In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

Aşağıdaki deneyin genel amacı, neokorteksteki nöronal progenitör hücrelerin spesifik alt kümelerinde genlerin yıkılmasının veya aşırı ekspresyonunun gelişimsel etkilerini incelemektir. Bu, neokortikal progenitör hücreleri transfekte etmek için DNA'nın sıçan embriyolarına in vivo elektroporasyonu ile elde edilir. İkinci adım olarak, transfekte edilmiş hücreler için zenginleştirme amacıyla elektroporasyonlu bölge diseke edilir.

Daha sonra, bu hücreler ayrışır ve oda slaytlarında kaplanır ve kültürlenir. Hem intrensek genetik alterasyonun hem de ekzojen faktörlerin uygulanmasının etkilerini incelemek için avision yazılımı kullanılarak yapılan kantitatif ölçümlere dayalı olarak nörit büyümesi ve dallanması üzerine etkiler gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Bu tekniğin, primer nöronal kültürlerin lipid bazlı transfeksiyonu gibi diğerlerine göre ana avantajı, nöronal progenitör hücrelerin spesifik alt kümelerini hedefleyebilmemizdir.

Örneğin, bu yöntem kullanılarak sadece glutamaterjik nöronlar transfekte edilecektir. Ek olarak, daha erken embriyonik aşamalarda elektro dua edebilir ve erken doğan daha derin katman nöronlarını hedefleyebiliriz veya gelişimin daha sonraki aşamalarında elektrolit yapabilir ve korteksin daha yüzeysel katmanlarına yönelik daha sonra doğan nöronları hedefleyebiliriz. Bu yöntem, nörogelişim alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Örneğin, içsel ve dışsal faktörler nöro büyümeyi ve dallanmayı etkilemek için nasıl etkileşime girer? Bu yöntem nöronal süreç büyümesi hakkında fikir verebilse de, sinaptogenez, hücre proliferasyonu ve sülfat tayini gibi diğer nörogelişimsel süreçlere de uygulanabilir. Ekteki metinde açıklandığı gibi bir enjeksiyon iğnesi hazırlayın.

Kabarcıklardan kaçınmak, iğneyi GFP'yi ifade eden DNA ile doldurun ve ilgilenilen gen hızlı yeşil içerir Enjeksiyonları görselleştirmek için, iğnede kalan boşluğu mısır yağı ile yükleyin. Enjeksiyonları kontrol etmek için yüklenen iğneye bir pico spritzer takın. Daha önce tarif edildiği gibi anestezi uygulanmış hamile bir sprey kapı faresinin uterus boynuzlarını açığa çıkarın.

Ve bu videoya eşlik eden metinde, E 15 embriyolarının enjeksiyonu burada gösterilmektedir. Embriyoları bir deveboynu lambası ile aydınlatarak enjeksiyon bölgesini tanımlayın. Başın nerede olduğunu bulmak ve orta hat süttürünü bulmak için bir embriyoyu nazikçe manipüle edin.

Lateral ventrikülü bulmak için bunu bir dönüm noktası olarak kullanın. DNA'yı rahim duvarından ve lateral ventriküle enjekte edin. DNA ile dolana kadar ventriküle birden fazla darbe enjekte edin.

Elektrotların yerleştirilmesiyle belirlenen vektör, neokorteksin hangi bölgesinin elektroporasyonlu olduğunu belirlemek için kritik öneme sahiptir. Burada pozitif elektrot, ön beynin bu bölgesini hedeflemek için beyin boyunca dorsal medial pozisyonların yakınına yerleştirilir. Elektrotların alternatif yerleştirilmesi, lateral kortikal akış da dahil olmak üzere korteksin diğer bölgelerini hedef alacaktır.

Her embriyoyu enjekte edin ve elektropore edin. Sırasıyla, rahim boynuzlarını vücut boşluğuna geri koyun ve kesiği kapatın. Hayvanları anesteziden iyileşirken izleyin.

Burada hayvanlar, elektroporasyondan 24 saat sonra kültür için hasat edilir, böylece GFP tespit edilebilir. Ötenazi yapılan sıçanın rahminden embriyoları çıkarın ve bunları bir lamina akış başlığında iki değerlikli katyon ile buz gibi soğuk HBSS ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin. Ve bir floresan diseksiyon mikroskobu altında, beş numaralı forseps kullanın.

