Aktif Kemik İliği türetilen Makrofajlar ve Bradyzoite Koşullar Toxoplasma gondii Kist Duvar Oluşumu

Bu prosedürün genel amacı, Toxoplasma gondii'de kist duvarı oluşumunu in vitro ortamda indüklemek ve görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle makrofajların ve fibroblastların kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir.

Ardından, bu konak hücrelerin parazit ile enfekte edilmesiyle, fibroblastların pH ile şoklanması veya makrofajların aktive edilmesi yoluyla gözde stres yanıtları indüklenebilir; bu durumların her ikisi de kist duvarı oluşumuna yol açacaktır. Son olarak, kist duvarına bağlanan floresan lektin kültürlere eklenir, böylece kistler immünofloresan mikroskopi ile görselleştirilebilir. Merhaba, ben Wisconsin Madison Üniversitesi Tıbbi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'nden Dr. Laura Noel'in laboratuvarından Crystal Tobin.

Ben No Lab'dan Angela Pollard. Bugün size in vitro Toxoplasma Gandhi kist duvarı oluşumu için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, parazitlerin stres koşullarına verdiği yanıtları incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Yüksek pH ve karbondioksit açlığı koşulları altında, insan ön deri fibroblastlarında Toxoplasma Gandhi'nin bradyzoitlere dönüşümünü tetiklemek için, 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağının her kuyucuğunun tabanına steril yuvarlak bir cam lameli yerleştirerek başlayın. Bir doku kültürü kabininde, konfluens olmuş 150 santimetrekarelik bir insan ön deri fibroblastı flaskı ile işleme başlayın.

Konfluen insan sünnet derisi fibroblastlarının bulunduğu flaskı iki kez XPBS ile durulayın ve ardından 2,5 mililitre %0,025 tripsin EDTA ekleyin. Flaskı 37 °C'de beş ila 10 dakika inkübe edin. Beş ila 10 dakikalık inkübasyonun ardından, hücrelerin plastik yüzeyden ayrılmasını sağlamak için flaska birkaç kez vurun.

Ardından, 150 mililitre HFF medyumu veya takviye edilmiş delcos modifiyeli eagles medyumu ekleyin. Flasku durulamak ve hücreleri toplamak için medyumu kullanın. Lamel içeren 24 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna bir mililitre hücre dağıtın; hücrelerin 37 °C'de ve %5 karbondioksit ortamında konfluens seviyesine ulaşmasını bekleyin.

Hücreler daha sonra Toxoplasma Gandhi paraziti ile enfekte edilmeye hazır olacaktır. Doku kültürü kabininde, konfluen hale gelmiş 25 santimetrekarelik bir flasktaki insan sünnet derisi fibroblastlarını iki x 10⁶ parazit ile enfekte edin ve hücreler liz olmaya başlayana kadar 37 °C'de inkübe edin. Yaklaşık iki ila üç gün sonra, enfekte olmuş sünnet derisi fibroblastı monokatmanını doku kültürü flaskından uzaklaştırmak için hücre kazıyıcı kullanın.

Ardından, yerinden oynatılmış monotabakayı 27 gauge bir iğneden geçirerek parazitleri konak hücrelerden serbest bırakın. Besiyerindeki parazit sayısını belirlemek için bir hemositometre kullanın ve ardından daha önce hazırlanmış konfluent insan sünnet derisi fibroblastlarının bulunduğu 24 kuyucuğun her birine 10⁵ parazit enfekte edin.

Parazitlerin konak hücrelere girmesine izin vermek için hücreleri 37 °C'de ve %5 karbondioksit ortamında üç saat boyunca inkübe edin. Parazitlerin Brady Zeolite evresine dönüşümünü indükleme işlemine geçin. Enfekte insan sünnet derisi fibroblastlarından DMEM'i uzaklaştırın.

Bunları bir kez XPBS ile durulayın ve ardından bir mililitre geliştirme ortamı ekleyin. Bikarbonat içermeyen ve pH sekiz'e ayarlanmış RPMI tabanlı bir ortam. Hücreleri 37 °C'de, ortam havasında üç gün boyunca inkübe edin.

Hücreler artık Bradyzoitlerin varlığını analiz etmek için hazırdır. Bradyzoitlerin varlığı, Toxoplasma gondii kist duvarına bağlanan floresan işaretli lektin docos, floresan glutenin veya DBA kullanılarak belirlenir; bu işlem, enfekte hücreleri floresan görüntüleme için hazırlar. Kuyucukları 1X PBS ile üç kez durulayın.

Ardından, hücre monokatmanlarını 200 µL %3 formaldehit ile 20 dakika boyunca sabitleyin. Sabitleyiciyi uzaklaştırın ve kuyucukları bir kez XPBS ile durulayın. Kuyucuklara 200 µL 0,1 molar glisin ekleyin ve beş dakika boyunca bekletin.

Glisini uzaklaştırın ve hücreleri bloklamak ve permeabilize etmek için kuyucukları bir kez XPBS ile durulayın. 250 µL bloklama çözeltisi ekleyin. Hücreleri 30 dakika boyunca inkübe edin.

