Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

Biz, kemirgenler ve insan olmayan primatlardan farklı yaşlarda beyin dilimleri nöron gibi DII floresan boyalar, tanıtmak için, gen tabancasının kullanımını göstermektedir. Bu özel durumda, yetişkin farelerin (3-6 ay) ve yetişkin cynomologus maymunlar (9-15 yaşında) kullanın. Dr Lichtman laboratuvar tarafından açıklanan bu teknik, (Gan

Benim adım Gail Siebel ve Ulusal Alkol Suistimali ve Alkolizm Enstitüsü'nde Dr.Veronica Alvarez'in laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım. Bu çalışma, Oregon Primat Merkezi'nden Dr. Kathleen Grant ve Andrew Wow ve bu çalışmada kullanılan insan olmayan primat dokusunu sağlayan Wake Forest Üniversitesi'nden Dr. James Dene ile işbirliği içinde gerçekleştirildi. Bu prosedürün revizyon amacı, floresan boyaları nöronlara sokmak ve her yaştan kemirgenler ve primatlar gibi farklı türlerden beyin bölümlerini etiketlemektir.

Dendritlerin ve dendritik dikenlerin morfolojisini incelemek amacıyla, bu, önce T'lerin ve boncukların D gözü gibi lipofilik bir boya ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, boruları D göz kaplı boncuklarla kaplamak ve Helios gen tabanca sistemi için mermi görevi gören küçük parçalara kesmektir. İşlemin üçüncü adımı, gen tabancası kullanılarak D göz kaplı boncukların beyin dilimlerine vurulmasıdır.

Prosedürün son adımı isteğe bağlıdır, çünkü stilistik, diğer belirteçleri aynı anda lokalize etmek için immüno boyama ile birleştirilebilir. Sonuç olarak, konfokal veya iki foton mikroskobu gibi yüksek çözünürlüklü görüntülemeye uygun nöronların seyrek floresan etiketlemesini ve dendritik dallanma ve dendritik omurga morfolojisinin incelenmesini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlerimize göre en büyük avantajı, stilistiklerin tüm tür, yaş ve genotipteki hayvanlardan beyin kesitlerine uygulanabilmesidir.

İmmün boyama ile birlikte kullanılabilir ve mermi yapmadan önce yüksek çözünürlüklü mikroskopi için uygun seyrek floresan etiketleme üretir. Mililitre başına 30 miligramlık bir nihai konsantrasyon için 450 mililitre metilen klorür ila 13.5 miligram lipofilik boya boya gözü içinde kimyasal bir davlumbazda tungsten boncukları lipofilik boya ile kaplayın. 300 miligram tungsten boncuk içeren bir ön Eloqua tüpü alın ve boncukları yeniden süspanse etmek ve homojen bir çözelti elde etmek için kuvvetlice 300 mikrolitre metilen klorür borusu ekleyin.

Boncukları yeniden askıya almak için mermi seti yukarı ve aşağı pipetleme başına sadece 100 miligram tungsten boncuk kullanılır, 100 mililitre boncuk ve çözünmüş kalıp kalıbı gözü bir cam slayt üzerine ekleyin ve bunları iyice karıştırın. Bir pipet ucuyla, boncuklar açık griye dönene kadar tamamen kurumaya bırakın. Temiz bir yarışçı bıçağı kullanarak sürgünün altına temiz bir mumlu beyaz kağıt parçası yerleştirin Her mermi rengi için, boncukları camdan kazıyın, kaydırın ve ince bir toz haline getirin.

Kaplanmış boncukları peynir altı suyu kağıdına kazıyın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe hunileyin. Üç mililitre su ekleyin ve herhangi bir topaklanmayı iyice bozmak için oda sıcaklığında 10 ila 30 dakika boyunca su banyosunda sonikat ekleyin. Bir ucunda açılı olarak 0,7 metre deniz mavisi boru kesin ve diğer ucunu bir boru adaptörü kullanarak 12 mililitrelik bir şırıngaya bağlayın, serbest ucu mililitre polivinil peron veya PVP çözeltisi başına 10 mililitre 10 mililitre içeren bir tüpe yerleştirin ve çözeltiyi tamamen borudan ve şırınganın içine çekin.

Homojen bir karışım elde etmek için şırınga ile pompalarken boncuk çözeltisini girdaplayın, boncukların çökelmesini önlemek için hızlı bir şekilde çalışarak, çözeltiyi tamamen boruya çekin. Boruyu her iki ucundan gergin tutarken boncukların o noktada boruya yapışmasını önleyecek herhangi bir hava kabarcığı sokmaktan kaçının. Eşit şekilde bir yandan diğer yana eğin.

Boncukları dağıtın. Boruyu hazırlık istasyonuna besleyin ve boncukların 30 ila 60 saniye oturmasına izin verin. Yavaş ama yumuşak bir şekilde şırıngayı kullanın.

Boncukları geride bırakarak suyu çıkarın. Hemen şırıngayı ayırın ve boruyu döndürmeye başlayın. Hazırlık istasyonundaki nitrojen akışını dört ila beş LPM'ye ayarlayın ve su damlacıkları artık görünmeyene kadar 10 ila 20 dakika kurutun.