Korteksleri incelemek için. Meninksleri çıkarmak için üç numaralı forseps numaralı dumont boyutunu kullanın, bir çift val makası kullanarak floresanı açın. Dokunun GFP pozitif bölgelerini kesin.

Bu parçaları, iki değerlikli katyon olmadan buz gibi HBSS ile doldurulmuş 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Tüpteki tüm GFP pozitif parçalarını toplayın. HBSS'yi tüpten çıkarın ve beş dakika boyunca 37 santigrat derece inversiyon inkübatörü ile hafifçe karıştırılan bir mililitre% 0.25 tripsin EDTA çözeltisi ile değiştirin.

Tripsin çözeltisini çıkarın. GFP pozitif doku miktarına bağlı olarak bir ila beş mililitre kaplama ortamı ile değiştirin. İki mililitrelik bir stripet pipeti kullanarak, hücreleri ayırmak için beş ila yedi kez yedim.

Hücreleri bir hemo sitometre kullanarak sayın, kaplama ortamı ile iki ila 3.5 kez, 1.5 mililitre orta plaka başına 10 ila beş hücre, bir CC iki kaplamalı odanın her odasında 1.5 mililitre konsantrasyona seyreltin. Kaydırak. Hücrelerin slaytlara yapışmasını sağlamak için hücreleri dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Aspire edilen kaplama ortamı, oda kültürü başına 1.5 mililitre nöronal ortama sahipti.

İmmüno boyamaya devam etmeden önce 37 santigrat derecedeki hücreler istenen aşamaya gelir. Nöronal süreç ölçümleri için. Büyüme zamanlama kültürü 24 saat ile yedi gün arasında değişir.

Bir davlumbazda, ortamı her kültür odasından aspire edin. Hücreleri 15 dakika boyunca% 4 formaldehit ile sabitleyin. Ekteki metinde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi kültürlerde görülen bloke ve immünodan önce bir kez PBS ile iki kez hızlı bir şekilde yıkayın, kültürleri floresan montaj ortamı ve bir kapak kayması ile monte edin.

Kültürleri floresan mikroskobu altında 20 x'te görselleştirin. Analiz için GFP pozitif nöronların görüntülerini kaydedin. Bu teknikle, elektroporasyonlu beyinlerin yaklaşık% 75'inin, dorsal medial korteks veya ventral lateral korteks olsun, korteksin istenen bölgesini hedeflediğini bulduk.

E 13 ila 14'te erken elektroporasyon bulduk, TBR gibi derin katman nöronlarını hedef aldık, bir pozitif katman altı nöron, daha sonra elektroporasyon hedef CT, IP, iki pozitif TBR, bir negatif katman, beş hücre, daha sonra elektroporasyon hedefi, BRN, iki pozitif katman, iki eğik çizgi, üç hücre. Burada, embriyonik 15.5 veya 17.5. günde elektropore edilen ve doğum sonrası beşinci günde hasat edilen beyinlerin koronal bölümlerini gösteriyoruz. Kültürde, A GFP pozitif olan hücrelerin yüzdesi, GFP pozitif bölgeyi diseke ederken ne kadar konservatif olduğunuza bağlı olarak geniş ölçüde değişebilir.

Bununla birlikte, çok muhafazakar olduğumuzda ve sadece GFP pozitif hücre yamasını incelediğimizde bile, gözlemlediğimiz en yüksek yüzde %5 ila %10'dur. Bu düşük transfeksiyon verimliliği, hangi işlemlerin analiz ettiğiniz elektroporasyonlu hücreye ait olduğunu belirlemede yardımcı olur. Hücrelerin bu yüksek yoğunlukta kaplanması, daha sağlıklı kültürlere sahip olunmasına katkıda bulunur. Bununla birlikte, GFP negatif hücrelerde hangi işlemin hangi hücre gövdesine ait olduğunu ayırt etmek zordur.

Bu prosedürü takiben, proliferasyon, sinaptogenez ve sülfat tayini ile ilgili soruları yanıtlamak için birkaç farklı belirteç için immün boyama yapılabilir. Bu prosedürü denerken, ustalaştıktan sonra kontaminasyonu ve enfeksiyonu önlemek için steril reaktifler ve aletler kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu tekniğin her yönü, uygun şekilde uygulanırsa iki ila üç saat içinde gerçekleştirilebilir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler. Deneylerinizde iyi şanslar.