Name: RNAi Efektör Bakteriyel Teslim Tarihi: Transkingdom RNAi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Keşfedin transkingdom RNAi yöntemiyle kanser hücrelerinde çoklu ilaç direncini tersine çevirme tekniğini. E. coli bakterileri kullanarak shRNA teslimi ve gen susturma stratejilerini öğrenin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

İş hibe no tarafından desteklenmiştir. &quot;Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF) 01GU0615.

1) shRNAs Bakteriyel Teslimat <ol><li> Bakteri kültürü ile başlamadan önce, bir LB-orta ve LB-agar hazırlamak zorundadır. </li><li> LB-orta maya özü (% 0.5 w / v), bacto Tripton (% 1.0 w / v) ve NaCl (% 0.6 w / v), tartmak ve aqua bidest bu bileşenleri sulandırmak için. Hazırlanan çözümler otoklavda sterilize olması ve sonra kullanıma hazır. </li><li> LB-agar plaklarına için bacto agar (% 1.5 w / v) sterilizasyon önceki LB-orta eklenecek. </li><li> LB-agar, mikrodalga, LB-agar tamamen eriyene kadar isitin. Şişe yandı almadan kolayca dokundu kadar çözüm soğumaya alalım. Daha ileri adımlar olumlu klonların seçimi için kanamisin (100 mg / ml) ekleyin. </li><li> LB-agar plakları 10 cm Petri kaplarına 20 ml LB-agar çözüm pipetleme laminer akış tezgah (steril koşullar) hazırlayın. Plakalar, sıvı katı hale gelene kadar soğumaya alalım. Plakalar, artık kullanıma hazır ve 4 ° C'de saklanabilir. </li><li> ShRNA-kodlaması ekspresyon vektörleri yetkili E. dönüştü. CaCl 2 yordamı kullanarak ısı şok coli ceq221. </li><li> Plaka 100 mcg / ml kanamisin içeren LB-agar plaklarına dönüştürülmüş bakteri, kapağını kapatın parafilm ile plakaları ve baş aşağı 37 ° yetiştirmek ° C, gece boyunca. </li><li> Diş çekme ile yetiştirilen koloniler seçerek olumlu klonları ile bakteriyel mini kültürleri inoküle edin. Diş, 100 mg / ml kanamisin ve ° C gece boyunca 200 rpm'de çalkalayıcı üzerinde 37 yetiştirmek içeren taze LB-orta 7,0 ml içine almak aktarın. </li><li> İnokülasyon 100 ml taze LB-orta, 37 ° C gece boyunca 200 rpm'de çalkalamalı üzerinde gece 1 litre Erlenmeyer şişesinin içinde bir mini kültür ve inkübe ile 100 mg / ml kanamisin 1:100 içeren </li><li> Tohum 25 x 10 4 6 başına insan mide kanseri hücreleri (EPG85-257RDB) (numaralı seribaşı hücrelerinin sayısına göre hücre hattı hücre büyüme hızına bağlı confluency ~ tohumlama 24 saat sonra% 70-80 olmalıdır) iyi yemekler ve bu inkübe 37 ° C,% 5 CO 2, gece boyunca su buharına doymuş atmosfer. </li><li> Kanser hücresi enfeksiyon Önceki gece tk RNAi vektör içeren E. kültürler üzerinde coli OD 600 belirlemek için bir fotometre ölçülür. 0.5 optik yoğunluk kadar bakteri çözeltinin (OD 600 = 0.5, 1.6 x 10 8 bakteri hücre / ml eşittir) ulaştı . </li><li> FCS-co-inkübasyon bakteriyel önceki 30 dakika orta karşı karsinom hücrelerinin FCS içeren hücre kültür ortamı değiştirin. </li><li> 1 x PBS ile iki kez bakteri yıkayın ve serum serbest Leibovitz L-15 orta sulandırmak. </li><li> Istenen İçişleri Bakanlığı 37 kanser hücreleri (bakteri hücrelerinin kanser hücre başına enfeksiyon çokluğu = sayı) ve co-inkübe bakteri ve 2 saat boyunca kanser hücreleri için seyreltilmiş bakteri ° C </li><li> Co-inkübasyon kanser hücrelerinin 2 saat 100 u / ml penisilin, 100 mcg / ml streptomisin, 2.5 mikrogram / ml amfoterisin, 150 mikrogram / ile desteklenmiş serum içeren Leibovitz L-15 orta bir kez 1x x PBS ile iki kez yıkanır ve sonra ml gentamisin ve 100 mg / ml kanamisin. </li><li> 37 kanser hücrelerinin yetiştirilmesi ° C,% 5 CO 2, su buharına doymuş atmosfer devam edin. </li><li> MRNA düzeyinde kantitatif gerçek zamanlı RT-PCR ile ölçülen floresan mikroskobu, bakteriyel tedavi etkileri ve protein düzeyi western blot analizi ile görüntülenebilmekte ve FACS analiz ve hücre proliferasyon deneyleri gibi fonksiyonel testleri ile gösterilir. (Isteniyorsa, bu işlemler ayrıntılı olarak tarif edilebilir). </li></ol> 2) Temsilcisi Sonuçlar Protokolü doğru yapılırsa, sonuçlar