Name: In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Öğrenin, in utero elektroporasyon yöntemiyle sıçan embriyolarında kortikal nöron öncü hücrelerinde gen fonksiyonunu nasıl inceleyeceğinizi. Bu teknik, nörit uzaması ve dallanması üzerindeki etkileri nicel olarak analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, yararlı tartışmalar için bu tekniği Joseph LoTurco ve Dennis Selkoe teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar, bu araştırma desteği için, Amerikan Sağlık Yardım Vakfı bağışçılar teşekkür ederim.

Utero elektroporasyon protokolün temel Kriegstein laboratuar 1, 2 vallahi başka bir makalede ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Bu teknik ilk Osumi laboratuar 3 açıklanan ve bizim protokol LoTurco laboratuar 4 geliştirilen bir dayanmaktadır. Biz protokol nöronal sürecin sonucudur gen fonksiyonu çalışma utero elektroporasyon geçerli olduğu bir açıklama ile takip en önemli ayrıntıları odaklanarak sıçan embriyoların utero elektroporasyon için protokol genel bir bakış, sağlayacaktır. 1 utero Elektroporasyon <ol><li> DNA ve yükleme iğneler hazırlanması Utero electroporations için ilk adım, DNA enjekte etmek istediğiniz yapıları belirlemek için denemenizi tasarlamak için . Bu yöntem hem misexpressing veya ilgi genleri aşağı vurma için yararlıdır. Misexpressing veya eksprese eden bir gen planlıyorsanız, nöronal prekürsör hücrelerinin aktif bir yararlanıcı kullandığınızdan emin olun. Biz tavuk beta-aktin organizatörü ve CMV arttırıcı 5 oluşur CAGGS organizatörü, tavsiye ederiz. Sadece küçük bir alt hücreleri utero elektroporasyon kullanarak transfekte yılından bu yana başarıyla electroporated bu hücrelerin takip edebilir, böylece bu gibi GFP olarak plazmid floresan protein kodlama için kritik öneme sahiptir. Plazmid kodlama GFP için, biz mikrolitrelik başına 0.5 mikrogram konsantrasyonda DNA hazırlanması önerilir. ShRNA yapıları için, biz verimli olarak mcL sonuçlar başına 0.5-1.0 mg ilgi gen yıkmak bulduk. Aşırı ekspresyonu veya misexpression için, genin boyutu ve deney için çağırdığı ifade düzeyine bağlı olarak, mikrolitrelik ortalama 1.0 ve 3.0 mikrogram arasında kullanılacak. DNA'lar bir Qiagen endotoksin ücretsiz hazırlık kiti kullanılarak hazırlanan ve 1 x PBS içinde seyreltilir. Biz, bu nedenle, enjeksiyon için 10 mcL DNA karışımı hazırlar hayvanların çöp embriyonik beyin başına yaklaşık 0.5-1.0 mcL enjekte. Enjekte edilen DNA takip böylece DNA Fast Green 1 mcL ekleyin. Doğru şekli iğneler çekilmesi önemli bir adım. Walantus ve ark. DNA sağlamak için farklı bir sistem kullanır ve böylece iğne hazırlık sonra bizim 1,2 slighly farklı. Iğne çekmek için kullandığınız ayarları, sizin sahip olduğunuz iğne çektirmenin marka bağlıdır. Biz David Kopf Model 750 kullanın. Kullandığımız ayarları: Isı 1: 9.0, Isı 2: 0, solenoid: 0, Filament boyutu 3.0 mm, Isıtıcı Yakınlık: 3 mm, Süre: 10 sn. Bir kez çekti, biz, ucu açılması büyük bir bölümü mesafenin 11 mm olduğu gibi ~ 45 derecelik açı bir jilet ile iğne kesti. Daha sonra iğne arka uç DNA yükleyin. Daha sonra mısır yağı ile iğne kalan boşluğu doldurmak. DNA enjeksiyon için, biz bir Picospritzer III kullanın. Her iğne için kesilir tam konik bağlı olarak, 4.0 'dan 6.0' a Picospritzer ayarlayın. Biz iğne DNA dışarı attıktan basınçlı hava sağlamak için bir ayak pedalı kullanır. </li><li> Ameliyat için hayvanların hazırlanması Biz sadece bu ameliyatlar için patojen free Sprague Dawley rat kullanın. Birkaç diğer laboratuvarları genotipleri de değişen fareler kullanın. Burada, biz E15 sıçan embriyoların elektroporasyon için protokol göstermek ancak in utero elektroporasyon E13 ve E18 yaşları arasında sıçan rutin olarak yapılır açıklanmaktadır. Erken evre elektroporasyon korteksin derin katmanları hedefleri olsa da, sonraki aşamada electroporations daha yüzeysel katmanları hedefliyoruz. Ameliyat başlamadan önce Hayvanlar buprenorfin bir ameliyat öncesi doz (0.05-0.1 mg / kg) verilmiştir. Hayvan anestezi için birden fazla seçenek vardır. Rutin intraperitoneal ketamin (40-80 mg / kg) ve xylazine (5-10 mg / kg) 1,2 Walantus ve ark. Isofuorane inhalasyon kullanır. Hayvanlar tamamen anestezisiz ve tepkisiz olmasını sağlamak için her zaman bir ayak tutam yapılmalıdır. Hayvanlar cerrahi işlem boyunca ısıtmalı pad üzerinde tutulur. Hayvan kürk kesi bölgesi traş ve iyot ile üç kez izledi etanol ile üç defa yıkanır. Kas bir kesi ile, orta hatta sadece yanal deride bir kesi yapılır. Rahim boynuzları çok dikkatli bir şekilde maruz kalmaktadır. Bunlar, parmaklarınızı kullanarak vücut boşluğuna hafifçe dışarı alay vardır. Dışarıdan vücut boşluğunda ise