Name: Murin Islet İzolasyon ve subkapsüler Böbrek Nakli Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: Öğrenin fare pankreas adacık izolasyonu ve subkapsüler böbrek nakli yöntemini. Bu teknik tip 1 diyabet tedavisi için kan şekeri seviyelerini normale döndürmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma RO1 DK064938 (TH) tarafından desteklenmektedir.

<ol><li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+as+a+treatment+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Optom+Assoc%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation as a treatment for diabetes.</a> J Am Optom Assoc. 69, 727-732 (1998).</li>
<li>Gangemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+for+brittle+type+1+diabetes%3A+the+UIC+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation for brittle type 1 diabetes: the UIC protocol.</a> Am J Transplant. 8, 10-1111 (2008).</li>
<li>Zmuda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+ATF3%2C+an+adaptive-response+gene%2C+protects+islets+and+ameliorates+inflammation+in+a+syngenic+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Deficiency of ATF3, an adaptive-response gene, protects islets and ameliorates inflammation in a syngenic transplantation model.</a> Diabetologia. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Bottino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Human+Islets+to+Isolation+Stress+and+the+Effect+of+Antioxidant+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Response of Human Islets to Isolation Stress and the Effect of Antioxidant Treatment.</a> Diabetes. 53, 2559-2568 (2004).</li>
<li>Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+islet+cell+culture+in+vitro+at+24+degrees+C+on+graft+survival+and+MHC+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The effect of islet cell culture in vitro at 24 degrees C on graft survival and MHC antigen expression.</a> Transplantation. 49, 272-277 (1990).</li>
<li>Terasaka, R., Lacy, P. E., Hauptfeld, V., Bucy, R. P., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cyclosporin-A%2C+low-temperature+culture%2C+and+anti-Ia+antibodies+on+prevention+of+rejection+of+rat+islet+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">The effect of cyclosporin-A, low-temperature culture, and anti-Ia antibodies on prevention of rejection of rat islet allografts.</a> Diabetes. 35, 83-88 (1986).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Sterbenz, K., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+culture+of+human+islets+or+in+vivo+treatment+with+L3T4+antibody+produces+a+marked+prolongation+of+islet+human-to-mouse+xenograft+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Low-temperature culture of human islets or in vivo treatment with L3T4 antibody produces a marked prolongation of islet human-to-mouse xenograft survival.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 8080-8084 (1987).</li>
<li>Schnedl, W. J., Ferber, S., Johnson, J. H., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STZ+transport+and+cytotoxicity.+Specific+enhancement+in+GLUT2-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">STZ transport and cytotoxicity. Specific enhancement in GLUT2-expressing cells.</a> Diabetes. 43, 1326-1333 (1994).</li>
<li>Eckhard, M., Brandhorst, D., Brandhorst, H., Brendel, M. D., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+in+osmolality+and+range+of+density+of+a+continuous+ficoll-sodium-diatrizoate+gradient+for+isopycnic+purification+of+isolated+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Optimization in osmolality and range of density of a continuous ficoll-sodium-diatrizoate gradient for isopycnic purification of isolated human islets.</a> Transplantation Proceedings. 36, 2849-2854 (2004).</li>
<li>Gores, P. F., Rabe, F., Sutherland, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+survival+of+intraportal+versus+subrenal+capsular+transplanted+islet+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Prolonged survival of intraportal versus subrenal capsular transplanted islet allografts.</a> Transplantation. 43, 747-749 (1987).</li>
<li>Nasr, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+Immune+Privilege+Promotes+Transplantation+Tolerance+by+Altering+the+Balance+between+Memory+and+Regulatory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Testicular Immune Privilege Promotes Transplantation Tolerance by Altering the Balance between Memory and Regulatory T Cells.</a> J Immunol. 174, 6161-6168 (2005).</li>
<li>Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+implantation+site+for+pancreatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation.</a> British Journal of Surgery. 95, 1449-1461 (2008).</li>
<li>Inoue, M., Maeno, T., Hatchell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+allografted+pancreatic+islets+in+the+subretinal+space+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Survival of allografted pancreatic islets in the subretinal space in rats.</a> Ophthalmic Res. 35, 48-53 (2003).</li>
</ol>