aşağıda gösterilen olanlar ile karşılaştırılabilir olmalıdır. Floresan mikroskopi Şekil 1 bakteriyel üç saat sonra bir insan mide kanseri hücre karşılaştırıldığında işlenmemiş bir hücre (b) (a) gösterir. Tedavi edilen hücre çekirdeğinin etrafında, bakteri tespit edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: Floresan mikroskobu (1:500) sonra bakteriyel İnsan mide kanseri hücre ve işlenmemiş bir insan mide kanseri hücre kontrolü, DAPI boyama, DAPI bandpass (Λem = 640 nm), 40x objektif. Kantitatif gerçek zamanlı RT-PCR Rakam 2 yaklaşık% 70 MDR1 mRNA down-regülasyonu (siyah ışın) tedavi bakteri ile tedavi sonrası görülebilir. Ebeveyn hücreleri MDR1 aşırı ekspresyonu eksikliği nedeniyle pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir. 257RDB P170 içeren hücre hattı plazmid bir anti-MDR1 shRNAs s olarak alınan diğer R transkingdom RNAi teknolojisi doğrudan karşılaştırma ifadeNAI stratejileri susturmak. Pozitif kontrol olarak tedavi edilmezse dayanıklı hücre hattı EPG85-257RDB eksprese MDR1, plazmid ifade shRNA eksik bakteri ile tedavi aynı hücre hattı ve bu hücre hattı taşıyan bir plazmid ifade anti-MRP2 shRNAs tedavi bakteri ile tedavi alındı. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: terapötik E. ile tedavi sonrası kantitatif gerçek zamanlı RT PCR MDR1 mRNA anti-MDR1 shRNAs (500 İçişleri Bakanlığı 1) ifade coli ceq221. Normalizasyon housekeeping gen aldolase kullanılarak yapıldı. Tedavi edilmezse hücrelerin hücre hattı EPG85-257RDB MDR1/aldolase oranı% 100 olarak belirlenmiştir. P-değerleri öğrencinin t-testi kullanılarak hesaplandı (* = p &lt;0.05, ** p = &lt;0.005, *** p &lt;0,001). Western Blot analizi Şekil 3 MDR1 aşağı yönetmelik bakteriyel tedavi sonrasında protein düzeyi de yer aldığını ortaya koyuyor. Bu ilaç duyarlı ebeveyn hücre hattı (EPG85-257P), tedavi edilmezse ilaca dirençli hücre hattı (EPG85 257RDB) MDR1 ifade ve tedavi örnek MDR1 ifade eksik MDR1 ifade gösterir. Bakteriyel tedavi hücrelerinin MDR1 down-regülasyonu, açık bir şekilde görülebilir. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3: Western blot analizi MDR1 ekspresyon düzeyleri tedavi edilmezse uyuşturucu duyarlı EPG85-257P, E. ile birlikte inkübasyondan sonra tedavi edilmezse ilaca dirençli EPG 257RDB ve EPG85-257RDB. coli ceq221 + P43 MDR1. İlköğretim Ab C219 1:100 ve anti-aktin 01:05 000, ikincil Ab anti-fare 1:10 000. Sitotoksisite tahlil Sitotoksisite testinde şekil 4'deki gibi Fonksiyonel analiz transkingdom RNAi işleyişi için de göstergeleridir. Ebeveyn hücre hattı ve Anıt-MDR1 shRNA plazmid ifade içeren hücre hattı daunorubisin için herhangi bir direnç görünmüyor. Dayanıklı hücre hattı EPG85-257RDB ve iki tane daha kontrol daunorubisin için yaklaşık% 90 oranında direnç tersine anti-MDR1 shRNA ifade bakteri ile tedavi örnek göre direnç önemli bir değişiklik görünmüyor. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4: Sitotoksisite tahlil. İlaç-özel hücrenin hayatta kalabilmek için bir sitotoksisite testinde tarafından belirlenir IC50 değerleri. P-değerleri öğrencinin t-testi kullanılarak hesaplandı (* = p &lt;0.05, ** p = &lt;0.005, *** p &lt;0,001). Antrasiklin birikimi tahlil Şekil 5 de gösterildiği gibi bakteriyel tedavi numunelerin mukavemet azaldığı (Şekil 4) göre, anti-MDR1 shRNA muamele edilen hücreler antrasiklin birikiminin yaklaşık% 90 oranında artmıştır. Ebeveyn hücre hattı ve hücre hattı 257RDB P170 güçlü bir daunorubisin birikimi% 100 gösteriyor. Dayanıklı varyant nadiren herhangi bir birikimi gösterir. Anti-MDR1 shRNA ifade bakteri ile tedavi edilen hücreler,% 90 bir anthracyline birikimi artış göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5: Antrasiklin birikimi tahlil. Antrasiklin flow sitometri ile ölçülen bakteriyel 6 gün sonra karsinom hücrelerinin birikimi. P-değerleri öğrencinin t-testi kullanılarak hesaplandı (* = p &lt;0.05, ** p = &lt;0.005, *** p &lt;0,001).

