Name: Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Öğrenin fare retinasından karanlık adaptasyonlu dilimler hazırlayarak elektrofizyolojik kayıtlar yapma yöntemini. Patch kelepçe tekniği ile ışık uyarımına yanıtları inceleyin ve görsel sinirbiliminde retinal sinyal yollarını keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, Hibe EY17606 (APS) tarafından desteklenmiştir.

1. Hazırlanması Elektrotlar <ol><li> 1M NaCl hem daldırma ve aralarında sürüş 15V ~ 20 sn için 1 Hz sinüs dalga kullanarak kayıt ve referans elektrotlar hazırlayın </li><li> Mikropipet çektirmesi (Sutter Aletleri P-97) kullanarak kayıt elektrotları olun. Patch-pipetler, dış çapı 1.2 mm ve iç çapı 0.69 mm (Sutter Instruments, Kedi # B120-69-10) bir ile borosilikat cam kullanın. Elektrodun ucu ile seri direnci ölçün. M ~ 12 ~ 5 hücreli organları için M ~ (5) mm çaplı kullanımının cep organları için ~ 20 mm çaplı kullanımı yapısı bir pipet ucu çapı seçin hedef hücrelerin büyüklüğüne göre. </li><li> / Referans elektrot zemin hazırlayın. 1M NaCl; bir şırınga kullanarak (Cat # A7002 Sigma),% 3.5 Agar 1 mM NaCl ile küçük bir bölümü polietilen boru (Intramedic PE205) doldurmak. Ag / AgCl referans elektrot üzerinden bu agar köprüsü yerleştirin. </li></ol> 2. Hazırlanması Çözümler <ol><li> Harici banyo çözümü, Ames Bikarbonat (1 L) içeren medya: Ames 1 şişe 'Orta (Sigma; Kedi # A1420), 1,9 g NaHCO 3, Penisilin-Streptomisin 7 mL (Sigma; Kedi # P0781) bakteriyel önlemek için büyüme. ~ 280 mOsm ozmolarite ayarlayın. </li><li> Çözüm Dilimleme Ames pH tampon Hepes (1 L) içeren ortam: 1 şişe Ames 'Orta, 0.887 g NaCl, 2.38 g Hepes, 7 ml Penisilin-Streptomisin. 1M NaOH ve / veya 1M HCl ~ 7.4 pH ayarlayın. ~ 280 mOsm ozmolarite ayarlayın. </li><li> Potasyum Aspartat (K-Asp) pipetle iç çözeltisi (mM): 125 K-Aspartat, 10 KCl, 10 Hepes, 5 NMG HEDTA, 0.5 CaCl 1, 2 ATP-Mg, 0.2 GTP-Mg; pH ayarlanır. ~ 7.3 NMG-OH ve ozmolarite ~ 280 mOsm ayarlanır. </li><li> Retina içeren jelleşme sıcaklığı düşük agaroz (ağırlıkça% 5), 7.5 g Agar (Sigma; Cat # A7002) stabilize Agar döndürmez kilit dH 2 O, 150 mL erimiş </li></ol> 3. Deney günü <ol><li> Çözülme ~ 1.5 ml K-Asp İç Çözüm ve dondurucu seçtiğiniz fluorofor. Ampirik olarak tespit edilmelidir uygun konsantrasyon, fluorofor sulandırınız. </li><li> Ames (30-32 ° C) su banyosu içine ışık geçirmez saklama kabı ve yerine içine NaHCO 3 (~ 200 ml) içeren medya dökün ve% 5 CO 2 /% 95 O 2 gaz dengelenmesi </li><li> Ames 'medya Hepes yer buz içeren yaklaşık 110 mL şişe doldurun ve% 100 O 2 ile dengelenmesi. </li><li> Faraday kafesinin üstüne ısıtılmış bir rezervuar NaHCO 3 içeren diğer Ames 'medya yerleştirin ve% 5 CO 2 /% 95 O 2 gazı ile dengelenmesi. Parafilm çözüm yukarıdaki boşluk gaz yakalamak için kullanılabilir. </li><li> Jelleşme sıcaklığı düşük agaroz (% 3); (Cat # A0701 Sigma) 0.75 g, Hepes ve ısı ~ 115 ° C agaroz eritmek için çözüm ile Ames 'medya 25 ml ekleyerek hazırlayın. Kabarcıkları olmadan net, bir su banyosu ve mağaza çözümü kadar karıştırın (~ 42 ° C). </li><li> K-Asp iç solüsyonu ile doldurun ve bir kayıt pipet ucu direnci kontrol edin. </li></ol> 4. Deney başlayın <ol><li> Fare Euthanize ve hızlı bir şekilde gözler kavisli makas kullanarak kaldırın. Kızılötesi gözlük görsel pigment beyazlatma önlemek için tüm işlemleri için kullanılmalıdır. </li><li> Forseps ile göz tutarken gözleri filtre kağıdı, haddeleme, ve ince bir çift taraflı bıçak kullanarak onları önlemek için bir parça yerleştirin, kornea bir yarık. </li><li> Göz küresi delinmiş olduğu gibi, bunlar göz Ames 'medya ile dolu bir çanak içine aktarın. </li><li> Bir giriş noktası olarak kornea yarık, küçük bir makas, kornea, lens ve vitreus silinebilir