Murin Islet İzolasyon ve subkapsüler Böbrek Nakli Bir Yöntem

Kuşgözü nakli, tip bir diyabet için potansiyel bir tedavi olarak önerilmiştir. Bununla birlikte, iki ana sınırlama bunun yaygın bir klinik gerçeklik olmasını engellemektedir. İlk olarak, alıcı başına çok sayıda deliğe ihtiyaç vardır.

Kuşgözü organ bağışçılarından elde edildiğinden, potansiyel alıcıların sayısı ciddi şekilde sınırlıdır. İkinci transplantasyon, güçlü immünosupresanlarla ömür boyu tedavi gerektirir, bu da hastayı, özellikle pediatrik popülasyonu malignite, enfeksiyon ve böbrek yetmezliği riskine sokar. Fare böbrek kapsülü altında kuşgözü nakli, klinik transplantasyon sonuçlarını iyileştirmeye yönelik stratejileri araştırmak için gerçekleştirilir.

Sağlıklı donör farelerden izole edilen halkalar gruplara ayrıldı ve nakil için hazırlandı. Delikler daha sonra böbreğin subkapsüler boşluğuna nakledilir. Diyabetik alıcı farelerde kuşgözü greft fonksiyonu, kan şekeri seviyelerinin izlenmesiyle değerlendirilir, bu da yaklaşık 250 ila 350 deliğin, transplantasyondan sonraki 24 saat içinde 20 gramlık bir alıcı farede u glisemiyi geri yükleyeceğini ortaya koymaktadır.

Bu yöntemin görsel gösterimi, kanülasyon adımları açısından kritik öneme sahiptir. Ortak safra kanalı ve deliklerin böbreğin subkapsüler boşluğuna transferini öğrenmek zordur. Bu adımlar, doku yapılarının tanımlanmasını, sabit elleri ve doku hasarını en aza indiren tekniğin kullanılmasını gerektirir.

Ötenazi yapılmış bir fareyi diseksiyon dürbünündeki bir kağıt havlu üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve karına% 70 etanol püskürtün. Kasık bölgesinden her iki ön bacağa V kesisi ile karnı açmak için makas kullanın. Fare, diseksiyon kapsamının altındadır.

Başı gözlemciye bakacak şekilde konumlandırın. Ortak safra kanalının duodenal girişini, koledak kanalının duodenum açıklığı olan bir hemostat klempi ile bulun. Hemostat, sıkıştırıldığında tam olarak pankreas bağırsak sınırı boyunca uzanacak şekilde konumlandırılmalıdır.

Burada safra kanalını kanüle etmek için iki yöntem gösterilecektir. Serbest el yöntemi ve forseps, safra kanalını kanüle etmeye yardımcı olur. Serbest el yöntemini kullanarak, duodenum üzerine kenetlenmiş kanama durdurucuyu farenin başından kuyruğa doğru çekin, böylece ortak safra kanalı gerilir.

Safra kesesinden akan safra ile karaciğerden gelen enzimlerin bir araya geldiği karaciğere yakın safra kanalında bir birleşim vardır Bağırsaklara girmeden önce safra kanalını V pozisyonunun içini ortaya çıkaracak şekilde sıkıca çekin. Beş mililitrelik bir şırıngaya bağlı bükülmüş 27 gauge bir iğne, böylece iğne V'den doğru kayar ve kanalın alt kısmını doğrudan kanüle eder. Karaciğer ve safra kesesine geri akışı önlemek için iğneyi eğimin ucunun birkaç milimetre ötesine kaydırın.

Kanülasyon başarılı olduğunda, şırıngadan iki mililitre liase vererek pankreası perfüze edin. Optimal kanülasyonun bir göstergesi olarak pankreasın mide üzerinde genişlemesini izleyin. Alternatif olarak, safra kanalı kanüle edilebilir.