<ol><li>Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs+by+transkingdom+RNA+interference+modulates+the+classical+ABCB1-mediated+multidrug-resistant+phenotype+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells.</a> Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDR1%2FP-glycoprotein+%28ABCB1%29+as+target+for+RNA+interference-mediated+reversal+of+multidrug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance.</a> Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+cancer+multidrug+resistance%3A+a+still+unsolved+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+RNA+interference+in+drug-resistant+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Fut.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers.</a> Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).</li>
<li>Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transkingdom+RNA+interference+%28tkRNAi%29%3A+a+novel+method+to+induce+therapeutic+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing.</a> Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).</li>
<li>Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+classical+multidrug+resistance+%28MDR%29+phenotype+by+RNA+interference+%28RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi.</a> FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).</li>
<li>Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+and+complete+overcoming+of+MDR1%2FP-glycoprotein-mediated+multidrug+resistance+in+human+gastric+carcinoma+cells+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference.</a> Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).</li>
<li>Stein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+in+vivo+reversal+of+the+multidrug+resistance+%28MDR%29+phenotype+by+jet-injection+of+anti-MDR1+short+hairpin+RNA-encoding+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA.</a> Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).</li>
<li>Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA-expressing+bacteria+elicit+RNA+interference+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals.</a> Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).</li>
</ol>

Hücre sayısı enfeksiyonu numaralı seribaşı ve ilgili İçişleri Bakanlığı, kritik hücre hatları ve gözlem altında büyüme hızı bağlıdır. Tohumlama için en uygun hücre sayıları bulmak için, ön deneyler büyüme hızını belirlemek için önemle tavsiye edilir. Bunun yanı sıra, farklı Mois hücreleri stres ölmeden bakteri istilası durabiliriz hangi uzatmak nedeniyle sınırlı test edilmelidir. Gözlem altında gen aşağı düzenleme değişebilir zaman en iyi noktası. En uygun koşulları bulmak için zaman belirli bir süre içinde deneyler yap...