sonra geri kalan kısımları kesip kullanılır. Retina Göz yuvası takılı kalır ve 32 karanlıkta Göz yuvası saklamak ° C,% 5 CO 2 /% 95 O 2 ile dengelenmiş Ames medya dikkatli olun. </li></ol> 5. Dilimleme <ol><li> GÖZ KAPAKLARI Hemisect retina ve retina pigment epiteli ayrıştırmaları. Doku düz yalan izin retinanın kenarlarını çıkarın. </li><li> Erimiş agar ile 35 mm Petri kabı doldurmak için küçük bir bardak Pasteur pipeti lateks bir ampul kullanın ve tutarlılığını test etmek için forseps agar yoluyla boyunca sürükleyin. </li><li> Agar katılaşmaya başlar. <ol class="lalpha"><li> Agar üst retina aktarın. </li><li> Retina çevresinde aşırı bir çözüm emmek için çarpık bir Kimwipe parçası kullanın. </li><li> Yeri 2-3 Agar doğrudan retinanın üzerine düşer ve hızlı bir şekilde etrafına bir duvar oluşturmak için retina üzerinde plastik bir silindir. Agar içinde retinanın merkezleme Sonra plastik silindir tarafı aşağı ek erimiş agar damla. </li><li> Petri kabı t transfero serin bir buzlu su banyosu. </li></ol></li><li> ~ 45 saniye buzlu su banyosu doku kaldırmak ve agar retinanın en uzak tarafında iterek, plastik silindir bloğu a'ya bir dalgıç kullandıktan sonra. </li><li> Agar içeren retinanın küçük bir blok kesme ve numune disk agar Geri döndürmez kilit karşı blok superglue tek taraflı jileti kullanın. </li><li> Titreşimli mikrotom tepsi örnek diske aktarın ve buz Ames Hepes retina ile blok tam olarak temas etmesini sağlayan tepsiye dökün. </li><li> Retina dilim ~ 200 mikron kalınlığında kesilmiş ve maksimum bıçak titreşimli hızında ileri bir bıçak hızı retina her dilim kesmek için 4 ila 5 saniye sürer gibi ayarlanabilir. </li><li> No: 11 neşter bıçak, her bir seferde kullanılabilir dilim kaldırmak için kullanın. </li><li> İyi dilimleri içeren retina kayıt odaları yerleştirilir ve onları geçiş naylon konuları dilim çapa ile ağırlıklı. Naylon konuları kayıtlar için engelsiz retina bırakarak, retina çevreleyen agar basılı tutun. </li><li> Sahneye dik mikroskop Transfer kayıt odası, perde kapatmak ve hassas bir kızılötesi kamera dilim görüntülemek için kızılötesi ışık kaynağı açın. </li></ol> 6. Kayıt <ol><li> Bir iyi bir retina dilim (sağlam fotoreseptör ve uygun kesme açısı ile) hızında retina perfüze başlamak tanımlanan 35 37 ısıtılır ısıtılır Ames 'medya ile daha fazla 5 ml / dak ° C ve% 5 CO 2 ile dengelenmiş /% 95 O 2. </li><li> Bazı yüzeyine zarar dilimleme işlemi nedeniyle ortaya çıkabilir. Bu genellikle ince bir tabaka hücreleri kırık bir ucu ile bir pipet kullanarak kaldırılır ve nazikçe ölü hücre gövdeleri uzak emme olabilir. Bu genellikle canlı hücreler altında ortaya koyacaktır. Pozisyonu ilgi katmanlarda bulunan sağlıklı bir hücre gövdesi belirleyin. </li><li> Mikropipet KAsp iç solüsyonu ile doldurun ve pipet ucu ile pozitif (dışa doğru) basınç uygular ve bir micromanipulator kullanarak hücre düzeyine kayıt odasına pipet ucu düşük. </li><li> Hücre zarı gamzeler gibi pipet hareket ettirin ve yüksek bir direnç mühür yapmak için nazik negatif (içe) basınç uygulayın. Tüm hücre modunda hücre içine kırmak için elektrot negatif basınç uygulayarak elde edilebilir. </li><li> LED'leri kullanarak retina dokusunun Uyarıcı ışık tepkiler uyandırabilir. </li><li> Pipetle iç çözüm fluorofor floresan çağrıştıran kayıt yapıldığı hücre Fotoğraf. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Burada, karanlık bir adapte artan gücü ışık çakmaları retina nöron gösterilmiştir potansiyelleri ışık uyarılmış. <img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 florofor Lucifer Sarı hücreleri ile dolu olduğu bir retina dilim Floresan resim. Uyarılmış floresan yama kayıtları yapıldığı hücrelerinin morfolojisi gösterir.

