Aktif Kemik İliği türetilen Makrofajlar ve Bradyzoite Koşullar Toxoplasma gondii Kist Duvar Oluşumu

Toxoplasma gondii doku kültürü modelleri taklit edilebilmektedir çevresel strese yanıt olarak bir kist formuna dönüşür. Bu video makrofajlar kemik iliği kaynaklı aktive veya fibroblast hücreleri büyüme orta pH değerini değiştirerek kist oluşumunu incelemek için teknikler gösterilmiştir.

Bu prosedürün genel amacı, Toxoplasma Gandhi'de kist duvarı oluşumunu indüklemek ve görselleştirmektir. Laboratuvar ortamında. Bu, ilk olarak makrofajların ve fibroblastların kültürlenmesiyle gerçekleştirilir.

Ve daha sonra bu konakçı hücreleri parazit ile enfekte ederek, fibroblastları pH ile şoklayarak veya makrofajları aktive ederek te gde gözde stres yanıtları indüklenebilir, bu da her ikisi de kist duvarı oluşumuna yol açacaktır. Son olarak, kist duvarına bağlanan kültürlere floresan lektin eklenir, böylece kist immünofloresan mikroskobu ile görüntülenebilir. Merhaba, ben Wisconsin Madison Üniversitesi Tıbbi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'nde Dr.Laura Noel'in laboratuvarından Crystal Tobin

Ben Angela Pollard, aynı zamanda No Lab'den. Bugün size in vitro Toxoplasma Gandhi kist duvarı oluşumu için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, parazitlerin stres koşullarına verdiği tepkileri incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Yüksek pH ve karbondioksit açlığı koşulları altında insan dört cilt fibroblastında Toxoplasma Gandhi'nin Brady Zoes'e dönüşümünü indüklemek için 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğunun dibine steril bir yuvarlak cam örtü seti yerleştirerek başlayın. Bir doku kültürü başlığı altında 150 santimetre karelik birleşik bir insan sünnet derisi fibroblast şişesi ile başlayın.

İnsan sünnet derisi fibroblastlarının birleşik şişesini bir XPBS ile iki kez durulayın ve ardından 2.5 mililitre% 0.025 tripsin EDTA ekleyin. Şişeyi 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika inkübe edin. Beş ila 10 dakikalık inkübasyondan sonra, hücreleri plastiğin yüzeyinden serbest bırakmak için şişeye birkaç kez vurun.

Daha sonra, 150 mililitre HFF ortamı veya takviye edilmiş delcos modifiye eagles ortamı ekleyin. Ve şişeyi durulamak ve hücreleri toplamak için ortamı kullanın. Kapak fişleri ile 24 oyuklu plakanın her birine bir mililitre hücre dağıtın, hücrelerin% 5 karbondioksitte 37 santigrat derecede akışkanlığa ulaşmasını sağlayın.

Hücreler daha sonra Toxoplasma Gandhi paraziti ile enfekte olmaya hazır olacaktır. Doku kültürü başlığının altında, 25 santimetrelik bir birleşik insan dört cilt fibroblastı şişesini iki kez 10 ila altı parazit ile enfekte edin ve hücreler bitlenmeye başlayana kadar 37 santigrat derecede inkübe edin. Yaklaşık iki ila üç gün, enfekte sünnet derisi fibroblast tek tabakasını doku kültürü şişesinden çıkarmak için hücre kazıyıcı kullanır.

Daha sonra, yerinden çıkmış tek tabakayı 27 gauge bir iğneden geçirerek parazitleri konakçı hücrelerden serbest bırakın. Ortamdaki parazitlerin sayısını belirlemek için bir hemo sitometre kullanın ve daha sonra birleşen insan sünnet derisi fibroblastlarının 24 kuyusunun her birine 10 ila beşinci paraziti enfekte edin. Önceden hazırlanmış.

Parazitlerin konakçı hücreleri istila etmesine izin vermek için hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte üç saat inkübe edin. Parazitlerin Brady Zeolit aşamasına dönüşümünü indüklemeye devam edin. DMEM'i enfekte insan sünnet derisi fibroblastlarından çıkarın.

Bunları bir XPBS ile durulayın ve ardından bir mililitre geliştirme ortamı ekleyin. pH sekize ayarlanmış bikarbonat içermeyen RPMI bazlı bir ortam. Hücreleri ortam havasında 37 santigrat derecede üç gün boyunca inkübe edin.

Hücreler artık Brady zos'un varlığını analiz etmeye hazır. Brady ZOS'un varlığı, enfekte olmuş hücreleri floresan görüntüleme için hazırlamak için Toxoplasma Gandhi is yardımcı duvarına bağlanan floresan glutenin veya DBA ile floresan etiketli lektin dokos kullanılarak belirlenir. Kuyuları bir XPBS ile üç kez durulayın.

Daha sonra, hücre tek katmanlarını 20 dakika boyunca 200 mikrolitre% 3 formaldehit ile sabitleyin. Sabitleyiciyi çıkarın ve kuyuları bir XPBS ile durulayın. Kuyucuklara 200 mikrolitre 0.1 molar glisin ekleyin ve beş dakika bekletin.

Glisini çıkarın ve hücreleri bloke etmek ve nüfuz etmek için kuyuları bir XPBS ile durulayın. 250 mikrolitre engelleme çözeltisi ekleyin. Hücreleri 30 dakika inkübe edin.