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Biochrom AG</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin B</td><td>Biochrom AG</td><td>A2612</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Fosfat Tamponlu Tuzlu Su-PBS (10 x)</td><td>Invitrogen GmbH</td><td>14080048</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; ceq221</td><td>Cequent Pharmaceuticals Inc.</td><td></td><td>Katalog mevcut değil, doğrudan sipariş</td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Biochrom AG</td><td>A2710</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Invitrogen GmbH</td><td></td><td>%0,85'lik tuzlu su içinde penisilin G (sodyum tuzu) ve streptomisin sülfat kullanılarak hazırlanmış ml başına 5.000 ünite penisilin (baz) ve 5.000 &amp;mu;g streptomisin (baz) içerir.</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Merck KgaA</td><td>1064060500</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Difco Laboratories</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Maya Ekstraktı</td><td>Difco Laboratories</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

rnai efektör bakteriyel teslim tarihi: transkingdom rnai

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA enterferans (RNAi) mRNA spesifik inhibisyonu için yüksek etkili bir mekanizma temsil eder. Yanı sıra, güçlü bir laboratuar aracı olarak potansiyel RNAi yolu terapötik kullanımı için umut verici görünüyor. RNAi RNA girişim (RNAi) tabanlı tedaviler, teslim geliştirilmesi için aracılık hedef hücreleri ajanların en büyük engellerden biridir. Bu engeli aşmak için yeni bir strateji transkingdom RNAi (Tk RNAi). Bu teknoloji üretmek ve tedavi kısa saç tokası RNA (shRNA) teslim RNAi neden hedef hücrelerine, patojen olmayan bakteriler, örneğin Escherichia coli kullanır. İlk nesil tk RNAi-aracılık vektörü, TURU, terapötik bir ilgi shRNA ifade düzenlenmesi için bakteriyofaj T7 organizatörü içerir. Ayrıca, TRIP doğal noninvaziv bakteri β1-integrin pozitif memeli listeriolysin O. Bu enzim üreten hücreleri ve Listeria monocytogenes HlyA gen, girmek için izin verir invasin kodlar Yersinia pseudotuberculosis Yat odağı, tedavi shRNA kaçmak sağlar giriş, hedef hücre sitoplazma içinde vezikül. TRIP yapıları shRNAs, T7 organizatörü odaklı sentezi için gerekli olan T7 RNA polimeraz kodlar yetkili bir patojen olmayan Escherichia coli suşu, içine tanıtıldı . Farklı RNAi stratejileri için iyi karakterize bir kanser ilişkili hedef molekülü ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Bu bir ilaç ekstrüzyon pompa ve aracılık &quot;klasik&quot; ABCB1-aracılı çoklu ilaç direnci (MDR) belirli bir çapraz direnç paterni ile karakterize olan insan kanser hücrelerinin fenotipi olarak ABC taşıyıcı davranır. Farklı ABCB1 ifade MDR kanser hücrelerinin anti-ABCB1 shRNA ifade vektör taşıyan E. ile tedavi edildi coli. Bu prosedür içinde RNAi yollarının kanser hücrelerinin aktivasyonu ve ABCB1 kodlama mRNA önemli bir down-regülasyonu yanı sıra ilgili ilaç ekstrüzyon pompa sonuçlandı. Buna göre, ilaç birikimi bozulmamış ilaca dirençli kanser hücrelerinin gelişmiş ve MDR fenotip tersine dönmüştür. Bu model sayesinde veri tk RNAi insan kanser hücreleri kanser ilişkili faktörler, örneğin ABCB1 modülasyonu için uygun olduğunu proof-of-concept sağlar.

RNA enterferans (RNAi) tabanlı tedaviler geliştirilmesi için, yeni bir strateji, transkingdom RNAi (tkRNAi) geliştirildi. Bu teknoloji üretmek ve hedef hücrelerine terapötik kısa saç tokası RNA (shRNA) teslim etmek için non-patojenik bakterilerin kullanır. Burada, tkRNAi klasik kanser hücrelerinin ABCB1 aracılı çoklu ilaç direnci (MDR) iptali için başarıyla uygulanmıştır.

RNAi Efektör Bakteriyel Teslim Tarihi: Transkingdom RNAi

RNA interferans (RNAi), mRNA ekspresyonunun spesifik inhibisyonu için oldukça etkili bir mekanizma teşkil eder. Güçlü bir laboratuvar aracı olma potansiyelinin yanı sıra...

