolojik pipetler çözümleri yapmak için çok kullanışlıdır </li></ul></li></ul></li><li> PBS içinde kanatları teşrih zaman aşamalı pupa </li><li> Oda sıcaklığında 24 kuyu kültür plaka kuyularda Tampon saptamak için doğrudan kanatları hareket ettirme </li><li> 2 saat için diskler Fix </li><li> PBT olarak 5 x 5 dakika yıkayın </li><li> Proteinaz K çözüm, 3 dakika boyunca kanatları inkübe </li><li> Sindirim Durdur Tamponu 2 x durulayın </li><li> PBT olarak 5 x 5 dakika yıkayın </li><li> 50:50 PBT 2 x 5 dakika Yıkama: PHB </li><li> PHB olarak 1 x 10 dakika yıkayın </li><li> PHB en az 1 saat inkübe 55 ° C. </li><li> Isı doğasını RNA prob (20 50ng de her ihtiyaç) (80 ° C 5 dakika) ve hibridizasyon tamponu (ul 100 de ortalama gerekli) </li><li> Kuyulara prob ekleyin ve 55 az 48 saat inkübe ° C </li></ol> 3. GÜN <ol><li> 4 x 5 dakika yıkayınız 55 ° C PHB </li><li> 55 PHB gece inkübe ° C </li></ol> 4. GÜN <ol><li> Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: <ul><li> Antikor Blok Tamponu </li></ul></li><li> PHB: 50:50 PBT 1 x 5 dakika yıkayın </li><li> PBT içinde 4 x 5 dakika yıkayın </li><li> 4 Blok Tampon 1 saat inkübe kanatları ° C </li><li> 4 geceleme anti-Kazı antikor 1:2000 dilüsyon kanatları inkübe ° C </li></ol> 5. GÜN <ol><li> Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: <ul><li> Algılama Tampon </li></ul><ul><li> Gelişmekte olan Çözümü - ışığa karşı hassastır (folyo ile sarın) </li></ul></li><li> Oda sıcaklığında PBT 3 x 5 dakika yıkayın </li><li> PBT yıkayın 7 x 5 dakika </li><li> Algılama Tampon kanatları iki kez durulayın </li><li> Çözüm Geliştirme 1 ml kanatları geliştirin gelişme zamanı her zaman kontrol edilmelidir gelişmekte kez aynı probları ve gelişmekte olan çözümü kullanırken bile değiştirebilirsiniz genellikle gecede aralıklarla kadar artırmaya sonra 5-10 dakika sonra kontrol edin ve. Plaka örnekleri kontrol ışığa maruz önlemek için folyo sarılı olmalıdır. </li><li> Gelişmekte olan Durdur Tampon beş kez durulayın </li><li> Kanatları Dağı. </li></ol>

<ol><li>Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+and+eyespot+determination+in+butterfly+wings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings.</a> Science. 265, 109-114 (1994).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+in+formamide+protects+RNA+from+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Solubilization in formamide protects RNA from degradation.</a> Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).</li>
<li>Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+a+hedgehog+regulatory+circuit+in+butterfly+eyespot+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution.</a> Science. 283, 532-534 (1999).</li>
<li>Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+transformation+of+the+butterfly+Bicyclus+anynana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+%28Suppl%29%22%5BJournal%5D)">Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana.</a> Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).</li>
<li>Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+insights+into+questions+of+lepidopteran+wing+pattern+homology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology.</a> BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).</li>
<li>Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+control+of+transgene+expresson+using+laser+induction+of+the+hsp70+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter.</a> BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).</li>
<li>Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+function+in+butterfly+wings+and+the+evolution+of+insect+wing+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns.</a> 9, 109-115 (1999).</li>
</ol>

Mevcut protokollerin optimizasyonu Larva kanat disklerine yerinde döllemeler başarıyla Precis coenia kelebekler diskler kullanılarak yapılmıştır (Carroll ve ark 1994; Keys ve ark 1999; Weatherbee ve ark 1999). Protokolü larva kanat renklendirmeler Carroll Lab isteği üzerine ayrıntılı bir yazılı protokol adapte edilmiştir. Yapılan değişiklikler, larva ve pupa kanat dokular arasındaki farklılıkları barındırmak için hizmet vermektedir. Pupa hindwing diseksiyonlar sırasında peripodial membran kuyuları dahil edilmelidir. Protokolünde ilk...