embriyolar steril PBS ile sulu tutun. </li><li> DNA enjekte ve elektroporasyon Bu cerrahisine ilk başladığınızda, en zor kısmı lateral ventriküller doldurmak böylece DNA enjekte gereken yere tanıdık olma, ve doğru bölgeyi vurmak için iğne enjekte etmek için ne kadar derin alışmak. Ident böylece Embriyolar hafifçe parmak uçlarınızla manipülenerede baş gösteren rakamları ve yakından bakarsanız, orta hat dikiş görmek mümkün olacak. Bu lateral ventrikül nerede olduğunu belirlemek için kullanabileceğiniz genel bir dönüm noktası olarak hizmet vermektedir. Biz rahim duvarı ve lateral ventrikül içine DNA enjekte edilir. Lateral ventrikül DNA / boya karışımı ile doludur kadar DNA birden fazla bakliyat yapılır - DNA enjeksiyon kontrol etmek için bir footpedal kullanın. Daha sonra embriyo kafasının iki tarafında kürek elektrotlar ve embriyo baş arasında nabız sunmak için başka bir footpedal kullanın. Elektrot yerleştirme korteksin hangi bölgede electroporated belirlenmesinde kritik önem taşımaktadır. DNA negatif yüklü olduğundan, DNA bir ücret kürekler boyunca ortadan pozitif elektrot doğru gidecek. Elektrotları tam yerleştirme bağlı olarak, hücrelerin farklı alt hedef olacaktır. Biz, beyin üzerinde dorsal medial pozisyonları yakın pozitif elektrot rutin olarak yerleştirin. Ancak, LoTurco laboratuar güzel, beyin daha fazla ventral lateral bölgelerde elektrotlar koyarsanız lateral kortikal akışı 6 kortikal-striatal sınır ve hit hücrelerinin hücreleri hedef olduğunu gösterdi. Her embriyo electroporated olabilir ve DNA yapıları farklı kombinasyonlar, her embriyo kullanılabilir. </li><li> Sütür ve post-operatif bakım Elektroporasyon ardından tüm embriyoların rahim boynuzları dikkatli bir şekilde vücut boşluğunda iade edilir ve kas tabakası ve cilt dikilir. Bu teknik, Walantus et al 1,2 ana hatlarıyla . Anestezi kurtarmak kadar Hayvanlar sürekli olarak izlenir ve analjezik buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg) her 8-12 saatte bir uygulanır. </li></ol> 2. Kültürleme Electroporated Kortikal nöronlar <ol><li> Electroporated beyinleri Hasat ve electroporated bölge diseksiyon Utero elektroporasyon aşağıdaki in vivo analizleri için, hayvanlar yetişkinlik doğum sonrası erken elektroporasyon aşağıdaki 24 saat herhangi bir zaman noktasında hasat edilebilir. Ancak, kültür birincil nöronlar E16 az elektroporasyon takip eden 24 saat hasat. Şu anda, electroporated embriyolar GFP saptanabilir düzeylerde ifade edilmektedir. Hayvanlar karbondioksit inhalasyon ve hızlı dekapitasyon kullanılarak ötenazi. Rahim Embriyolar disseke ve kalsiyum katyonları ile HBSS yerleştirilen embriyoların hangi DNA plazmid electroporated izlerini tutmak. Bu süzülmüş HBSS, steril tüpler ve levhaları ve diseksiyon için otoklavlanmış araçlar kullanmak için kritik öneme sahiptir. Korteks disseke ve meninksler bir başlık bir mikroskop kullanılarak kaldırıldı. Bu korteks sonra GFP görselleştirmek için kapasiteye sahip bir diseksiyon mikroskop altında görülmektedir. Korteksin GFP pozitif bölgeleri tespit ve ue korteks GFP pozitif bölgelerde kesip Vanna makası, bir çift vardır. Bu parçalar, 15 ml konik bir tüp içinde kalsiyum katyonları olmadan HBSS yerleştirilir. </li><li> Nöronlar Dissociating ve kaplama HBSS tüm GFP pozitif bölgelerde disseke sonra,% 0.25 tripsin ile değiştirilir ve 5 dakika boyunca 37 derece inkübe edilir. Tripsin, kaldırılır kaplama ortam (DMEM +% 5 FBS + Penn / strep + glutamin), ve hücreleri ayırmak triturated 5-7 kez değiştirilmelidir. Kullanılan Hacimler miktar doku mevcut üzerine bağlıdır. Disosiye hücreler daha sonra CC2 kaplı odasına slaytlar kaplanmıştır. Kaplama medya 1.5 mL hacmi iki oda slaytlar için, plaka odasına ortalama 200,000-350,000 hücreleri. 4 saat sonra, kaplama medya aspire edilir ve odasına Nöronal başına 1.5 ml kültür ortamı (Neurobasal medya + B27 takviyesi + glutamax + gentamisin) ile değiştirilir. </li></ol> 3. Nöronal Süreç Analizi akıbet <ol><li> Tespit ve immün kültürlerin Bu hücrelerin genetik manipülasyon kısa vadeli effecs ölçmek için, biz, üç gün sonra in vitro birincil nöronlar hasat . Birincil nöronlar ilave analizler için uzun kültür, medya yarısı her üç günde bir değiştirilmesi gerekmektedir. Kültürleri tespit odalarından medya aspirat ve 15 dakika için% 4 paraformaldhyde nöronlar düzeltmek. Ardından fiksasyon, hücreler PBS içinde iki kez yıkanır ve sonra engelleme solüsyonu (% 2 eşek serum% 0,1 Triton PBS X-100) bir saat koymak Hücreler daha sonra 1 saat süreyle primer antikor inkübe edilir. Nöronal sürecin sonucudur analizler için, nöronlar tanımlamak için anti-beta tubululin antikor - beta II tubulin