<ol><li>Weblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> J Physiol. 280, 449-470 (1978).</li>
<li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connections+among+retina+neurons+in+living+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Synaptic connections among retina neurons in living slices.</a> J Neurosci Methods. 20, 139-149 (1987).</li>
<li>Rieke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+contrast+adaptation+in+salamander+bipolar+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal contrast adaptation in salamander bipolar cell.</a> J Neurosci. 21, 9445-9454 (2001).</li>
<li>Armstrong-Gold, C., &amp, R. ieke, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bandpass+filtering+at+the+rod+to+second-order+cell+synapse+in+salamander+%28Ambystoma+tigrinum%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bandpass filtering at the rod to second-order cell synapse in salamander (Ambystoma tigrinum) retina.</a> J Neurosci. 23, 3796-3806 (2003).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li>
<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
</ol>

Omurgalı retina Dilim kayıt onlarca yıl 1,2 için yapılmış ve retina devre olay ışık kodlar nasıl daha derin bir anlayış sağlama konusunda oldukça başarılı olmuştur. Titreşen bir mikrotom kesim yerine doğrudan daha bir jilet ile avantajları, retina dilimler yüzeyinde daha az hasar tabi ki. Emme pipet ile sadece hücre tipleri en çok 5,6 tespit edilmiştir retina devre, bağlantı korumak yüzeyinin altında bu hasar ve hedef sağlıklı hücreleri çıkarmak için kolay ve bu görüntü sağlam yanıtları ışık. Bu ne...