<table><tbody><tr><td>Fiksasyon Tamponu</td><td></td><td></td><td></td><td>PBS içinde %4 Paraformaldehit</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td></td><td>PBS içinde %0.1 Tween 20</td></tr><tr><td>Proteinaz K çözeltisi</td><td></td><td></td><td></td><td>PBT içinde 2.5&amp;#109;g/ml Proteinaz K</td></tr><tr><td>Sindirim Durdurma Tamponu</td><td></td><td></td><td></td><td>PBT içinde 2 mg/ml glisin</td></tr><tr><td>Pre-Hibridizasyon Tamponu</td><td></td><td></td><td></td><td>50 ml PHB için: 12 ml DEPC işlem görmüş su + 25 ml Formamid + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml somon spermi (Rnase içermeyen, çözeltiye eklenmeden önce ısı ile denatüre edilmiş).</td></tr><tr><td>Hibridizasyon Tamponu</td><td></td><td></td><td></td><td>Pre-hibridizasyon tamponuna 1 mg/ml glikojen ekleyin</td></tr><tr><td>Bloklama Tamponu</td><td></td><td></td><td></td><td>50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, %0.5 IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA</td></tr><tr><td>Anti-DIG</td><td>Ab</td><td>Roche Group</td><td>11 093 274 910</td><td>Alkalin Fosfataz konjuge</td></tr><tr><td>DIG Yıkama ve Bloklama Tampon Seti</td><td></td><td>Roche Group</td><td>11 585 762 001</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Mount Aqueous Mounting Medium</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0612</td><td>Kapatma Mediumu </td></tr></tbody></table>

riboprobes kullanarak kelebek pupa wings in situ protokolü

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

Burada, video formatı, riboprobes kullanarak kelebek Bicyclus anynana pupa kanatları in situ döllemeler için bir protokol mevcut. Yerinde döllemeler, gelişim biyolojisi bir dayanak noktası, transkripsiyon düzeyinde, gelişmekte olan dokularda gen ekspresyonu mekansal ve zamansal desen çalışması için faydalıdır. Gen transkripsiyonu ve protein ürünleri hedef alan antikorlar henüz geliştirilen ve / veya mevcut antikorlar kullanılarak ayırt edilemez genomunda belli bir protein birden fazla gen kopyaları bulunmaktadır edilmemiştir varsa, situs yerine kullanılabilir. Larva kanat diskler için yerinde teknik bir kaç yıl için kelebek topluluk olmasına karşın, mevcut protokol daha büyük ve daha kırılgan bir pupa kanatlar için optimize edilmiştir.

Bicyclus anynana pupa kanat dokusu gen ekspresyonu incelemek için, riboprobes kullanarak yerinde döllemeler için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Biz de bu protokolün diğer lepidopteran türlerin pupa kanatları kullanmak için daha fazla optimizasyon için yönergeler sağlar.

Riboprobes kullanarak Kelebek pupa Wings in situ Protokolü

Burada, riboproblar kullanılarak kelebek *Bicyclus anynana*'nın pupa kanatlarında in situ hibridizasyon için bir protokolü video formatında sunuyoruz. In situ...