Trans krallık RNA interferansı veya RNAi prosedüründe, bu protokolde hedef gen olan MDR1'e karşı kısa saç tokası RNA'ları (shRNA) veya RNA'lar kanser hücrelerine iletmek için bakteriler kullanılır ve amaç, hedef genin RNAi aracılığıyla susturulmasıdır. İlk olarak, E. coli bakterileri bir shRNA ekspresyon vektörü ile transforme edilir. Ardından, Beta 1 pozitif kanser hücreleri, ekimden 24 saat sonra konfluens %70 ila %80 olacak şekilde ekilir. Bir sonraki adımda, shRNA eksprese eden bakteriler ve hücreler iki saat boyunca birlikte inkübe edilir.Son olarak, kansa hücrelerinin antibiyotik tedavisi ile ortak inkübasyon sonlandırılır. Sonuçlar, gerçek zamanlı PCR, Western blot analizi, hücre proliferasyon deneyleri ve ilaç birikim deneyleri aracılığıyla, ilgilenilen genin mRNA protein ve fonksiyonel seviyelerde aşağıye düzenlendiğini (downregulation) göstermektedir. Bu tekniğin, siRNA transfeksiyonu veya oligo etkileri kullanımı gibi diğer standart prosedürlere göre temel avantajı, irna'nın hedef hücrelere etkili ve doğrudan iletilmesidir.Trans Kingdom RNAi veya TK RNAi teknolojisi, RNAi'yi indüklemek amacıyla hedef hücrelere terapötik kısa saç tokası RNA veya SHRNA üretmek ve iletmek için patojenik olmayan E. coli kullanır. Birinci nesil TK RNAi aracılı vektör veya trip, ilgilenilen terapötik bir SHRNA'nın ekspresyon düzenlemesi için bakteri fajı T7 promotörünü içerir. Ayrıca trip, doğal non-invaziv bakterilerin beta 1 integrin pozitif memeli hücrelerine girmesine izin veren invaziv proteinini kodlayan Yersinia pseudotuberculosis'ten gelen INV lokusunu içerir.Tripp ayrıca, listeria lysin O üreten listeria monocytogenes kaynaklı hli genini de içerir. Bu enzim, terapötik HRNA'nın hedef hücrenin sitoplazmasındaki giriş veziküllerinden kaçmasını sağlar. Trop konstrüktleri, T7 promoter güdümlü SH RNA sentezi için gerekli olan T7 RNA polimerazı kodlayan kompetan, patojenik olmayan esia coli suşuna aktarılır. Bakteriler ve ökaryotik hücreler birlikte inkübe edilerek bakterilerin ökaryotik hücrelere girmesi sağlanır.SH RNA'lar serbest bırakılır ve bir RNAi yoluna girer. Bu prosedüre başlamak için, bir gün öncesinden, beraberindeki yazılı protokolde açıklandığı şekilde, S-H-R-N-A ifade eden trip faktörü ile transform edilmiş bir e coli bakteri kültürünü gece boyu büyüterek hazırlayın. Bakterileri hedef hücrelerle inkübe etmek için, altı kuyucuklu kapların her bir kuyucuğuna 25 × 10⁴ insan gastrik karsinom hücresi ekleyin.Ekilen hücre sayısı, hücre hattının büyüme hızına bağlıdır; ekim zamanını, konfluensin 24 saat sonra yaklaşık %70 ila %80 olacak şekilde planlayın. Ekimden sonra, ekilen hücreleri 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren su buharı doygun bir atmosferde gece boyunca inkübe edin. Kanser hücresi enfeksiyonuna başlamadan önce, TK RNAi vektörü içeren e coli gece kültürlerinin optik yoğunluğunu ölçün.OD 600 değerini belirleyin ve bakteriyel solüsyonu, bakteriyel ko-inkübasyondan 30 dakika önce 0,5 optik yoğunluğa seyreltin; bu 30 dakikalık süre zarfında, karsinoma