Boruyu hazırlık istasyonundan çıkarın, boru kesicisi gözlemlenerek mermileri 13 milimetre uzunluklarda kesin ve iyi mermilerde iç kısmı düzgün bir şekilde kaplayan soluk gri bir pus olacaktır. Mermileri, susuz kalsiyum sülfat gibi bir kurutma maddesi içeren folyoya sarılı sintilasyon şişelerine yerleştirin. Çekime hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın.

Diic Etiketleme, çeşitli türlerden ve yaşlardan beyin dokusundaki nöronları boyamak ve çeşitli yöntemler kullanılarak korunmak için kullanılabilir. Dilimlemeden önce veya sonra sabitlenmiş beyin dilimlerini 24'ün kuyularına yerleştirin. Kuyu plakası.

Dilimleri bir XPB S3 kez, yıkama başına beş ila 10 dakika yıkayın. PBS'yi pipetleyin, dilimi kuyuda ortalamak için bir boya fırçası kullanın. Gen tabancasının namlu astarının ucundaki iki metal difüzyon ekranı arasına bir parça 3.0 mikrometre filtre yerleştirin.

Gen tabancasını, namlu astarının ucu numuneden 1,5 santimetre uzakta olacak şekilde tutun. Boncukları 120 ila 180 PSI helyum gazı basıncıyla dilime çekin. Fazla boyayı çıkarmak için dilimleri bir XPBS ile üç kez hızlı bir şekilde durulayın.

Tüm sıvı işleme adımları sırasında dilimin atış yüzeyini yukarı baktığından emin olun. DAI'nin dendritler boyunca yayılmasını sağlamak için dilimleri PBS'de üç ila altı saat saklayın, folyo ile kaplayın. Dai ışığa duyarlı olduğundan, dilimler bu aşamada monte edilebilir veya her dilime bir XPBS'de %0.01 TRITTON X 100 içeren 300 ila 500 mikrolitre geçirgenlik solüsyonunda boyamaya devam etmek için bir sonraki bölümde detaylandırıldığı gibi antikorlarla daha fazla boyamaya tabi tutulabilir, oda sıcaklığında tam olarak 15 dakika inkübe edin.

Geçirgenlik çözeltisini kuyulardan çıkarın, dilimleri bloke edin, %10 keçi serumu ve %0.01 tritan X 100 içeren solüsyonda bir XPBS'de 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Her birine bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş 300 ila 500 mikrolitre primer antikor ekleyin. Oda sıcaklığında bir ila iki saat veya gece boyunca iyi inkübe edin, antikora bağlı olarak her yıkamada beş ila 15 dakika boyunca bir XPBS ile üç kez yıkama dilimleri, çözeltiyi kuyudan çıkarın.

Her birine bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş 300 ila 500 mikrolitre ikincil antikor ekleyin. Daha önce olduğu gibi her yıkamada beş ila 15 dakika boyunca bir XPBS ile dört kez iyice yıkayın, dilimleri floresan montaj ortamı olan bir cam slayta monte edin ve 18 x 18 milimetre ile örtün. Kapak kayması: Kenarları şeffaf oje ile kapatmadan önce oda sıcaklığında altı ila 12 saat kurumaya bırakın, karanlıkta saklayın veya dört santigrat derecede örtün.

Etiketli beyin bölümlerinin örnek görüntüleri burada gösterilmektedir. Aranması gereken iki önemli özellik, düşük büyütmede seyrek bir etiketleme modeli ve tek tek hücresel bileşenleri tanımlama yeteneğidir. Madde işaretlerinin yanlış hazırlanması veya dokunun aşırı sabitlenmesi, burada gösterildiği gibi kötü etiketlemeye yol açabilir.

Sorun giderme ipuçları buradaki metinde verilmiştir. Fare beyninden bir TAL orta omurga nöronunun ve karmaşık dendritik dallanma modelinin konfokal bir görüntüsü vardır. Konfokal mikroskopi kullanılırken elde edilen optik kesitleme, doku bölümündeki tek etiketli hücrelerin izolasyonuna izin verir.

Yüksek büyütme oranlı görüntüler, bir kemirgen beyninden ve insan olmayan bir primat beyninden alınan dendrit segmentlerini gösterir. Bu teknikle elde edilen yüksek yoğunluklu floresan boyamanın, ICS'yi immüno boyama ile birleştirirken iyi tanımlanmış dendritik dikenler ile sonuçlandığına dikkat edin. Bu görüntü, kırmızı renkte D göz etiketlemesinin yeşil renkte GFP ekspresyonu için immün boyama ile kolokalizasyonunun bir örneğini göstermektedir.

Bu görüntü, D bir dopamin reseptörü promotörü altında floresan protein GFP'yi eksprese eden transgenik bir fareden alınan bir sal dilimine karşılık gelir. Bu videoyu izledikten sonra, mermilerin nasıl hazırlanacağını ve Jing tabancasını floresan boyalarla seyrek olarak sorumlu nöronlara nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, nöronal morfolojinin net bir şekilde görselleştirilmesine ve dite dallanması ve dikenlerin incelenmesine izin verir.