immün neruonal hücre gövdesi, dendritler ve aksonlar etiketler. Hücreler daha sonra beş dakika süreyle PBS içinde üç defa yıkanır, sonra, DAPI çekirdekleri counterstaining ve montaj üç PBS yıkar takip, Cy3-anti fare 1 saat süreyle inkübe. </li><li> Ölçme neurite uzunluk GFP pozitif, beta-III tubulin pozitif nöronların Görüntüler Zeiss Axioskop MC100 kamera sistemi ile elde edilir. Birçok değişken neurites, dallanma, tüm neurites uzunluğu, en uzun neurite süresi de dahil olmak üzere bu GFP pozitif hücrelerin kontrol edilebilir, hücre soma boyutu, vb Biz yıkmak veya genlerin aşırı ekspresyonu üzerine nöronal bir süreci akıbet analiz etmek için bu yöntemi kullandık nöronal sürecinin uzunluğu odaklanarak, nörogelişimsel ve nörodejenerasyon ile ilgili. Nöronal süreçlerin sonucudur ölçmek için, biz Axiovision LE 4.4 yazılımı (Zeiss) kullanın. Bu yazılım kapsamında, "taslak" aracı seçmek için bir seçenek yoktur. Bu aracı kullanarak, her bir nöron sürecinin uzunluğu izlemek için bilgisayarınızın fareyi kullanabilirsiniz. Bu sizin neurites doğru bir önlem almak için kullanmakta olduğunuz amacı tanımlamak için kritik öneme sahiptir. Bu analizler için, genellikle bir 20x objektif kullanın. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Sprague Dawley çöp büyüklüğü 6 ve 14 embriyolar arasında değişmektedir bulduk. Biz genellikle tüm embriyoların electroporate. Her embriyo DNA'ların farklı bir kombinasyonu ile electroporated olabilir. Ancak, genellikle, dissociating ve kaplama önce aynı durum ve havuz bu beyinleri en az dört beyinleri electroporate. Biz bu tekniği ile yaklaşık% 75 electroporated beyinleri dorsal medial veya ventral lateral korteks (Şekil 1) olsun, korteks istenen bölgeye yönelik olduğunu bulduk. Buna ek olarak, E13-14 hedef Tbr1 olumlu katmanı VI nöronlar gibi derin katman nöronların erken electroporations bulundu, bir süre sonra electroporations pozitif hedef CTIP2, TBR1 negatif tabaka V hücreleri, ve hala daha sonra electroporations hedef Brn2 olumlu layer II / III hücreleri. Kortekste nöronal alt tipi özellikleri farklı belirleyicileri ve açıklama mükemmel bir açıklaması, Moleneaux ve ark 7 bir makale bulundu . Şekil 2'de, 15.5 veya 17.5 embriyonik gün ya electroporated ve postnatal 5. günde hasat beyinleri koronal bölümleri gösterir. Oct6 için immün kırmızı ile gösterilir. Hedef hücre tabakası popülasyonları onaylamak için kültür belirteçleri immunostain. Biz aynı çöp her embriyo hücrelerinin aynı hücre tabakası nüfusu hedef bekleyebilirsiniz bulduk (diğer bir deyişle, daha sonra diğer teknik varyasyonlar yerine embriyonik timepoint hedefleme bağlıdır). Kültür, pozitif GFP hücrelerinin yüzde yaygın GFP pozitif bölgesi (Şekil 3) dışarı Anatomi zaman ne kadar muhafazakar bağlı olarak değişebilir. Ancak, biz çok muhafazakâr ve hücrelerin sadece GFP pozitif yama, en yüksek oranda% 5-10 uymalarını teşrih bile electroporated korteks bölge diseksiyon olmasına rağmen, sadece tek bir katman hücre hedeflenmelidir. Bu düşük transfeksiyon effciency süreçleri analiz olduğunu electoporated hücreye ait olan belirlenmesinde yardımcı olur. Kaplama hücreleri bu yüksek yoğunlukta heathier kültürlerin katkıda bulunan, ancak, süreç ait olduğunu ayırt etmek zordur GFP negatif hücreler (Şekil 3) hücre gövdesi. Electroporated hücrelerin ince süreçlerin görülmeye sorun varsa, (Invitrogen gelen ya GFP ifade artırmak için electroporating GFP DNA konsantrasyonu artırabilir, ya da bir anti-GFP antikor kullanarak ayrışmış hücreleri immunostain ) Cy2 ikincil antikor ile birlikte. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 E15.5 Sprague-Dawley rat plazmid GFP ile electroporated ve üç gün sonra hasat edildi. Elektrot yerleştirme dayanarak, korteksin farklı bölgelerinde hedefleniyor. AF show GFP floresan bütün beyinlerinde. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. E15.5 (A) veya E17.5 (B) Sprague-Dawley sıçan GFP postnatal 5. günde plazmid ve hasat ile electroporated edildi. Brain kesitli, koronal bir vibratome (100 mikron bölümleri) kullanarak sabit ve Oct6 (kırmızı) ile immunohistokimyasal edildi. A ve B ile immunohistokimyasal bölümden konfokal görüntüleri göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 E15.5 Sprague-Dawley sıçan plazmid GFP ile electroporated. Elektroporasyon takiben 24 saat, beyin hasat ve GFP-pozitif, electroporated bölgelerinde video açıklandığı gibi, disseke ve ayrışmış edildi. In vitro olarak 3 gün sonra, hücreler sabit ve immunohistokimyasal BIII-tubulin (kırmızı) ve çekirdekleri DAPI (mavi) (A, C) ile boyama. Uzun neurite uzunluğu Axiovision yazılımı kullanılarak ölçüldü(B, D).