Yukarıdaki bölümlerde, yalıtma ve fare pankreas adacık nakli için ayrıntılı adımlar nitelendirdi. Burada, kısaca prosedürlerinin başarısı için kritik adımları vurgulayın. 1. Islet izolasyon 37 cannulating sonra koledok (2.3), pankreas dinç sallayarak, önemli adımlar koledok (2.2.3) duodenal açılış üzerinden hemostat kelepçe konumlandırma optimal bir enzimatik sindirim süresi (1.4) tespit. ° C sindirmek (3.2) ve ekzokrin hücre kontaminasyon (3.3.7 ve 3.3.16) kaldırılması. Bu adımlar, adacıklar kalite, verim ve saflık üzerinde dramatik bir etkisi var. Belki teknik olarak en zorlu adım koledok kanülasyonu. Birçok farelerde, koledok çevreleyen fasya nedeniyle görselleştirmek için zor olabilir. Bu nedenle, bu girişimleri sadece fasya doku penetrasyonu koledok sonucu cannulate için yaygındır. Bu gibi durumlarda, Liberase çevreleyen bağ dokusu doldurmaya başlar ve pankreas serpmek değildir. Bu görülürse, Liberase akışını durdurmak ve safra kanalı lümen içine nüfuz eder, böylece iğne yeniden konumlandırmak. Uygulama ile, hızlı iğne yerleşimi için en uygun pozisyonu belirlemek ve gevrek kanalı zarar vermeden kanülasyon tamamlamak mümkündür. 2. Adacık nakli Kritik adımlar, diyabet (5.1) STZ indüksiyon ve verimli bir şekilde teslim adacıklar subkapsüler çantası (5.3.14-5.3.16). STZ insülin salgılayan hücreler adacıklar 9 β-hücrelerinde seçici toksik doğal olarak bulunan bir glukoz analoğu. Ancak, bu seçici toksisite nispeten dar bir konsantrasyon aralığında oluşur. Bu STZ yüksek dozlarda hiperglisemi yokluğunda hızlı (2-3 gün) öldürücülüğü neden olabilir gerçeği kanıtladığı. Bu nedenle, herhangi bir büyük ölçekli deneyler başlatılan önce kullanılan farelerin zorlanma ve yaş için optimal doz STZ tanımlamak için dikkat edilmelidir. Subkapsüler kese adacıklar fiziki teslimat da önemli bir adımdır. Tutarlı sonuçlar elde etmek için, kendi doğum sırasında adacık kaybını en aza indirmek için zorunludur. Enjekte edilen hacim çok büyükse keseyi kaplayan böbrek kapsül defektleri veya yırtık ya da bu durum oluşabilir. Kapsül hasar ve subkapsüler çantası hazırlamak için düz cam prob kullanarak nazik ve dikkatli bir manipülasyon ile önlenebilir. Ayrıca, enjeksiyon hacmi adım 5.3.6.3 süpernatant dikkatli kaldırılması ile minimize edilebilir. Süpernatantı tortulaşmış adacıklar seviyeye çıkarılırsa, genellikle subkapsüler poşet 400 ila 500 adacık yerleştirmek için yeterli oda daha vardır. Ancak, enjeksiyon hacmi çok büyükse, adacıklar deney tekrarlanabilirlik ödün nakli işlemi sırasında kese sızıntı olasılığı daha yüksektir. Bu protokol kapsamında, bazı adımlar değiştirebilir ve yine de tatmin edici sonuçlar elde etmek mümkündür. Bunlar şunlardır: (a), pankreas sindirmek için farklı bir enzim kullanımı, (b), pankreas enzim sağlamak için farklı bir yöntem, (c) sürekli bir Ficoll-sodyum-diatrizoate (FSD) gradient kullanımı tek yoğunluğu Histopaque1077 adım, ve (d), böbrek subcapsule daha diğer yerlerde adacık nakli yerine. <ol class="lalpha"><li> Bu protokolde, Liberase pankreas içinde hücre-hücre rehber zayıflatmak için kullanılır. Liberase esas olarak pankreas adacık bırakmadan yararlı kolajenazlar yüksek oranda saflaştırılmış bir karışımıdır. Ancak, az saflaştırılmış kolajenazlar benzer bir sonuç gerçekleştirerek yeteneğine sahiptirler. Bu nedenle, sürece sindirim durumu yüksek adacık kalitesi elde etmek için optimize edilmiştir, verim ve saflık, pankreas sindirerek için farklı piyasada bulunan enzim preparatları kullanmak mümkün. </li><li> Pankreasın duktal perfüzyon olmadan enzim sindirimi de mümkündür. Koledok ile Liberase Teslimat pankreas enzim yüzey alanı maksimum maruz kalma sağlar. Bu sonuçlar, pankreas ve sağlam adacıklar daha serbest, daha eşit sindirim. Ancak, pankreas enzim yüzey alanını artırmak için diğer adımları da kullanılabilir. Örneğin, Liberase kuluçka veya doğrudan pankreas kapsülü ile Liberase enjekte önce kıyma pankreas adacık izole etmek için kullanılabilir. Ancak, Liberase teslim başka hiçbir yöntem koledok ile perfüzyon kadar etkili. Bu nedenle, kıyma ya da direkt enjeksiyon koledok hasar ve perfusable değilse son çare olarak ayrılmış olmalıdır. </li><li> Adacıklar ekzokrin hücreleri ayırmak için alternatif bir yöntem içerir.Histopaque1077 10 yerine FSD degrade kullanın. Bu protokol ekzokrin hücrelerden adacık verimli bir ayırma parçası iki hücre tipleri arasında bir yoğunluk farkı nedeniyle. Histopaque1077 1,0771 g / ml yoğunluğu 25 ° C Bu sıcaklıkta, Histopaque adacıklar ama ekzokrin hücreler daha az