Blokeleme çözeltisini uzaklaştırın ve kuyucukları bir kez XPBS ile durulayın. Kuyucuklara, ruminle konjugle edilmiş DBA'nın 1/250 seyreltisinden 50 µL ekleyin. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında, bir platform sarsıcısında bir saat boyunca sallayın.

İnkübasyonun ardından, lamelleri bir platform çalkalayıcıda beşer dakikalık sürelerle üç kez 1X PBS içerisinde %0,2 Triton X 100 ile yıkayarak floresan işaretli DBA'yı uzaklaştırın; son olarak lamelleri dpi içeren beta shield montaj ortamı kullanarak monte edin. Boyama, rodamine uygun bir filtreye sahip floresan mikroskop kullanılarak 100x büyütmede görselleştirilebilir. Bradyzoit oluşumunu indüklemek için alternatif bir yöntem olarak, enfekte kemik iliği kaynaklı makrofajlar interferon gama ve lipopolisakkarit (LPS) ile aktive edilebilir. Başlamak için, öncelikle bu işlem için L 929 kondisyonlu medyumu hazırlayın.

L 9 29, uzun süreli konfluens sonrası makrofaj koloni uyarıcı faktörü salgılayan, uygulanan bir fibrosarkom hücre hattıdır. Bu kondisyonlu ortam, hücre kültüründeki fare kemik iliği hücrelerini makrofajlara dönüştürmek için kullanılabilir. Kondisyonlu ortam hazırlamak için 1 150 santimetrekarelik bir flaskta L 9 2 9 hücrelerini 37 °C'de konfluense kadar büyütün. Ardından, hücreler küresel bir görünüm alana ve flask yüzeyinden ayrılmaya başlayana kadar onları yedi ila dokuz gün daha inkübe edin.

Besiyerini ve ayrılmış tüm hücreleri 50 mililitrelik bir tüpe toplayın ve 420 5G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Elde edilen süpernatant, kondisyonlu besiyeridir. 150 santimetrekarelik bir flask L 9 29 hücresi, 150 mililitre BMC besiyeri hazırlamak için gereken hacim olan 30 mililitre kondisyonlu besiyeri sağlayacaktır. BMC geliştirme sürecinde kullanılacak L 9 29 cm ile BMC için DMEM hazırlamayı unutmayın.

Kemik iliği hücrelerini izole etme yöntemini gösteren ayrıntılı video protokollerini izlemek için; fare femuru için, hasat edilen BMC'ler beş gün boyunca inkübe edildikten sonra lütfen aşağıdaki video protokollerini izleyin. Bakteriyolojik petri kaplarına, her bir kaba L 9 2 9 hücrelerinden elde edilmiş kondisyonlu ortam içeren 10 milliliters BMC besiyeri ekleyin ve hücrelerin tam olarak gelişmesi için iki gün daha inkübe edin.

Olgun kemik iliği kaynaklı makrofajlar veya BMS'ler, olgunlaştıktan sonra hücreleri ayırmak için bir ila iki hafta boyunca pasajlanabilir; medyum kaldırılır ve hücreler kalkmaya başlayana kadar 4 °C'de 30 dakika inkübe edilmiş 5 mL soğuk 1X PBS eklenir. Hücreler steril bir transfer pipeti ile plakadan durulanarak alınır. BMS'ler 50 mL'lik konik bir tüpe aktarılır ve hücreler 420 ×g'de 10 dakika boyunca pelletlenir.

Peleti 10 milliliters BMC besiyerinde yeniden süspande edin ve ardından hücre ekim yoğunluğunu belirlemek için bir hemositometre kullanın. 24 kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa 2 × 10⁵ BMS ekleyin. Alt kısmında yuvarlak blast lamel camlar bulunan bu plakada, hücreleri T Gandhi ile enfekte etmeden önce gece boyunca yapışmaya bırakın.

Fazla hücreler, daha sonra kullanılmak üzere Petri kaplarına alınabilir. BMS'yi aktive etmek için aktivasyon medyumu hazırlayın; agregatları dağıtmak amacıyla LPS'yi bir su banyosunda iki dakika boyunca sonike edin. Ardından BMC medyuma, mililitre başına 100 nanogram LPS ve mililitre başına 100 ünite IFN gamma ekleyin.

Son olarak, kuyucuklardaki BMC besiyerini uzaklaştırın ve yerine aktivasyon besiyeri ekleyin. 37 °C'de, %5 karbondioksit ortamında üç gün boyunca inkübe edin. BMC'ler, daha önce sünnet derisi fibroblastları ile gösterildiği şekilde boyanabilir.

Bu örneklerde, insan sünnet derisi fibroblastlarındaki toxoplasma Gandhi I Bradys, floresan DBA ile işaretlenmiştir. pH stresi altında, IFN Gamma ve L-P-S-D-V-A ile aktive edilmiş dms içindeki in vitro bir kistin bu kesitinde gösterildiği gibi kist duvarı floresanla işaretlenmiştir.

Burada gösterildiği gibi, vakuol yüzeyinde de boyanma mevcuttur. Fibroblastlar ve aktive edilmiş makrofajlar içindeki in vitro Toxoplasma gondii kistlerinin nasıl boyanacağını göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, parazitlerin ve konak hücrelerin aynı gün hazır olacak şekilde planlanmasının önemli olduğunu unutmamak gerekir.

Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.