<ol><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).</li>
<li>Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).</li>
<li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).</li>
<li>Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+DCX+and+LIS1+in+migration+through+the+lateral+cortical+stream+of+developing+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain.</a> Dev Neurosci. , 144-156 (2008).</li>
<li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).</li>
<li>Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Function+for+-Amyloid+Precursor+Protein+in+Neuronal+Migration+Revealed+by+In+Utero+RNA+Interference%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference.</a> J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).</li>
<li>Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+APP+regulates+the+function+of+full-length+APP+in+neurite+outgrowth+through+interaction+with+integrin+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Develop%22%5BJournal%5D)">Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1.</a> Neural Develop. 3, 15-15 (2008).</li>
</ol>

Primer nöronal kültürlerin in vitro çalışmada neurite akıbet kantitatif analizler için izin verir . Genetik değişiklikler nöronal sürecin sonucudur nasıl etkilediğini araştırmak için, shRNA ya da misexpression yapıları kimyasal transfeksiyon veya viral transdüksiyon yoluyla birincil nöron içine sokulabilir. Ancak, birincil kortikal hücreler ile, hücre tipleri (farklı katmanları, inhibitör nöronlar, glial hücreler glutamaterjik nöronlar) heterojen bir havuz, bu yöntemleri kullanarak transfekte vardır. Utero<...