yoğun daha yoğundur. Bu nedenle, adacıklar, santrifüj Histopaque1077 pelet ekzokrin hücreler kuvveti altında yüzey kaldırırken. Prensip olarak, bu adımda ekzokrin hücreler adacıklar ayırabilirsiniz bir yoğunluk ile herhangi bir diğer madde kullanılan ve FSD degrade böyle bir maddedir. </li><li> Bu protokolde kullanılan böbrek kapsülü adacık nakli için konumu açısından, birkaç olası sitelerin biridir. Böbrek subcapsule farelerde nakli en sık bildirilen site olmakla birlikte, diğer nakli siteleri etkili olduğu bulundu ve hepatik portal ven, subretinal alan, testis, epididim yağ yastığı, dalak ve pankreas 11-14 bile olmuştur. Bu konumların her biri kendi avantajları ve zorlukları vardır. Bu nedenle, adacık nakli için bir site seçimi ele sorular ve deneyler belirli koşullar tarafından tespit edilmelidir. </li></ol> Adacık nakli sınırlamaları aşmak stratejileri önemli ölçüde terapötik potansiyelini artıracaktır inanıyordu. Bu nedenle, bu protokol bir fare modeli ayrıntılı olarak kullanımı gibi stratejiler belirlenmesi için cazip bir yaklaşım sunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL</td><td>Reaktif</td><td>Roche Group</td><td>05401020001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque1077</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Sitrat</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotosin</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-0130</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Reaktif</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Reaktif</td><td>Vedco, Inc.</td><td>ISOSOL</td><td></td></tr><tr><td>Cam Kılcal Tüpler</td><td>Ekipman</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362574</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin Şırıngası</td><td>Ekipman</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>27 Gauge Şırınga İğnesi</td><td>Ekipman</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Şırınga #1702</td><td>Ekipman</td><td>Fisher Scientific</td><td>14813133</td><td></td></tr><tr><td>10cm Petri Kapları</td><td>Ekipman</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>6cm Petri Kapları</td><td>Ekipman</td><td>Fisher Scientific</td><td>07770212</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Sütür</td><td>Ekipman</td><td>Ethicon Inc.</td><td>8726H</td><td></td></tr><tr><td>PE 50 Esnek Boru</td><td>Ekipman</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9083963</td><td></td></tr><tr><td>5ml Tek Kullanımlık Şırınga</td><td>Ekipman</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>50ml Konik Tüp</td><td>Ekipman</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>15ml Konik Tüp</td><td>Ekipman</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>0.1mm Naylon Mesh</td><td>Ekipman</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>0.419mm Tel Mesh</td><td>Ekipman</td><td>Newark Wire Cloth Company</td><td>0300241</td><td></td></tr><tr><td>Benmari İnkübatör</td><td>Ekipman</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-5</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Ekipman</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>İnverted Mikroskop</td><td>Ekipman</td><td>Nikon Instruments</td><td>TMS</td><td></td></tr><tr><td>Doku Kültürü İnkübatörü</td><td>Ekipman</td><td>Napco</td><td>6300</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Makası</td><td>Ekipman</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14393</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas Makası</td><td>Ekipman</td><td>Kent Scientific</td><td>INS500260</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli Pens</td><td>Ekipman</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15915</td><td></td></tr><tr><td>Hemostatik Pens</td><td>Ekipman</td><td>Kent Scientific</td><td>INS 500451</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran Nebülizör</td><td>Ekipman</td><td>Smiths Medical</td><td>ISOTech 4 OHMEDA</td><td></td></tr><tr><td>Sallanan Kova Santrifüj</td><td>Ekipman</td><td>Dupont &amp;#8211; Sorvall</td><td>RT6000D</td><td></td></tr><tr><td>Sallanan Kova Rotoru</td><td>Ekipman</td><td>Dupont &amp;#8211; Sorvall</td><td>H1000B</td><td></td></tr><tr><td>pH Metre</td><td>Ekipman</td><td>Mettler Toledo</td><td>09313509</td><td></td></tr><tr><td>Jel Yükleme Uçları</td><td>Ekipman</td><td>Fisher Scientific</td><td>05408151</td><td></td></tr><tr><td>p200 Uçlar</td><td>Ekipman</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0730</td><td></td></tr></tbody></table>