Forseps kist yöntemini kullanarak. Duodenuma kenetlenmiş hemostat C'yi farenin başından kuyruğa doğru çekin, böylece ortak safra kanalı tort haline gelir. Daha sonra, beş mililitrelik bir şırıngaya bağlı bükülmüş 27 gauge bir iğne kullanarak, fasyayı karaciğere yakın ortak safra kanalının altında delin.

İğne hala yerindeyken fasyayı kanaldan temizlemek için iğneyi kullanın. Kanama durdurucuyu yere koyun ve bir çift forseps alın. Kanalı ve forsepsleri ileri doğru çekerken iğnenin fasyayı temizlediği safra kanalını desteklemek için açık forsepsin bir kolunu kullanın.

Forsepsleri geri tepme olarak kullanarak iğneyi kanala kaydırın. Başarılı bir kanülasyon, midenin üstündeki pankreas bölgesinin eşit şekilde genişlemesi ile gösterilir. Pankreas perfüze edildikten sonra, kanama durdurucuyu duodenumdan çıkarın.

Daha sonra duodenumu kaldırmak için forseps kullanın ve pankreası bağırsaklardan ayırmak için ikinci bir forseps çifti kullanın. Ardından, pankreası midenin ve dalağın üstünden serbest bırakın. Son olarak, pankreası karın dışına kaldırın ve bağırsak, mide ve dalağa giden kalan fasya bağlantılarından kesin.

Pankreası 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve buzun üzerine yerleştirin. Pankreası, ekteki yazılı protokoldeki talimatlara göre 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüplere 20 mililitre ortam ekleyin ve tüpleri 10 saniyede 40 kez kuvvetlice çalkalayarak dokuyu ayırın.

Bu adım, menekşelerin optimal şekilde geri kazanılması için kritik öneme sahiptir. Spin hücreleri dakikada 800 devirdir. Reçine 15 mililitre ortamda harcar ve numuneleri yoğunlaştırır.

Yeniden askıya alınmış bulamacı 0.419 milimetrelik bir tel örgüden dökün ve 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe hunileyin. İlk tüpü %10 fetal sığır serumu içeren 10 mililitre ek bir ortamla durulayın ve hücreleri santrifüjleme reus ile tel örgü peletinden dökün, peleti opak 10 77 mililitre oda sıcaklığında bükün. Daha sonra birkaç saniye hafifçe girdap yapın, tüpün duvarındaki delikleri yıkamak için tüpün iç kısmına beş mililitre daha opak ekleyin, 10 mililitre serum içermeyen RPMI'yi tüpün yan tarafına 10 mililitre oranında yerleştirmek için yavaşça pipetleyin.

Keskin bir arayüz belirgin olmalıdır. Daha sonra numuneleri 20 santigrat derecede ve 900 kez yerçekiminde 20 dakika boyunca çok yavaş hızlanma ve santrifüjlemeyi takiben frenleme olmadan sallanan bir kova santrifüjünde döndürün, adacıklar tek kullanımlık 10 mililitrelik serolojik pipet kullanılarak ekzokrin hücrelerden ayrılacaktır. Halkaları histo Paque medya arayüzünden 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın.

Bu noktada, kalan delikleri çıkarmak, opak doldurma tüplerini serum içeren ortamla doldurmak ve tüpleri dakikada 800 dönüşte iki dakika santrifüjleyerek adacıkları peletlemek için birkaç tüp bir araya getirilebilir. Sonra reus adacıkları taze ortamda askıya alır. Bu adımı en az iki kez tekrarlayın. Reus.

Paleti beş mililitre ortamda asın. 0.1 mililitrelik konik bir tüpe baş aşağı 15 milimetrelik bir naylon hücre süzgeci yerleştirin. Delikleri toplamak için yeniden askıya alınmış hücre bulamacını içinden pipetleyin.

Ardından 50 mililitrelik tüpü altı mililitre daha fazla ortamla durulayın ve süzgeçten geçirin. 10 santimetrelik bir Petri kabına üç mililitrelik bir orta damla yerleştirin. Hücre süzgecini ters çevirin ve delikleri toplamak için ortam damlasına daldırın, süzgeçten Petri kabına beş ila yedi mililitre daha kültür ortamı pipetleyin.