<table><tbody><tr><td>10X Hanks&amp;rsquo; Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) (Ca&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; /Mg &lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; içermeyen)</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>10X Hanks&amp;rsquo; Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) (Ca&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; /Mg &lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; içeren)</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES pH 7.4</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri Kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm Petri Kapları</td><td>BD Biosciences</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik tüp</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>62-547-205</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüp</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>62-554-205</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Standart Pens</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli Pens</td><td>Fine Science Tools</td><td>11273-20</td><td></td></tr><tr><td>İnce Pens</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas yaylı makas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>.25% Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Bright-Line Hemositometre</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>El Tipi Sayıcı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z169021</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modifiye Eagle Ortamı (D-MEM)</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td>11960-051</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>NEUROBASAL Ortamı</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Serumsuz Suplement</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX -I Suplement</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin Reaktif Çözeltisi</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Serumu</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>beta-III tubulin antikoru</td><td>Chemicon International</td><td>MAB1637</td><td></td></tr><tr><td>MAP2 antikoru</td><td>Chemicon International</td><td>AB15452</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Cy3 anti-mouse</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-166-151</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Cy2 anti-chicken</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-226-155</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>CC2 Kaplı İki Odacıklı Lamlar</td><td>Lab-Tek</td><td>154852</td><td></td></tr><tr><td>Florasan Kapatma Ortamı</td><td>KPL Inc</td><td>71-00-16</td><td></td></tr><tr><td>24 x 60 mm Mikro Lam Kapak Camları</td><td>VWR international</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf oje</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>buprenorfin</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTX kare dalga elektroporatör</td><td>Fisher Scientific</td><td>BTXECM830</td><td></td></tr><tr><td>Tweezertrodes, 7 mm, platin</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450488</td><td></td></tr></tbody></table>

in utero elektroporasyon kortikal nöronlar altküme gen fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim nöronal kültür takip

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

Primer nöronal kültürlerin in vitro çalışmada, kantitatif analizler için neurite akıbet sağlar . Genetik değişiklikler nöronal sürecin sonucudur, shRNA veya cDNA yapıları kimyasal transfeksiyon veya viral transdüksiyon yoluyla birincil nöron içine sokulabilir nasıl etkilediğini araştırmak için. Ancak, birincil kortikal hücreler ile, hücre tipleri (farklı katmanları, inhibitör nöronlar, glial hücreler glutamaterjik nöronlar) heterojen bir havuz, bu yöntemleri kullanarak transfekte vardır. Utero elektroporasyon embriyonik kemirgen korteks DNA yapıları tanıtmak için kullanılması hedeflenen hücreleri belirli altkümelerini sağlar: elektroporasyon korteksin erken embriyonik korteks hedefleri derin katmanları, geç embriyonik timepoints az elektroporasyon daha yüzeysel katmanları hedefleri. Ayrıca, dorsal karşı ventral-lateral medial korteks bölgelerinin hedef bireysel embriyolar sonuçları başkanları arasında elektrot diferansiyel yerleştirme. Elektroporasyon ardından, transfekte hücreler, disseke ayrışmış, ve neurite akıbet kantitatif analiz için in vitro kaplı olabilir. Burada, kortikal hücrelerin altkümelerini nöronal sürecin sonucudur kantitatif ölçmek için bir adım-adım yöntemi sağlar. Utero elektroporasyon protokolün temel Kriegstein laboratuar 1, 2, diğer iki vallahi makalelerde detaylı olarak tarif edilmiştir . Biz en önemli ayrıntıları odaklanarak nöronal sürecin sonucudur gen fonksiyonu çalışmaya utero elektroporasyon geçerlidir protokolün bir açıklama ile takip utero elektroporasyon için protokol genel bir bakış, sağlayacaktır.