murin islet İzolasyon ve subkapsüler böbrek nakli bir yöntem

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Ballinger ve Reckard diyabetik kemirgenler Langerhans adacıkları bu nakli gösteren ilk öncü çalışması, kan şekeri düzeyleri normale beri, adacık nakli, Tip 1 diyabet 1,2 için potansiyel bir tedavi olarak öne sürülmüştür. Daha yakın zamanda, insan adacık nakli gelişmeler, bu görünümü 1,3 daha da güçlendirdi . Ancak, iki önemli sınırlamalar, yaygın klinik bir gerçeklik olmaktan adacık nakli önlemek için: (a) önemli ölçüde etkileyen ciddi potansiyel alıcıların sayısını azaltır hasta başına adacıklar, çok sayıda gereksinimi, ve (b) ağır immunsupresyon ihtiyacı, uzun vadeli immünosupresyon güvenlik açığı nedeniyle hastalar pediatrik popülasyonda. Bu sınırlamaları aşmak Stratejileri adacık nakli tedavi programını geliştirmek için potansiyel var. Adacık nakli fare böbrek kapsülü altında adacık nakli geliştirmek için çeşitli stratejiler araştırmak için yaygın olarak kabul gören bir model. Bu deney, yüksek kaliteli adacıklar ve diyabetik alıcıya adacıklar implantasyonu izolasyon gerektirir. Her iki prosedür video metin ile daha iyi ortaya konabilir cerrahi işlem gerektirmez. Burada, video ve yazılı bir protokol hem de bu işlemler için ayrıntılı adımlar belge. Ayrıca farklı nakli modelleri kısaca tartışın: singeneik, allojenik, singeneik otoimmün ve otoimmün allojenik.

Izole adacık transplantasyonu tip 1 şeker hastalığı için potansiyel bir tedavi olarak öne sürülmüştür. Burada, fare pancreata adacıkları izole, ve böbrek subkapsüler alan nakli için bir yöntem açıklanmaktadır.

Murin Islet İzolasyon ve subkapsüler Böbrek Nakli Bir Yöntem

Ballinger ve Reckard'ın, diyabetik kemirgenlere Langerhans adacıklarının transplantasyonunun ... normalleştirebileceğini gösteren öncü çalışmalarıyla başlayan süreçten beri...