Bu, pupa evresindeki kelebek kanatları için hazırlanan bir ceto protokolüdür. İşleme, kafesteki prepupaları toplayarak, onları bir tepsiye yerleştirerek ve ardından time-lapse (zaman ayarlı) fotoğrafçılık kullanarak kesin PPU pupa sürelerini fotoğraflayarak başlarız. Bu yöntem, pupalasyon gerçekleştikten sonra boyamaları kesin zamanlarda yapmamıza olanak tanır.Bu durum önemlidir çünkü farklı proteinler için farklı mRNA'lar, pupasyon sonrasının farklı zamanlarında eksprese edilir. Burada, pupa kanatlarını silikon tabanlı bir Petri kabı içerisinde diseke ediyoruz; önemli olan nokta, kanatları çıkarıp fiksasyon çözeltisine çok düz olacak şekilde yerleştirmektir. Eğer bu aşamada düz olmazlarsa, bir daha asla düzleşmezler.Uygun fiksasyon süresinden sonra, fiksasyon tamponu uzaklaştırılır ve beş kez yıkama yapılır. PBT işleminde proteinaz K adımı oldukça kritiktir ve probun bağlanabilmesi için dokuları permeabilize etmek amacıyla kullanılır; bu nedenle, durulama ve yıkama işlemleriyle doğru zamanda durdurulmalıdır. Somon spermi, probun rastgele her yere bağlanmasını önlemek için ucuz bir DNA kaynağı olarak işlev görür.Sperm, pre-hibridizasyon tamponunun bileşenlerinden biridir. Burada spermi pre-hibridizasyon tamponuna ekliyoruz; ardından, yarı yarıya PBT ve pre-hibridizasyon tamponundan oluşan bu 1:1 PBT-PHB çözeltisi hazırlanacaktır. Bu çözelti, kanatların içinde bulundukları PBT çözeltisinden pre-hibridizasyon çözeltisine nazikçe aktarılması için bir ara çözelti olarak kullanılır.Böylece, kanatların başlangıçta bu %50 %50 çözeltide bekletileceği ara bir adım bulunmaktadır. Burada kanatlar önce 10 dakika boyunca PHP içerisinde, ardından tekrar bir saat boyunca 55 °C'de PHP içerisinde inkübe edilir. Bu sırada, ön hibridizasyon tamponunun glikojen ile karıştırılmasıyla elde edilen hibridizasyon tamponunu hazırlayacağız.Şimdi, az miktarda hibridizasyon tamponu hazırlamak için PHV'ye glikojen ekliyoruz; bu tampona denatüre edilmiş probu ekleyeceğiz. Bu nedenle bir ısıtma bloğunu ısıtıyoruz ve -20 °C'de saklanan probu santrifüjle çöktürüyoruz; ardından denatüre edilmek üzere probun uygun miktarını bir mikro tüpe aktarıp 80 °C'de yaklaşık beş dakika bekletiyoruz. Burada iki probu eş zamanlı olarak denatüre ediyoruz, bu nedenle proba hibridizasyon tamponu ekliyoruz ve ardından her bir kuyucuğa 100 µL prob karışımı ekliyoruz.Bu adımı tamamlamak için, kanatlar önümüzdeki iki gün boyunca 55 °C'de inkübe edileceğinden ve parafilm buharlaşmayı önlediğinden, tüm kuyucukların üzerini parafilmle kapatacağız. İki günlük inkübasyonun ardından, kanatlar PBS ile yıkanarak prob uzaklaştırılır ve son yıkama işlemi kanatlar üzerinde 12 ila 24 saat daha kalır. Son olarak, kanatlar tekrar PBT çözeltisine döndürmek için bir dizi işlemle yıkanır. Bu aşamada yine, ara basamaklarda 50/50 karışım çözeltisi kullanılır.Bu aşamada, antikor bloklama çözeltisi kanatlara eklenir ve alkalin fosfataz ile konjuge edilmiş anti-dig antikoru, yaklaşık 1/2000 konsantrasyonuna ulaşacak şekilde PBT'ye eklenir. Her bir kuyucuğa bu antikor çözeltisinden yaklaşık 300 µL eklenir ve ardından kanatlar, antikor içinde gece boyunca inkübe edilmek üzere buzdolabına yerleştirilir. Ertesi gün, bir dizi PBT yıkama işlemiyle antikor uzaklaştırılır ve ardından kanatlar oda sıcaklığında tespit tamponu ile iki kez durulanır.Son olarak, her kuyucuğa bir mil geliştirme çözeltisi eklenir ve kanatlar hızla alüminyum folyo ile kapatılır. Yaklaşık 10 dakika sonra kontrol ettiğimizde kanatlar morarmaya başlamıştır ancak renkleri hala biraz açıktır. Bu nedenle tekrar kapatılırlar ve birkaç dakika sonra yeniden kontrol edildiğinde renklerin biraz daha koyulaştığı görülür.Farklı problarda inkübe edilen kanatların hafifçe farklı hızlarda koyulaştığı görülmektedir; bu nedenle kanatları tekrar kapatmaya karar verdik ve nihayet, 20 dakika sonra, gelişimi durdurma tamponu ile reaksiyonu sonlandırdık. Kanatlar artık bir lam üzerine monte edilmeye hazırdır, bu nedenle etiketli bir lama küçük bir damla montaj medyumu ekliyoruz ve kanatları cımbızla alıp damlanın üzerine yerleştirerek lama taşıyoruz. Hava kabarcıklarını uzaklaştırın, kanadı nazikçe düzeltin ve üzerine bir lameli kapatın.Bu deneyde, grail gen transkriptlerini hedefleyen probu kullanıyoruz ve pupal kanat gelişiminin erken aşamalarında, cyclist anana kelebeğinin gelecekteki IPO deseninin merkezinde lokalize olduklarını görüyoruz.