Engelleme solüsyonunu çıkarın ve kuyuları bir XPBS ile durulayın. Kuyucuklara geviş getirmek için konjuge edilmiş bir ila 250 seyreltme DBA'nın 50 mikrolitresini ekleyin. Plakayı örtün ve bir platform çalkalayıcı üzerinde bir saat oda sıcaklığında çalkalayın.

İnkübasyondan sonra, kapak fişlerini bir XPBS'de %0,2 Triton X 100 ile her biri bir platform çalkalayıcıda beş dakika boyunca üç kez yıkayarak floresan etiketli DBA'yı çıkarın, son olarak dpi içeren beta kalkan montaj ortamı kullanarak kapak fişlerini monte edin. T Gandhi lekesi, 100 x büyütmede çürük domine için uygun bir filtreye sahip bir floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir. Brady ZO oluşumunu indüklemek için alternatif bir yöntem olarak, enfekte kemik iliği türevli makrofajlar interferon, gama ve lipopolisakkarit veya LPS ile aktive edilebilir Başlamak için önce bu işlem için L 9 29 şartlandırılmış ortamı hazırlayın.

L 9 29, uzun süreli ko-akıcılıktan sonra makrofaj koloni uyarıcı faktör salgılayan uygulamalı bir fibro sarkom hücre hattı olan bir aynalamadır. Bu şartlandırılmış besiyeri, fare kemik iliği hücrelerini hücre kültüründe makrofajlara dönüştürmek için kullanılabilir ve şartlandırılmış besiyerini 1 150 santimetrekarelik L 9 2 9 hücre şişesini 37 santigrat derecede akıcılığa hazırlamak için kullanılabilir. Ardından, küresel görünene ve şişenin yüzeyinden kalkmaya başlayana kadar yedi ila dokuz gün daha kuluçkaya yatırın.

Ortamı ve ayrılmış hücreleri 50 mililitrelik bir tüpte toplayın ve 10 dakika boyunca 420 5G'de döndürün. Elde edilen sat, L 9 29 hücreli 1 150 santimetre kare şişesi, 150 mililitre BMC ortamı hazırlamak için gereken hacim olan 30 mililitre şartlandırılmış ortam verecektir. BMC gelişimi için kullanılacak L 9 29 cm ile BMC için DMEM hazırlamayı unutmayın.

Kemik iliği hücrelerini izole etme yöntemini gösteren ayrıntılı video protokollerini görüntülemek için. Fare uyluk kemiği için, hasat edilen BMC'ler beş gün kuluçkaya yatırıldıktan sonra lütfen aşağıdaki video protokollerini izleyin. Bakteriyolojik petri kaplarında, her bir kaba L 9 2 9 hücrelerinden şartlandırılmış ortam içerecek olan 10 mililitre BMC ortamı ekleyin ve hücrelerin tamamen gelişeceği iki gün daha inkübe edin.

Olgun kemik iliği türevli makrofajlar veya BMS, BMS'yi bölmek için olgunlaştıktan sonra bir ila iki hafta boyunca geçirilebilir, ortamı çıkarın ve hücreler kalkmaya başlayana kadar 30 dakika boyunca dört santigrat derece inkübe edilmiş beş mililitre soğuk bir XPBS ekleyin. Hücreleri steril bir transfer pipeti ile plakadan durulayın. BMS'yi 50 mililitrelik konik bir tüpe çekin ve hücreleri 10 dakika boyunca 420 5G'de peletleyin.

Peletleri 10 mililitre BMC ortamında yeniden süspanse edin ve ardından hücre yoğunluğu tohumunu belirlemek için bir hemo sitometre kullanın. Kuyu başına iki kez 10 ila beşinci BMS. Altta yuvarlak patlama kapak kaymaları içeren 24 oyuklu bir plakada, hücrelerin T Gandhi ile enfekte olmadan önce gece boyunca yapışmasına izin verin.

Fazla hücreler daha sonra kullanılmak üzere Petri kaplarında geri çekilebilir. BMS'yi etkinleştirmek için, herhangi bir agregayı bozmak için bir su banyosunda iki dakika boyunca aktivasyon ortamı sonikat LPS'yi hazırlayın. Daha sonra BMC ortamına, mililitre LPS başına 100 nanogram ve mililitre IFN gama başına 100 birim ekleyin.

Son olarak, BMC ortamını kuyulardan çıkarın ve aktivasyon ortamlarından biriyle değiştirin. Üç gün boyunca 37 santigrat derece,% 5 karbondioksitte inkübe edin. BMC'ler daha önce sünnet derisi fibroblastları ile gösterildiği gibi boyanabilir.

Bu örneklerde, toksoplazma Gandhi I Bradys, insan sünnet derisi fibroblastlarında floresan DBA ile etiketlenmiştir. PH stresi altında. Kist duvarı, IFN Gamma ve L-P-S-D-V-A ile aktive edilmiş dms'de bir in vitro kistin bu kesitinde gösterildiği gibi floresan olarak işaretlenir.

Burada gösterildiği gibi vakuolün yüzeyinde de lekelenme mevcuttur. Az önce size in vitro Toxoplasma Gandhi'yi, fibroblastlardaki kisti ve aktive makrofajları nasıl boyayacağınızı gösterdik. Bu prosedürü yaparken, parazitlerin ve konakçı hücrelerin aynı gün hazır olması için plan yapmayı unutmamak önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve Deneylerinizde iyi şanslar.