Adacık transplantasyonu, tip 1 diyabet için potansiyel bir tedavi olarak önerilmiştir. Ancak, iki temel kısıtlama bunun yaygın bir klinik gerçeklik haline gelmesini engellemektedir. Birincisi, alıcı başına çok sayıda adacığa ihtiyaç duyulmasıdır.Adacıklar organ donörlerinden elde edildiği için potansiyel alıcı sayısı oldukça sınırlıdır. İkinci transplantasyon, hastayı ve özellikle pediatrik popülasyonu malignite, enfeksiyon ve böbrek yetmezliği riskine maruz bırakan ömür boyu güçlü immünsüpresan tedavisi gerektirir. Klinik transplantasyon sonuçlarını iyileştirmeye yönelik stratejileri araştırmak amacıyla fare böbrek kapsülü altına adacık transplantasyonu gerçekleştirilir.Sağlıklı donör farelerden izole edilen göz adacıkları gruplandırıldı ve transplantasyon için hazırlandı. Ardından göz adacıkları böbreğin subkapsüler boşluğuna nakledildi. Diyabetik alıcı farelerde göz adacığı grefti fonksiyonu, kan glukoz seviyelerinin izlenmesiyle değerlendirildi; bu izleme, 20 gramlık bir alıcı farede yaklaşık 250 ila 350 göz adacığının, transplantasyonu takiben 24 saat içinde glukoz seviyelerini normale döndürdüğünü (glisemi sağladığını) ortaya koymuştur.Bu yöntemin görsel gösterimi, kanülasyon adımları açısından kritik öneme sahiptir. Ortak safra kanalının kanüle edilmesi ve gözlelerin böbreğin subkapsüler boşluğuna aktarılması zor öğrenilen işlemlerdir. Bu adımlar, doku yapılarının tanımlanmasını, sabit elleri ve doku hasarını en aza indiren tekniklerin kullanılmasını gerektirir.Ötanazi uygulanmış bir fareyi, diseksiyon mikroskobunun altındaki bir kağıt havlu üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve karnını %70 ethanol ile püskürtün. Kasık bölgesinden her iki ön bacağa doğru V şeklinde bir insizyon yaparak karnı açmak için makas kullanın. Fare, diseksiyon mikroskobunun altındadır.Baş kısmı gözlemciye bakacak şekilde konumlandırın. Ortak safra kanalının duodenum girişini, yani ortak safra kanalının duodenum ağzını bir hemostatik klemple belirleyin. Hemostat, sıkıştırıldığında tam olarak pankreas-bağırsak sınırı boyunca ilerleyecek şekilde konumlandırılmalıdır.Burada safra kanalının kanülasyonu için iki yöntem gösterilecektir. Safra kanalını kanüle etmek için serbest el yöntemi ve forseps destekli yöntem. Serbest el yöntemini kullanarak, ortak safra kanalı gergin hale gelene kadar duodenum üzerine kenetlenmiş hemostatı farenin başından kuyruğuna doğru çekin.Safra kesesinden boşalan safra ile karaciğerden gelen enzimlerin birleştiği, karaciğere yakın bir safra kanalı konfluensi bulunur. Bağırsaklara girmeden önce, V pozisyonunun iç kısmını açığa çıkarmak için safra kanalını gergin tutun. Beş mililitrelik bir şırıngaya takılı, bükülmüş 27 gauge iğneyi, iğnenin V arasından kayarak geçmesini sağlayacak şekilde yerleştirin ve kanalın alt kısmını doğrudan kanüle edin. Karaciğere ve safra kesesine geri akışı önlemek için iğneyi, eğim ucunun birkaç milimetre ötesine itin.Kanülasyon başarılı olduktan sonra, şırıngadan iki mililitre liase vererek pankreası perfüze edin. Optimal kanülasyonun bir göstergesi olarak pankreasın mide üzerinden genişlemesini gözlemleyin. Alternatif olarak, safra kanalı da kanüle edilebilir.Forsep kisti yöntemini kullanarak; duodenum üzerinde kenetlenmiş olan hemostat C'yi, farenin başından kuyruk kısmına doğru çekerek ortak safra kanalının kıvrılmasını sağlayın. Ardından, beş mililitrelik bir şırıngaya takılı eğilmiş 27 gauge bir iğne kullanarak, karaciğere yakın bölgede ortak safra kanalının altındaki fasyayı delin.İğne yerindeyken, iğneyi kullanarak fasya tabakasını kanal üzerinden temizleyin. Hemostatı bırakıp bir forseps alın. İğnenin fasyayı temizlediği bölgede safra kanalını desteklemek için açık forsepsin bir kolunu kullanırken, kanalı ve forsepsi öne doğru çekin.Penseti destek olarak kullanarak iğneyi duktusun içine kaydırın. Başarılı bir kanülasyon, midenin üzerindeki pankreas bölgesinin eşit şekilde genişlemesiyle anlaşılır. Pankreas perfüze edildikten sonra, hemostatı duodenumdan çıkarın.Ardından, duodenumu kaldırmak için pensi kullanın ve pankreası bağırsaklardan ayırmak için ikinci bir pens çifti kullanın. Daha sonra, pankreası midenin üst kısmından ve dalaktan ayırarak çekin. Son olarak, pankreası karnın dışına kaldırın ve bağırsak, mide ve dalakla olan geri kalan fasya bağlantılarını keserek serbest bırakın.Pankreası 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve buz üzerine