Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

Benim adım Gail Siebel ve Ulusal Alkol Kötüye Kullanımı ve Alkolizm Enstitüsü'nde Dr. Veronica Alvarez'in laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım. Bu çalışma, Oregon Primate Merkezi'nden Dr. Kathleen Grant ve Andrew Wow ile bu çalışmada kullanılan insan dışı primat dokularını sağlayan Wake Forest Üniversitesi'nden Dr. James Dene ile iş birliği içinde gerçekleştirilmiştir. Bu prosedürün genel amacı, nöronlara floresan boyalar tanıtmak ve kemirgenler ile her yaştan primatlar gibi farklı türlerden alınan beyin kesitlerini markalamaktır.

Dendritlerin ve dendritik dikenciklerin morfolojisini incelemek amacıyla, öncelikle Ts ve boncuklar D eye gibi lipofilik bir boya ile kaplanır. Prosedürün ikinci adımı, tüpün D eye kaplı boncuklarla doldurulması ve Helios gen tabancası sistemi için mermi görevi görecek küçük parçalar halinde kesilmesidir. Prosedürün üçüncü adımı ise, gen tabancası kullanılarak D eye kaplı boncukların beyin dilimlerine ateşlenmesidir.

Stilistik yöntem, diğer belirteçleri eş zamanlı olarak lokalize etmek için immün boyama ile birleştirilebileceğinden, prosedürün son adımı isteğe bağlıdır. Nihayetinde, konfokal veya iki foton mikroskobu gibi yüksek çözünürlüklü görüntülemeye ve dendritik dallanma ile dendritik diken morfolojisinin incelenmesine uygun, nöronların seyrek floresan etiketlemesini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlerimize göre temel avantajı, stilistiğin tüm türlerden, yaşlardan ve genotiplerden hayvanların beyin kesitlerine uygulanabilmesidir.

İmmünboyama ile kombinasyon halinde kullanılabilir ve yüksek çözünürlüklü mikroskopiye uygun, seyrek floresan işaretleme sağlar. Boncukları hazırlamadan önce; bir kimyasal çeker ocak içerisinde, 30 mg/mL nihai konsantrasyon elde etmek için 450 mL metilen klorür başına 13,5 mg lipofilik boya kullanarak tungsten boncukları lipofilik boya ile kaplayın. 300 mg tungsten boncuk içeren bir Eppendorf tüpü alın ve içine 300 µL metilen klorür ekleyin; boncukları yeniden süspande etmek ve homojen bir çözelti oluşturmak için kuvvetlice pipetleyin.

Sadece 100 miligram tungsten boncuk kullanılır; boncukların yeniden süspanse olması için mermi seti başına pipetleme yapılarak yukarı aşağı çekilir, boncukların 100 mililitresi ve çözünmüş boya bir lam üzerine eklenir ve iyice karıştırılır. Bir pipet ucu yardımıyla, boncuklar açık griye dönene kadar tamamen havada kurumaya bırakılır. Lamın altına temiz, mumlu bir beyaz kağıt yerleştirilir; temiz bir jilet kullanılarak, her renk mermi için boncuklar lamdan sıyırılır ve ince bir toz haline gelene kadar ezilir.

Kaplanmış boncukları whey kağıdı üzerine sıyırın ve bir huni yardımıyla 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Topaklanmaları tamamen gidermek için üç mililitre su ekleyin ve oda sıcaklığında, su banyosunda 10 ila 30 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Bir ucu açılı şekilde kesilmiş 0,7 metre uzunluğunda turkuaz tüp kesin ve diğer ucu bir tüp adaptörü kullanarak 12 mililitrelik bir şırıngaya bağlayın; serbest ucu 10 mililitre 10 miligram/mililitre polivinil peron veya PVP çözeltisi içeren bir tüpe yerleştirin ve çözeltiyi tüp boyunca tamamen çekerek şırıngaya doldurun.

Boncukların çökelmesini önlemek için hızlıca çalışarak, şırınga ile pompalama yaparken boncuk çözeltisini vorteksleyerek homojen bir karışım elde edin ve çözeltiyi tamamen tüpün içine çekin. Tüpü her iki ucundan gergin tutarken, boncukların o noktada tüpe tutunmasını engelleyecek hava kabarcıklarının girmesinden kaçının. Eşit dağılım için tüpü yanlara doğru eğerek sallayın.

Boncukları dağıtın. Tüpü hazırlama istasyonuna yerleştirin ve boncukların 30 ila 60 saniye boyunca çökmesini bekleyin. Şırıngayı yavaş ama sorunsuz bir şekilde kullanın.

Boncukları geride bırakacak şekilde suyu uzaklaştırın. Şırıngayı hemen ayırın ve tüpleri döndürmeye başlayın. Su damlacıkları artık görünür olana kadar, hazırlama istasyonundaki nitrojen akışını 10 ila 20 dakika boyunca 4 ila 5 LPM kuru seviyesine ayarlayın.