Utero elektroporasyon nöronal progenitör hücrelerinin in vivo transfecting için değerli bir yöntemdir. Elektrotlar ve elektroporasyon gelişimsel timepoint yerleştirme bağlı kortikal hücrelerin bazı altkümelerini hedeflenebilir. Hedeflenen hücreler daha sonra in vivo veya in vitro genetik değişiminin etkileri analiz edilebilir.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

Primer nöronal kültürlerin in vitro çalışması, nörit çıkışının kantitatif analizlerine olanak tanır. Genetik değişikliklerin ... nasıl etkilediğini incelemek için

Aşağıdaki deneyin genel amacı, neokorteksteki nöronal öncül hücrelerin belirli alt kümelerinde genlerin susturulmasının (knockdown) veya aşırı ifade edilmesinin (overexpression) gelişimsel etkilerini incelemektir. Bu, neokortikal öncül hücreleri transfect etmek amacıyla rat embriyolarına in vivo DNA elektroporasyonu yapılarak gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, transfect edilmiş hücreleri zenginleştirmek için elektropore edilmiş bölge diseke edilir.Ardından, bu hücreler disosiye edilir, kamaralı lamlara ekilir ve kültüre edilir. Hem intrinsik genetik değişikliğin hem de eksojen faktörlerin uygulamasının etkilerini incelemek amacıyla, avision yazılımı kullanılarak yapılan kantitatif ölçümlere dayalı olarak nörit büyümesi ve dallanması üzerindeki etkileri gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Bu tekniğin, primer nöronal kültürlerin lipid bazlı transfeksiyonu gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, nöronal progenitör hücrelerin spesifik alt kümelerini hedefleyebilmemizdir.Örneğin, bu yöntem kullanılarak sadece glutamaterjik nöronlar transfekte edilecektir. Ek olarak, daha erken embriyonik evrelerde elektrospray uygulayarak erken doğan derin tabaka nöronlarını hedefleyebiliriz ve

in-utero-electroporation-followed-primary-neuronal-culture-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

E15 Fare Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

Bu protokol, elektroporasyon ve kültür fare ve kortikal hipokampal nöronlar aracılığıyla transfect incelemek için gerekli adımları özetliyor. Kısa vadeli kültürleri, uzun vadeli kültürler sinaptogenez ve dendritik omurga analiz çalışmaları için kullanılabilir akson akıbet ve rehberlik çalışmaları için kullanılıyor olabilir.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Serebral kortekse bir gelişme genlerin işlevine hızlı bir değerlendirme yapmak için, ilgili yöntemler...

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

Bu protokol içerir geliştirilmiş bir eksplant yordam...

Eski utero Elektroporasyon ve Tüm Yarımküre Eksplantlarından: Erken Kortikal Kalkınma Çalışmaları İçin Basit Bir Deney Yöntemi

Bu prosedür, in utero elektroporasyon yoluyla gelişmekte olan fare ön beynindeki internöronların nasıl hedefleneceğini gösterir. Bu teknik, korteksin yüzeysel katmanlarına yönelik internöron alt tiplerinde seçici gen ekspresyonu elde etmek için özellikle etkiliydi.

Kortikal internöronlar alt tip-selektif Elektroporasyon

Bu yazının tek hücre düzeyinde ve floresan etiketli nöronların eksitabilite nöronların yapısal bağlantı tanımlamak için utero elektroporasyon (İEÜ) kullanmak protokolleri sağlar. Histoloji dendritik ve aksonal projeksiyonlar karakterize etmek için kullanılır. Akut dilim tam hücreli kayıt eksitabilitesini araştırmak için kullanılır.

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Uteros elektroporasyonda çift mekansal ve zamansal olarak ayrılmış hücre popülasyonları hedefleme sağlar. Bu teknik, bu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimleri normal koşullarda floresan proteinler ihsallaştırmak için değil, aynı zamanda fonksiyonel deneylerden sonra ilgi genlerini tedirgin etmek için görselleştirmek için yararlıdır.

Geçici ve Mekansal Olarak Ayrılmış Hücre Popülasyonlarını Hedef lemek için Utero Elektroporasyonunda Çift

Öğrenin, in utero elektroporasyon yöntemiyle sıçan embriyolarında kortikal nöron öncü hücrelerinde gen fonksiyonunu nasıl inceleyeceğinizi. Bu teknik, nörit uzaması ve dallanması üzerindeki etkileri nicel olarak analiz etmenizi sağlar.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

Daha fazla video keşfet