koyun. Pankreası, beraberindeki yazılı protokoldeki talimatlara göre 37 degrees Celsius sıcaklıkta inkübe edin. İnkübasyon sonrası tüplere 20 mililitre besiyeri ekleyin ve tüpleri 10 saniye boyunca 40 kez şiddetli bir şekilde çalkalayarak dokuyu disosiye edin.Bu adım, menekşelerin optimum düzeyde geri kazanımı için kritiktir. Hücreleri dakikada 800 devirle santrifüjleyin. Çökelekleri 15 mililitre besiyerinde resüspande edin ve örnekleri yoğunlaştırın.Yeniden süspande edilen bulamacı 0,419 milimetrelik bir tel süzgeçten geçirerek yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. İlk tüpü, %10 fetal bovine serum içeren ek 10 mililitre besiyeri ile durulayın ve tel süzgeçten geçirin; hücreleri santrifüj ile çöktürün. Pelleti beş mililitre oda sıcaklığındaki hisopaque 1077 ile yeniden süspande edin. Ardından birkaç saniye boyunca nazikçe vorteksleyin, tüpün iç çeperindeki hücreleri yıkamak için ek beş mililitre hisopaque ekleyin; 10 mililitre serumsuz RPMI'ı tüpün kenarından, 10 saniyede bir mililitre hızla yavaşça pipetleyerek üst tabakaya ekleyin.Keskin bir ara yüz belirgin olmalıdır. Ardından örnekleri, sallanan kovalı bir santrifüjde, 20 °C'de ve 900 ×g'de, çok düşük hızlanma ile 20 dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüjleme sonrası frenleme yapmayın, ardından adacıklar tek kullanımlık 10 mL serolojik pipet kullanılarak ekzokrin hücrelerden ayrılacaktır. Adacıkları histo Paque medya ara yüzünden yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın.Adacık kalıntılarını uzaklaştırmak için bu noktada birkaç tüp birleştirilebilir; ardından tüpler serum içeren besiyeri ile doldurulur ve tüpler dakikada 800 devirde iki dakika boyunca santrifüj edilerek adacıklar çöktürülür. Daha sonra adacıklar taze besiyerinde yeniden süspanse edilir. Bu adımı en az iki kez tekrarlayın.Pelleti beş mililitre besiyerinde süspande edin. 15 mililitrelik konik bir tüpün üzerine 0,1 milimetrelik naylon hücre süzgecini ters şekilde yerleştirin. Gözlemleri toplamak için yeniden süspande edilen hücre bulamacını pipetle süzgeçten geçirin.Ardından 50 mililitrelik tüpü altı mililitre daha besiyeri ile durulayın ve süzgeçten geçirin. 10 santimetrelik bir Petri kabına üç mililitre besiyeri damlatın. Hücre süzgecini ters çevirip gözletleri toplamak için besiyeri damlasına daldırın; süzgeçten geçirerek Petri kabına beş ila yedi mililitre daha kültür besiyeri pipetleyin.Süzgeçte kalan eyelet'leri 4x objektif altında toplamak için, eyelet'leri P 200 pipet ile tek tek seçin ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu görüntüler, 12 haftalık C 57 black six farelerinden izole edilen eyelet'leri göstermektedir. İzolasyon prosedürü tamamlandığında, eyelet'lerin saflığı ve kalitesi mikroskobik olarak tahmin edilebilir.Örneğin, burada gösterilen iki görüntü, debris ve ekzokrin hücre kontaminasyonunun bulunduğu temsili bir alanı göstermektedir. Bir deney için eyelet seçerken, kontamine olmuş ekzokrin hücreleri veya sağlıksız görünen eyeletleri seçmekten kaçının. İzolasyondan 24 saat sonra çekilen bu şekilde gösterildiği üzere, nekrotik merkezli eyeletler sağlıksızdır; nekrotik merkezler izolasyonun hemen ardından görünür olmayacaktır.Hücre dökülmesi gösteren adacıklar kaçınılmazdır ve adacıkların yer aldığı bu 24 saatlik zaman atlamalı videoda, adacık transplantasyonunda kullanılabilirler. İzolasyonu takiben, birçok adacığın içinde nekrotik merkezler gelişir. Adacıklar seçilirken, bu nekrotik merkezlerin kaydın sonuna doğru adacıktan atıldığı görülmektedir.Her tüpte kuşgözü kalitesinin ve boyutunun eşit dağıldığından emin olacak şekilde gruplandırın. Örneğin, 15 kuşgözünden oluşan her grup; dört adet büyük boyutlu kuşgözü, altı adet orta boyutlu kuşgözü ve beş adet küçük kuşgözü içerebilir. Tüpü buz üzerine yerleştirin; kuşgözleri nakil için hemen kullanılabilir veya manipüle edilebilir.Kullanımdan önce. Steril bir jel yükleme ucunu, ucun dar kısmında U şekli oluşturacak hafif bir bükülme meydana gelecek şekilde 1,5 mililitrelik bir mikro füzyon tüpünün ağzına yerleştirin. Ucun her iki ağzı da mikro füzyon tüpünden doğrudan yukarıya bakmalıdır.Bir tüp kuşgözünü buzdan yavaşça çıkarın. Tüm kuşgözlerinin tüpün dibine çöktüğünden emin olun. P 200 pipeti kullanarak kuşgözlerini tüpün dibinden minimum hacimde nazikçe toplayın ve hazırlanan eğri uca aktarın.Adacıklar çöktükten sonra, adacık içeren jel yükleme ucunun geniş açıklığından medyayı aspire