<table><tbody><tr><td>Mikropipet çekici</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen tüp</td><td>Intramedic</td><td>PE205</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002</td><td></td></tr><tr><td>Düşük jelleşme sıcaklıklı agaroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td></td></tr><tr><td>Ames&amp;rsquo; Ortamı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr></tbody></table>

patch kelepçe bir karanlık adapte dilim hazırlık fare retina nöronlar kayıtlar

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Bizim görsel deneyim retinal fotoreseptör görsel pigment fotonlar, ışık enerjisini emer ve hücre zarı siklik nükleotid kapılı kanallar kapatılmasına yol açan hücre içi olaylar zincirini başlatır zaman başlatılır. Membran potansiyeli ortaya çıkan değişiklik çubuk ve koni sinaptik terminalleri hem de nörotransmitter serbest miktarda azalma sırayla açar. Fotoreseptör membran potansiyeli ışık uyarılmış değişiklik retinada aşağı aktiviteye yol açar nasıl ölçmek için, bilim adamları onlarca yıl 1,2 retina dilim hazırlıkları elektrofizyolojik kayıtlar yaptık. Geçmişte bu dilimleri elle filtre kağıdı bağlı retina dokusunun bir jiletle kesilmiş; son yıllarda dilimleme başka bir yöntem, retina dokusunun düşük jelleşme sıcaklığı agar sayede gömülü geliştirilmiştir ve soğuk çözüm dilimlenmiş mikrotom titreşimli 3,4. Bu preparat ile retina dilimleri daha az yüzey hasarı ve çok sağlam bir ışık uyarılmış yanıtlar üretir. Burada bu yordamı görsel pigment beyazlatma önlemek için kızıl ötesi ışık altında nasıl yapılacağı belge.

İşte biz elektrofizyolojik kayıtlar için fare retina karanlık adapte dilim üretmek için bir prosedür açıklanmaktadır.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Görsel deneyimimiz, retinal fotoreseptörlerimizdeki görsel pigmentin ışık enerjisi fotonlarını absorbe etmesi ve bir ... kaskadını başlatmasıyla başlar.

Görsel deneyimimiz, retinal fotoreseptörlerimizdeki görsel pigmentin ışık enerjisi fotonlarını absorbe etmesiyle başlar ve bu durum nihayetinde hücre membranındaki siklik nükleotid kapılı kanalların kapanmasına yol açar. Bu durum, hem çomaklar hem de koniler tarafından nörotransmitter glutamat salınımını baskılar. Salınan glutamat, alt sinyalleri incelemek amacıyla alt retinal hücreler tarafından algılanır.Ötanazi uygulanmış bir fareden gözler çıkarılır. S'ler izole edilir, bir agar bloğuna gömülür ve titreşimli bir mikrotom kullanılarak dilimlenir. Ardından, retinal dilimler bir mikroskobun altına yerleştirilir ve LED aydınlatma ile uyarılır.Senerjik akımları veya potansiyelleri ölçmek için patch clamp kayıtları alınırken, bu yönteme yeni başlayan kişiler genellikle karanlıkta çalışmanın getirdiği ek zorluklar nedeniyle sorun yaşarlar. Bu nedenle, tüm sürecin görselleştirilebilmesi, aksi takdirde tarif edilmesi zor olan bir deneyim ve aşinalık sağlayacaktır.Bu prosedüre, kullanılacak kayıt ve referans tel elektrotlarını bir gümüş klorür tabakasıyla kaplayarak başlayın. Elektrotları bir molar sodyum klorür içine daldırın. Ardından, bir hertz sinüs dalgası sürücüsüne sahip 15 voltlu

patch-clamp-recordings-from-mouse-retinal-neurons-dark-adapted-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video su kaplan semender retina dilim tam hücreli gerilim kelepçe kayıtları süreci gösterir. Biz yanı sıra retinanın görsel uyarılma sırasında yama kelepçe kayıtları gerçekleştirmek için nasıl dilim hazırlık göstermektedir.

Işık tam hücreli Kayıtlar Retina Dilim Uyarıcı Synaptic Akımlar Uyarılmış

Bu makale, fare izole retinal hazırlanması incelemek ve kaydetmek için nasıl bir açıklama sağlar. Özellikle, floresan etiketli ganglion hücre popülasyonu ışık yanıtlarını kaydetmek ve daha sonra belirlemek ve morfolojisi analiz nasıl açıklar.

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

Burada elektrofizyoloji ve Ca2 + görüntüleme için uygun agar-gömülü retina dilim hazırlanması için bir protokol. Bu yöntem, tek presinaptik sinir uçları doğrudan patch-klemp kayıtları kullanarak retina mikrodevreler şerit-tip sinaps bir çalışma sağlar.