in-situ-protocol-for-butterfly-pupal-wings-using-riboprobes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Burada, biz verimli bir yüksek kapasiteli...

Yüksek Verimli In situ</emFetal Fare Alt Ürogenital Yolu mRNA İfade Desenler Karakterize> Hibridizasyon Yöntemi

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

RNA<em&gt; Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi&gt; Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış

Xenopus laevis embriyosu, büyük boyutu ve manipülasyon kolaylığı nedeniyle erken gelişim çalışmalarında son derece yararlı olmaya devam ediyor.   Bu model sistemde belirli organların tanımlanmasında kullanılabilecek tam montajlı in situ hibridizasyon protokolü için basitleştirilmiş bir protokol sağlanmıştır.

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez<em&gt; In Situ</emIçinde&gt; Hibridizasyon Protokolü<em&gt; Ksenopus</em

Bu protokol Proximity ligasyon Testi Drosophila larva nöromüsküler kavşakta yerinde protein-protein etkileşimleri tespit etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. Bu teknikle, Diskler, büyük ve Hu-li tai shao postsinaptik bölgede bir kompleks, daha önce birlikte immunoprecipitation ile tespit dernek kurma gösterilmiştir.

Algılama In Situ Protein-protein kompleksleri Drosophila Larva Nöromüsküler Junction

Biz renkli çökeltilerin zıt üç farklı mRNA dağıtım desen eşzamanlı ve belirli algılama izin bozulmamış Drosophila embriyolar bir çoklu hedef kromojenik tüm montaj in situ hibridizasyon (MC-DİLERİZ) prosedürü açıklar.

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Doğru bir şekilde transkript veya proteinler Drosophila dokularda algılama yeteneğini kendi bereket ve yerelleştirme için geliştirme süreci ile ilgili eğitim için önemlidir. Pupa kanatları incelemek için basit bir yordam açıklaması burada. Bu kanatlar örnekleri çeşitli teknikler (immünhistokimya, PCR tahlil, vb) olarak kullanılabilir.

Drosophila Immunodetections veya PCR deneyleri için uygun pupa Wings incelemek için hızlı ve etkili bir yöntem

Bu el yazması Xoluşturmak için ayrıntılı bir yöntem sunuyor-kromozom kol sonda ve kız kardeşi durumunu incelemek için performans gösteren Floresans in situ hibridizasyon (balık) Kromatit uyum içinde prometafaz ve metafaz tutuklandı Drosophila yumurta. Bu iletişim kuralı segregasyonun kol uyum bozulmamış veya kesintiye farklı genotip içinde olup olmadığını belirlemek için uygundur.

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

Bu protokol, Sipunculus nudus coelomic sıvısındaki mRNA ekspresyon düzeylerini ve hedef genlerin mekansal desenlerini saptamak için yerinde hibridizasyon yaklaşımını etkin bir şekilde tanımlar.

Sipunculus nudus Coelomic Sıvı için yerinde Hibridizasyon

Keşfedin, Bicyclus anynana kelebek pupa kanatlarında riboprobes kullanarak in situ hibridizasyon protokolünü. Bu yöntem, gen ifadesi analizi ve gelişimsel biyoloji araştırmaları için optimize edilmiştir.

Riboprobes kullanarak Kelebek pupa Wings in situ Protokolü

Daha fazla video keşfet