Süzgeçten kalan delikleri dört kez objektif altında toplamak için, halkaları bir P 200 pipeti ile tek tek toplayın ve bunları 1,5 mililitrelik bir mikro fuge tüpüne aktarın. Bu görüntüler, 12 haftalık C 57 siyah altı fareden izole edilen halkaları göstermektedir. Deliklerin saflığı ve kalitesi, izolasyon prosedürünün tamamlanmasının ardından mikroskobik olarak tahmin edilebilir.

Örneğin, burada gösterilen iki görüntü, enkaz ve ekzokrin hücre kontaminasyonunun mevcut olduğu temsili bir alanı göstermektedir. Bir deney için kuşgözü seçerken, sağlıksız görünen kirletici ekzokrin hücreleri veya kuşgözü toplamaktan kaçının. Nekrotik merkezlere sahip halkalar, izolasyondan 24 saat sonra alınan bu şekilde gösterildiği gibi sağlıksızdır, nekrotik merkezler izolasyondan hemen sonra görünmeyecektir.

Soyulan hücreler olan kuşgözü kaçınılmazdır ve bu 24 saatlik zaman atlamalı kuşgözü nakli videosunda kullanılabilir. İzolasyonun hemen ardından, birçok delikte nekrotik merkezler gelişir. Bu nekrotik merkezler, delik toplarken kaydın sonlarına doğru delikten dışarı atılmış gibi görünmektedir.

Bunları, her bir tüpün kuşgözü kalitesi ve boyutu eşit bir dağılımına sahip olacak şekilde gruplandırın. Örneğin, 15 delikten oluşan her grup dört büyük boyutlu delik, altı orta boy delik ve beş küçük delik içerebilir. Yer. Buz halkaları üzerindeki tüp, transplantasyon için hemen kullanılabilir veya manipüle edilebilir.

Kullanmadan önce. 1,5 mililitrelik mikro kaynaşmış bir tüpün açıklığına steril bir jel yükleme ucu yerleştirin, böylece ucun dar ucunda U şekli oluşturan hafif bir bükülme olur. Ucun her iki açıklığı da doğrudan mikro çöp tüpünün dışına bakmalıdır.

Bir delik tüpünü buzdan yavaşça çıkarın. Tüm deliklerin tüpün dibine yerleştiğinden emin olun. Bir P 200 pipet kullanarak, halkaları tüpün altından minimum hacimde nazikçe toplayın ve hazırlanan kavisli uca aktarın.

Delikler çökeldikten sonra, ortamı deliğin geniş açıklığından aspire ederek uçtan mümkün olduğunca çok malzemeyi çıkarın Jel yükleme ucu Bir P 200 pipetine takılı taze bir jel yükleme ucu ile. Borunun eğimli olmayan ucunu, adacık yatağı jel yükleme ucunun dar açıklığına takın. Ardından ucu bir P 200 pipetine takın ve adacıkları yavaşça borunun içine itin.

Ardından, PE 50 borusunun eğimsiz kenarını 25 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngasının iğnesine bağlayın. Piston geri çekildiğinde, halkalar eğimli açıklıktan yaklaşık 0,5 santimetre uzakta olana kadar şırınganın pistonuna bastırın. Şırıngayı bir kenara koyun, böylece böbrek halkaları almaya hazırlanırken halkalar tüpün eğimli açıklığının yakınında tek bir kütleye yerleşebilir.

Saçları kırparak ve cildi Betadine ile üç kez% 70 izopropil alkol ile dönüşümlü olarak ovalayarak cerrahi bölgeyi hazırlayın. Alıcı farede anesteziyi doğrulamak için bir ayak parmağı çimdikleme yaparak kuşgözü nakli prosedürüne başlayın. Bir cam çubuğun şaftını doğrudan farenin altına ve omuriliğe dik olarak böbreğin altına yerleştirin.