hücrelerinin FCS içeren kültür ortamını FCS içermeyen ortamla değiştirin. Bakterileri, 4 °C'de 4.000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüj ederek 1x PBS ile iki kez yıkayın ve serumsuz LB besiyerinde yeniden süspanse edin.Orijinal seyreltilmiş hacme kadar L 15 besiyeri ekleyin. Bakteriler yeniden süspanse edildikten ve hücreler 30 dakikalık inkübasyonlarını tamamladıktan sonra, bakterileri istenen enfeksiyon çokluğu (multiplicity of infection) veya MRI düzeyinde (1:300 ile 1:700 aralığında olmalıdır) kanser hücrelerine ekleyin. Bakterileri ve kanser hücrelerini %5 karbondioksit içeren, su buharı ile doyurulmuş bir atmosferde, 37 °C'de iki saat boyunca birlikte inkübe edin.İki saatlik ko-inkübasyonun ardından, kanser hücrelerini iki kez 1x PBS ile ve bir kez mililitrede 100 ünite Penisilin, litrede 100 mikrogram Streptomisin ve mililitrede 2,5 mikrogram içeren serum katkılı L 15 besiyeri ile yıkayın.Amfoterisin 150 µg/mL, gentamisin 100 µg/mL ve kanamisin eklenerek kanser hücreleri 37 °C'de, %5 CO2 içeren, su buharı ile doyurulmuş bir atmosferde kültüre edilmeye devam edilir. Bakteriyel tedavinin etkileri floresan mikroskobi ile görselleştirilebilir, mRNA düzeyinde kantitatif gerçek zamanlı RT-PCR ile ölçülebilir ve western blot analizi ile incelenebilir.Faks analizi ve hücre proliferasyon analizleri gibi fonksiyonel deneyler de kullanılabilir. Bu temsilci görüntü, insan gastrik karsinom hücrelerinin terapötik ekspresyon yapan bakterilerle inkübe edilmesinden üç saat sonra alınmıştır. Tedavi edilen hücrenin çekirdeği çevresinde S-H-R-N-A bakterileri tespit edilebilir.Bu deneyde, çoklu ilaç direnç geni MDR1'in ekspresyonundaki azalma, gerçek zamanlı PCR ile incelenmiştir. Terapötik bakteri tedavisi sonrası mdr1 mRNA'sında yaklaşık %70 oranında bir azalma gözlemlenebilir. Bakteriyel tedavi sonrası MDR1 ekspresyonundaki azalma protein düzeyinde de gerçekleşmiştir.Kontrol hücre hattı ile karşılaştırıldığında MDR one protein seviyeleri zamanla azalmıştır. Burada gösterilen sitotoksisite testi sonuçlarına dayalı fonksiyonel analiz, trans kingdom RNAi'nin işleyişi için bir gösterge olarak kullanılabilir; zira ilaç dirençli bir hücre hattı kanser ilacına yanıt vermez. Buna karşın, anti MDR one S-H-R-N-A eksprese eden bir plazmid ile transforme edilmiş bakterilerle enfekte edilen aynı hücre hattı ilaca karşı hassastır.Son olarak, bir antrasiklin birikim analizinde, kanserle dirençli hücre hattı çok az kanser ilacı birikimi göstermiştir; bu durum, MDR one SHRA ile işlem görmüş kanserle dirençli hücrelerde gözlemlenmiştir. Bu teknik, bu prosedür takip edilerek uygun şekilde uygulandığında 28 saat içinde tamamlanabilir. İlgilenilen gen üzerindeki düzenleyici etkiler gibi çeşitli soruları yanıtlamak için R-T-P-C-R gibi diğer teknikler uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, hRNA eksprese eden bakteriler ve pozitif memeli hücrelerini birlikte inkübe ederek trans-Kingdom RNA interferon uygulamasının nasıl yapılacağı hakkında iyi bir fikre sahip olmalısınız.