Patch-kelepçe Kapasitans Ölçümler ve Ca 2 + Retina Dilimleri Tek Sinir Terminalleri Görüntüleme

Biz sağlam fare retinadan çubuk ve koni photoresponses elde etmek için transretinal elektroretinogram (ERG) kayıtları nispeten basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşım ışığında cevaplar ayırmak ve izole düz monte retina arasında yer alan elektrotlar kullanarak bunları kaydetmek için fotoreseptör gelen sinaptik iletim bloğu yararlanır.

Fare Retina gelen Transretinal ERG Kayıtlar: Rod ve Koni Photoresponses

Bu video, düz montajlı bir fare retinasından elektrofizyolojik kayıt için tam hücre yama kelepçesi tekniğini göstermektedir. Retina içindeki yıldız patlaması amakrin hücrelerine (SAC'ler) yaklaşmak için elektrotlu ince bir cam pipet kullanılır. Bir conta oluşturduktan sonra, zarı yırtmak ve tüm hücre yama-kelepçe konfigürasyonunu oluşturmak için emme uygulanır. Son olarak, iyonların SAC sinaptik reseptörlerinden akışı konfigürasyon kullanılarak ölçülür.

Düz Montajlı Bir Fare Retinasından Elektrofizyolojik Kayıt için Tam Hücre Yama Kelepçesi Oluşturma

Bu video, karanlığa uyarlanmış bir fare retina dokusu dilimi hazırlığında ışıkla uyarılan post-sinaptik yanıtların kaydını göstermektedir. Retina dilimi bir kayıt odasına yerleştirilir ve bir retinal ganglion hücresi ile elektriksel süreklilik sağlamak için bir kayıt pipeti kullanılır. Pipet tarafından kaydedilen ganglion hücrelerinde uyarıcı post-sinaptik potansiyeller oluşturmak için ışık darbeleri uygulanır.

Fare Retina Dilimlerinin Nöronlarında Işık Uyarılmış Postsinaptik Yanıtlar

Biz su kaplan semender (gelen ince retina dilim hazırlanması...

Bir Amfibi Retina Dilim hazırlanması Fotoreseptörler ve İkinci dereceden nöronlar eş zamanlı tam hücreli Kayıtlar

Bu video makalede hücre gövdeleri yama kurulum, usul ve nasıl tüm montaj fare retinae ganglion hücrelerinden dinamik kelepçe kayıtları uygulamaya göstermektedir. Bu teknik, eksitatör ve inhibitör sinaptik girdi kesin katkısının incelenmesi ve nöronal spike için göreceli büyüklüğü ve zamanlaması sağlar.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Fare gözünden retina dilimlerinin nasıl hazırlanacağını ve retina nöronlarında ışık tepkilerinin nasıl kaydedileceğini göstereceğiz. Tüm prosedür karanlığa uyarlanmış koşullarda gerçekleştirilir.

Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

Bu protokol, düz monte hazırlık retina nöronlar üzerinde tüm hücre yama kelepçe kayıt yapmak gösterilmiştir.

Deafferentated Fare Retina bir düz montaj Hazırlık patlaması amacrine hücreleri Yama Kelepçe Kaydı

Biz retina yüzeyine paralel kesit düzlemi ile erişkin memeli retina yatay dilim hazırlık geliştirdi. nonradially odaklı retinal nöronların dendritik alanları patch-kelepçe ve görüntüleme teknikleri ile sinyal işleme çalışma izin kesilmiş değil.

Elektrofizyolojik Çalışmalar Yetişkin Fare Retina Yatay Dilimleri hazırlanması

Öğrenin fare retinasından karanlık adaptasyonlu dilimler hazırlayarak elektrofizyolojik kayıtlar yapma yöntemini. Patch kelepçe tekniği ile ışık uyarımına yanıtları inceleyin ve görsel sinirbiliminde retinal sinyal yollarını keşfedin.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Daha fazla video keşfet