Daha sonra böbreği deriden bulun ve steril bir cerrahi örtü yerleştirin. Böbrek yerleştirildikten sonra, omuriliğe dik olarak doğrudan üzerindeki dermisten iki santimetrelik bir kesi yapmak için McFerson banis makasını kullanın. Bu kesi, makasla periton duvarını ortaya çıkaracaktır.

Cam çubuğun şaftını geri tepme olarak kullanarak dermal tabakadan kesilen yönde periton duvarından bir santimetre kesi yapın, bitişik yüzeye bastırarak böbreği periton açıklığından zorlayın. Açıkta kalan böbreğin yüzeyini ıslatılmış pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak buz gibi, steril PBS ile ıslatın. Böbrek kapsülünün kurumasını önlemek için adımı birkaç dakikada bir tekrarlayın.

27 gauge bir iğne kullanarak, böbrek kapsülünden böbreğin ön yüzeyi boyunca 0,2 santimetrelik bir kesi yapın. Sol yan taraftan sağ yan tarafa doğru hareket ederek, alevle çekilmiş bir cam kılcal boru yerleştirin. Daha önce yapılan kesiden sondalayın ve böbreğin dorsal yan yüzeyi boyunca arka yönde hareket ettirin.

Böbrek kapsülü ile böbrek parankimi arasında bir kese oluşturmak için, hazırlanan 25 mililitrelik Hamilton şırıngasındaki halkaları esnek tüpün eğimli açıklığının en kenarına getirin. Ardından eğimli kenarı yukarı bakacak şekilde subkapsüler poşete yerleştirin. Uzun kenar böbrek parankimi ile temas halindedir.

Tüpü kapsülün en arka ucuna taşıyın. Daha sonra, şırınganın pistonuna bastırarak delikleri PE 50 tüpünden subkapsüler torbaya yavaşça aktarın. Delikler torbayı doldururken, daha fazla yer açmak için esnek tüpü yavaşça geri çekin.

Tüpü poşetten çıkardıktan sonra, halkaları poşun proksimal ucuna nazikçe yerleştirmek için cam probu böbreğin dış yüzeyi boyunca ön tarafa kaydırın. Bükülmüş kol forsepsleri kullanarak, böbrek için yapılan açıklığa bitişik periton astarını kaldırın. Ardından, böbreği nazikçe periton boşluğuna geri itmek için PBS ıslatılmış pamuk uçlu bir aplikatör kullanın.

Periton duvarına dikişler uygulayarak fareyi kapatın ve klipsleri dermal tabakaya sarın. Fareyi kafesine ve monitörüne geri koyun. İyileşme için, fare bağırsağı için aseto meine suyu sağlanmalıdır.

C fare delikleri izole edilmiştir. Bu videoda açıklanan yöntemler kullanılarak ve allojenik C 57 siyah altı fareye iyileştirici bir doz nakledildi. Açlık dışı kan şekeri düzeyleri ameliyat sonrası birinci günden itibaren izlendi.

Burada allojenik bir donörden 300 delik alan 20 gramlık alıcı farelerde ret 17. gün civarında görülecektir. Sinjeneik donörlerden 150 delik veya 300 delik alan farelerde iyileşme izlendi. Halkalar sinjeneik donörlerden olduğu için bu nakillerde herhangi bir reddedilme görülmez.

Uygulanan kuşgözü dozu, transplantasyondan hemen sonra kuşgözü birincil işlevini ölçer. 150 kuşgözü ile marjinal iyileşme görülürken, 300 kuşgözü nakledildiğinde tam iyileşme görüldü. Bu videoyu izledikten sonra, fare deliklerini izole etmek ve bu delikleri böbreğin subkapsüler boşluğunun altına nakletmek için gereken kritik adımların nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Pratik yaparak, bu protokolün en zor adımı olan ortak safra kanalını hızlı bir şekilde kanüle etme yeteneğini geliştireceksiniz.