bacterial-delivery-of-rnai-effectors-transkingdom-rnai

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

RNA enterferans (RNAi) tabanlı gen demonte teknikleri Tribolium araştırma özünde vardır. Burada, biz Tribolium castaneum'ların bizim larva RNAi tekniğinin bir bakış sağlar. Larva RNAi araştırmacılar farklı bağlamlarda gen fonksiyonlarını incelemek için izin, kayıp fonksiyon-fenotiplerine hızlı erişim sağlayan basit, ama güçlü bir tekniktir.

Kırmızı Un Beetle Larva RNA Girişim, Tribolium castaneum

Bir M13 phagemid vektörü tarafından sağlanan dizi hedefli sRNA ekspresyon kasetlerini kullanarak büyüyen bir E. coli hücresi popülasyonunda gen ekspresyonunu yıkmak için bir yöntem açıklıyoruz.

Hedeflenen Srna faj aracılı teslim Gen İfade Knock Down için oluşturur<em&gt; E. E. coli</em

RNA girişimi (RNAi), gen fonksiyonunu ortaya çıkarmak için son derece değerli bir araçtır. Bununla birlikte, yetişkinlik öncesi aşamalarda RNAi kullanarak genleri hedefleme yeteneği, başlıca insan sıtma vektörü Anopheles gambiae'de sınırlıdır. Pupa gelişimi sırasında doğrudan enjeksiyon yoluyla gen fonksiyonunu azaltmak için bir RNAi protokolü tanımladık.

içine RNAi Tetik Teslimat<em&gt; Anofel gambiae</em&gt; Pupa

Burada, laboratuarda bir ara-germ böceği, Dermestes maculatus (D. maculatus) yetiştirme için protokolleri sunuyoruz. Biz de bu türün gen fonksiyonunu incelemek için embriyonik fenotipleri analiz etmek için embriyonik ve ebeveyn RNAi için protokolleri ve yöntemleri paylaşır.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı, Dermestes maculatus

Bu makalede damar doku bitkiler için RNA müdahale (RNAi) böcekler besleme phloem sap ile çift iplikçikli RNA (dsRNA) oral teslimat için geliştirilen roman tekniklerini gösterir.

Phloem ve Hemipteran böcekler bitki su besleme RNA müdahale ikna etmek için çift iplikçikli RNA Oral teslim yöntemleri

RNA paraziti, gen ekspresyonunu belirli gelişimsel evrelerde manipüle etmek için yaygın olarak uygulanabilir ve güçlü bir tekniktir. Burada, sudalış böceği Thermonectus marmoratusbu tekniğiuygulamak için gerekli adımları açıklar , gen dizilerinin edinimi gelen yapı veya davranışı etkileyen genlerin yıkılması.

Belirli Gelişimsel Zaman Noktalarında Gen İfadesi Manipüle Etmek Için Güçlü Bir Araç Olarak Su Böcekleri RNA Girişim

Küçük bir kodlamayan RNA micC'nin delesyon mutantını oluşturmak için λ-Kırmızı aracılı bir rekombinasyon sistemi kullanıldı.

Kodlamayan küçük RNA MicC, salmonella enteritidisteki dış zar proteinlerinde virülansa katkıda bulunur

Caenorhabditis elegans'ta rutin olarak kullanılan RNA girişimi (RNAi) için bir dağıtım yöntemi olan bakteriler tarafından üretilen dsRNA'nın oral yoldan uygulanması, burada yetişkin sivrisineklere başarıyla uygulanmıştır. Yöntemimiz, enjeksiyon kullanmadan sağlam ters genetik çalışmalarına ve iletimi engelleyen vektör çalışmalarına izin verir.

Yetişkin Anofeller gambiae Sivrisineklerine Etkili Oral RNA İnferferi (RNAi) Uygulaması

Ters genetik yaklaşımlar sivrisinek vektör patojenler için hangi genlerin altta ya direncini belirlemek için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu video protokolü Dimopoulos laboratuar tarafından dsRNA Anofel gambiae sivrisinekler, sıtma paraziti limanın içine enjekte etmek için kullanılan bir yöntem gösteriyor. Enjeksiyon kurulum ve toraks içine enjekte dsRNA manipüle tekniği gösterilmiştir.

Yetişkin Sivrisinekler (A. gambiae) RNAi Tahliller için protokol

Bu video, biz, bir roman minyatür gen tabancası ile canlı doku içine doğru bir Biyolistik reaktifler teslim için bir yordam gösterir. Ventral vücut duvarı ve tek segmentleri ganglionlar dsRNA molekülleri sunarak sülük embriyolar akson rehberlik molekül Netrin ifade aşağı vurma.

Lokalize RNAi ve Tıbbi Sülük Ektopik Gen İfadesi

Keşfedin transkingdom RNAi yöntemiyle kanser hücrelerinde çoklu ilaç direncini tersine çevirme tekniğini. E. coli bakterileri kullanarak shRNA teslimi ve gen susturma stratejilerini öğrenin.

RNAi Efektör Bakteriyel Teslim Tarihi: Transkingdom RNAi

Daha fazla video keşfet