ederek ucun ucundaki medyanın mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırın. P 200 pipete yeni bir jel yükleme ucu takın. Tüpün eğimsiz ucunu, adacık içeren jel yükleme ucunun dar açıklığına takın. Ardından ucu bir P 200 pipete takın ve adacıkları nazikçe tüpün içine itin.Ardından, PE 50 tüpünün eğimli olmayan ucunu 25 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngasının iğnesine bağlayın. Pistonu geri çekmiş haldeyken, halkalar eğimli açıklıktan yaklaşık 0,5 santimetre uzağa gelene kadar şırınga pistonuna basın. Böbrek halkaları almaya hazırlandığı sırada, halkaların tüpün eğimli açıklığının yakınında tek bir kütle halinde toplanması için şırıngayı kenara ayırın.Tüyleri kırparak ve cildi sırasıyla üç kez Betadine ve %70 izopropil alkol ile ovarak temizleyerek cerrahi bölgeyi hazırlayın. Alıcı farede anesteziyi doğrulamak için ayak ucunu sıkarak gözlet transplantasyon prosedürüne başlayın. Bir cam çubuğun gövdesini, farenin doğrudan altına ve böbreğin altına, omuriliğe dik olacak şekilde yerleştirin.Ardından böbreği cilt üzerinden bulun ve steril bir cerrahi örtü yerleştirin. Böbrek bulunduğunda, hemen üzerindeki dermis üzerinden, omuriliğe dik olacak şekilde iki santimetrelik bir insizyon yapmak için McFerson banis makası kullanın. Bu insizyon, makas yardımıyla periton duvarını açığa çıkaracaktır.Cam çubuğun gövdesini destek olarak kullanarak, dermal katmandaki kesikle aynı yönde periton duvarı boyunca bir santimetrelik bir insizyon yapın; komşu yüzeye aşağı doğru bastırarak böbreği periton açıklığından dışarı itin. Açığa çıkan böbrek yüzeyini, emdirilmiş pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak buz gibi soğuk, steril PBS ile nemlendirin. Böbrek kapsülünün kurumasını önlemek için gerektiğinde bu adımı birkaç dakikada bir tekrarlayın.27 gauge bir iğne kullanarak, böbreğin ön yüzeyi boyunca böbrek kapsülünde 0,2 santimetre boyutunda bir insizyon yapın. Sol lateral taraftan sağ lateral tarafa doğru hareket ederek, alevle çekilmiş bir cam kapiler tüp yerleştirin. Daha önce yapılan insizyon aracılığıyla sondaj yapın ve tüpü böbreğin dorsal lateral yüzeyi boyunca posterior yönde ilerletin.Böbrek kapsülü ile böbrek parenkimi arasında bir cep oluşturmak için, hazırlanmış 25 milliliter Hamilton şırıngasındaki halkaları esnek tüpün eğimli açıklığının en uç kısmına kaydırın. Ardından, eğimli kenar yukarı bakacak şekilde subkapsüler cebe yerleştirin. Uzun kenar böbrek parenkimi ile temas halindedir.Tüpü kapsülün en posterior ucuna taşıyın. Ardından, şırınganın pistonunu bastırarak eyelet'leri PE 50 tüpünden subkapsüler cebe yavaşça aktarın. Eyelet'ler cebi doldurdukça, daha fazla yer açmak için esnek tüpü yavaşça geri çekin.Tüp poşetten çıkarıldıktan sonra, gözleri poşetin proksimal ucuna nazikçe yerleştirmek için cam probu böbreğin dış yüzeyi boyunca anteriordan posteriora doğru kaydırın. Dirsekli pens kullanarak, böbrek için açılan deliğin bitişiğindeki peritoneal astarı kaldırın. Ardından, PBS emdirilmiş pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak böbreği nazikçe peritoneal kaviteye geri itin.Periton duvarına sütür ve dermal tabakaya yara klipsleri uygulayarak fareyi kapatın. Fareyi kafesine geri koyun ve gözlemleyin. İyileşme süreci için farenin içme suyuna asetaminofen eklenmelidir.İzole edilen C fare gözleri, bu videoda açıklanan yöntemler kullanılarak ve küratif bir dozda allojenik C 57 black six farelere nakledildi. Ameliyat sonrası birinci günden itibaren açlık dışı kan glikoz seviyeleri izlendi.Burada, allojenik bir donörden 300 gözeyik alan 20 gramlık alıcı farelerde reddetme reaksiyonu 17. gün civarında görülmektedir. Syngenik donörlerden 150 veya 300 gözeyik alan farelerde iyileşme izlenmiştir. Gözeyikler syngenik donörlerden geldiği için bu transplantasyonlarda herhangi bir reddetme reaksiyonu görülmez.Uygulanan adacık dozu, transplantasyonun hemen ardından adacıkların temel işlevini ölçer. 150 adacık ile marjinal bir iyileşme görülürken, 300 adacık transplantasyonu yapıldığında tam iyileşme görülmüştür. Bu videoyu izledikten sonra, fare adacıklarını izole etmek ve bu adacıkları böbreğin subkapsüler boşluğuna transplant etmek için gereken kritik adımları nasıl gerçekleştireceğiniz konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir.Pratik yaptıkça, bu protokolün en zor adımı olan ana safra kanalının kanülasyonunu hızlıca gerçekleştirme becerisi geliştireceksiniz.