Tüpleri hazırlama istasyonundan çıkarın, tüp kesici ile bullet'ları 13 milimetre uzunluğunda kesin; kaliteli bullet'ların iç kısmının tamamında hafif gri bir pus tabakası olduğu gözlemlenecektir. Bullet'ları, susuz kalsiyum sülfat gibi bir kurutucu madde içeren folyoya sarılı sintilasyon şişelerine yerleştirin. Atışa hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın.

Diic Etiketleme, farklı türlerden ve yaşlardan gelen, çeşitli yöntemlerle korunmuş beyin dokusundaki nöronları boyamak için kullanılabilir. Dilimlemeden önce veya sonra fikse edilmiş beyin kesitlerini 24 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin.

Dilimleri, her yıkama için beş ila 10 dakika boyunca bir kez PBS ile 3 kez yıkayın. PBS'yi pipetle çekin ve dilimi kuyucuğun merkezine getirmek için bir resim fırçası kullanın. Gen tabancasının namlu astarının ucundaki iki metal difüzyon ekranı arasına 3,0 mikrometrelik bir filtre parçası yerleştirin.

Gen tabancasını, namlu astarının ucunun örnekten 1,5 santimetre uzaklıkta olacağı şekilde tutun. Boncukları, 120 ila 180 PSI helyum gaz basıncıyla dilimin içine fırlatın. Fazla boyayı uzaklaştırmak için dilimleri 1xPBS ile üç kez hızlıca durulayın.

Tüm sıvı aktarım adımları boyunca, kesitin çekim yüzeyinin yukarıya baktığından emin olun. DAI'nin dendritler boyunca yayılmasına izin vermek için kesitleri PBS içinde üç ila altı saat boyunca saklayın ve alüminyum folyo ile kapatın. DAI ışığa duyarlı olduğundan, kesitler bu aşamada monte edilebilir veya bir sonraki bölümde detaylandırıldığı gibi antikorlarla ek boyama işlemine tabi tutulabilir; boyama işlemine devam etmek için her bir kesite 1x PBS içinde %0,01 TRITTON X 100 içeren 300 ila 500 µL permeasyon çözeltisi ekleyin ve tam olarak 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.

Permeabilizasyon solüsyonunu kuyucuklardan uzaklaştırın; kesitleri, 1X PBS içerisinde %10 keçi serumu ve %0,01 Triton X 100 içeren bloklama solüsyonu ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe ederek bloklayın. Her kuyucuğa, bloklama solüsyonu ile seyreltilmiş 300 ila 500 µL primer antikor ekleyin. Antikora bağlı olarak, oda sıcaklığında bir ila iki saat veya gece boyunca inkübe edin; kesitleri 1X PBS ile her biri 5 ila 15 dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın ve solüsyonu kuyucuktan uzaklaştırın.

Her birine, bloklama solüsyonunda seyreltilmiş 300 ila 500 mikrolitre sekonder antikor ekleyin. Kuyucukları, daha önce yapıldığı gibi, her bir yıkama beş ila 15 dakika sürecek şekilde 1X PBS ile dört kez yıkayın; dilimleri floresan montaj medyumu ile bir lam üzerine yerleştirin ve 18 x 18 milimetrelik bir lamel ile kapatın. Kenarları şeffaf oje ile mühürlemeden önce oda sıcaklığında altı ila 12 saat kurumaya bırakın ve ardından karanlıkta veya 4 °C'de saklayın.

Etiketlenmiş beyin kesitlerinin örnek görüntüleri burada gösterilmiştir. Dikkat edilmesi gereken iki önemli özellik, düşük büyütmede seyrek bir etiketleme paterni ve bireysel hücresel bileşenlerin tanımlanabilme yeteneğidir. Pelletlerin yanlış hazırlanması veya dokunun aşırı fiksasyonu, burada gösterildiği gibi kötü etiketlemeye yol açabilir.

Sorun giderme ipuçları buradaki metinde sunulmuştur. Burada, fare beyninden alınan bir TAL ortamı döner nöronunun konfokal görüntüsü ve dendritik dallanmasının karmaşık deseni yer almaktadır. Konfokal mikroskopi kullanıldığında elde edilen optik kesitleme, doku kesitindeki tek tek işaretlenmiş hücrelerin izole edilmesine olanak tanır.

Yüksek büyütmeli görüntüler, bir kemirgen beyninden ve insan dışı bir primat beyninden alınan dendrit segmentlerini göstermektedir. ICS'nin immün boyama ile birleştirilmesinin, bu teknikle elde edilen yüksek floresan boyama yoğunluğu sayesinde belirgin dendritik dikenlerle sonuçlandığına dikkat ediniz. Bu görüntü, kırmızı renkteki D eye etiketlemesinin, yeşil renkteki GFP ekspresyonu için yapılan immün boyama ile kolokalizasyonuna bir örnek göstermektedir.

Bu görüntü, D1 dopamin reseptörü promotörü altında floresan protein GFP ekspres eden transgenik bir fareden alınan bir sal kesitine karşılık gelmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, pelletlerin nasıl hazırlanacağı ve floresan boyalarla nöronların seyrek bir şekilde etiketlenmesi için Jing tabancasının nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik, nöronal morfolojinin net bir şekilde görselleştirilmesine, dendrit dallanmalarının ve dikenlerin incelenmesine olanak tanır.