a-method-for-murine-islet-isolation-subcapsular-kidney

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Protokolü, temiz ve kolay bir adacık veya hücreleri farelerin böbrek kapsülü altında sunmak için geliştirildi. Hücreler, böbrek kapsül altında hücrelerinin nakli için kullanılan son tüp pelet içine yoğunlaşmıştır. Bu tekniğin kolaylığı hücreleri ve fare stresi azaltır.

Diyabetik Fare Böbrek Kapsül içine, Pankreas Islets Nakli

Farelerde böbrek transplantasyonu, başarı için dikkatli post-operatif bakım ve tedavi gerektiren bir teknik olarak oldukça zor bir işlemdir.

Murin Böbrek Nakli Prosedürü

Bu videoda, pankreas adacık hücrelerini hepatik portal ven içine infüze etmek için bir prosedürü ve ardından kanamayı başarılı bir şekilde önlemek için jel köpük uygulamasını açıklıyoruz. Postoperatif kanama, adacık nakli sırasında sık görülen yüksek mortalite nedenidir.

Adacık Transplantasyonunda Murin Modeli: Pankreas Adacıklarının Portal Ven İçine İnfüzyonu ve Postoperatif Kanamanın Önlenmesi İçin Cerrahi Bir Yöntem

Intraoküler nakli ve konfokal mikroskopi birleştirerek yeni bir yaklaşım aşılı dokuların içinde tek hücreli çözünürlüğe sahip uzunlamasına, non-invaziv, gerçek zamanlı görüntüleme...

Boyuna, Non-invaziv için Eye Ön Kamara içine Nakli<em&gt; In vivo</emGerçek zamanlı Tek hücreli Çözünürlük&gt; Görüntüleme

Bu makalenin amacı, arteriyel anastomozun ayrıntılarına özellikle dikkat ederek, bir farede böbrek nakli gerçekleştirmek için gereken adımları tanımlamaktır.

Murin Böbrek nakli Tekniği

Bu protokol, murine iz izolasyonunu ve bir desellularize iskele üzerine tohumlamayı gösterir. İskele destekli adacıklar streptozotosin (STZ) ile indüklenen diyabetik farelerin epididimal yağ yastığı içine nakledildi. Isletler nakil alanından kurtuldu ve hiperglisemik durumu tersine çevirdi.

Diyabetik Farenin Epididimal Yağ Tabağında Iskelelerin İskele Destekli Nakli

Bir mouse adacıkları omental nakli için bir yöntem tanıttı. İzole adacıkları hidrojel ile karıştırılır ve karışımı bir diyabetik fare omental kese yerleştirilir. Daha sonra kan şekeri izlenir ve IMMUNO-histochemical çözümleme yapılır.

Adacık nakli için Mouse omentumun için bir yöntemi

Pankreas adacık nakli normoglycemia tip 1 diyabet için bir yoludur. Bu makale nakli tekniği normal glikoz düzeyleri diyabetik farelerde korumak için intraportal rota üzerinden üzerinde duruluyor.

İntraportal fare modeli pankreas adacıkları nakli

Biz transplantasyon için basit ve verimli bir yöntem sağlamak 2 '-deoxyguanosine bir çıplak fare renal kapsül içine e 18.5 timus tedavi. Bu yöntem, hem timik epitelyal hücreler fonksiyon ve T hücrelerinin olgunlaşma çalışmada Yardımcısı olmalıdır.

Çıplak farelerde 2 '-Deoxyguanosine tedavi Murine embriyonik Thymus renal subkapsüler nakli

Bu protokolde inguinal subkutan beyaz yağ dokusuna murine adacık izolasyonu ve transplantasyon yöntemi tanımlanmıştır. İzole syngeneic murine adacıkları bir murine alıcı içine bir bodrum membran hidrojel kullanılarak nakledilir. Alıcıların kan şekeri düzeyi izlenir ve adacık greftlerinin histoloji analizi yapılır.

Inguinal Subkutan Beyaz Yağ Dokusu (ISWAT) Transplantasyon Modeli Murine Adacıkları

İnsan kök hücresinden türetilen pankreas kök hücresi adacıklarının immunodefisive farelere in vivo implantasyon ve sonraki analizler için kas içi nakli için minimal invaziv bir protokol sunuyoruz.

Farelerde İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilen Pankreas Endokrin Hücrelerinin Intramusküler Nakli

Öğrenin fare pankreas adacık izolasyonu ve subkapsüler böbrek nakli yöntemini. Bu teknik tip 1 diyabet tedavisi için kan şekeri seviyelerini normale döndürmeye yardımcı olur.

Murin Islet İzolasyon ve subkapsüler Böbrek Nakli Bir Yöntem

Daha fazla video keşfet