Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Görsel deneyimimiz, retinal fotoreseptörlerimizdeki görsel pigmentin ışık enerjisinin fotonlarını emmesiyle başlar ve sonuçta hücre zarındaki döngüsel nükleotid kapılı kanalların kapanmasına yol açar. Bu, nörotransmitter glutamatın hem çubuklardan hem de konilerden salınmasını baskılar. Serbest bırakılan glutamat, aşağı akış sinyallerini incelemek için aşağı akış retina hücreleri tarafından algılanır.

Ötenazi uygulanmış bir farenin gözleri alınır. S izole edilir, bir agar bloğuna gömülür ve titreşimli bir mikrotom kullanılarak dilimlenir. Daha sonra retina dilimleri mikroskop altına yerleştirilir ve LED aydınlatma ile uyarılır.

Üretilen sinaptik akımları veya potansiyelleri ölçmek için yama kelepçesi kayıtları alınırken. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, karanlıkta çalışmanın ek karmaşıklıkları nedeniyle mücadele edeceklerdir. Bu nedenle, tüm süreci görselleştirebilmek, aksi takdirde tarif edilmesi zor olan bir his sağlayacaktır.

Bu prosedüre, kullanılacak kayıt ve referans tel elektrotlarını bir gümüş klorür tabakası ile kaplayarak başlayın. Elektrotları bir molar sodyum klorüre batırın. Daha sonra, bir hertz sinüs dalgası ile 15 voltluk bir güç kaynağı kullanarak, aralarında yaklaşık 20 saniye boyunca 15 volt sürün.

Bir mikro pipet çektirme kullanarak, yaklaşık 20 mikron çapındaki hücre gövdeleri için hedef hücrelerin boyutuna göre bir pipet ucu direnci seçerek, ateşle parlatılmış BO silika camdan yama pipetleri hazırlayın. Hücre gövdeleri için beş ila 10 mega ohm uç direncine sahip bir boru PET kullanın. Çapı yaklaşık beş mikron olduktan sonra, 12 ila 15 mega ohm'luk bir uç direnci kullanın.

Toprak referans elektrotlarını hazırlamak için, polietilen boruyu bir milimolar sodyum klorür içinde hazırlanan% 3.5 agar çözeltisi ile doldurmak için bir şırınga kullanın. Ardından, ekteki yazılı protokoldeki talimatlara göre aşağıdaki çözümleri hazırlayın. Dış banyo solüsyonu, dilimleme solüsyonu, potasyum aspartat pipet iç solüsyonu ve agar geri tepme ucu.

Tüm çözeltileri ihtiyaç duyulana kadar dört santigrat derecede saklayın. Deneyin yapıldığı gün, Thor yaklaşık 1.5 mililitre potasyum aspartat iç çözeltisi verdi. Sonra seyreltilmiş Fluor ekleyin.

Sodyum bikarbonat içeren yaklaşık 50 mililitre AIM ortamını ışık geçirmez saklama kabına dökün. Hedeflenen ortamı gazla dengelemek için plastik boruyu %5 karbondioksit ve %95 oksijen içeren bir gaz tankına bağlayın ve ardından kabı 30 ila 32 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. Daha sonra, bir şişeyi 110 mililitre amaçlı, orta bezelye içeren bir şişeyle doldurun ve buzun üzerine koyun.

Çözeltiyi %100 oksijen gazı ile köpürterek ortamı eşitleyin. Sodyum bikarbonat içeren kalan aimes ortamını Faraday kafesinin üstündeki ısıtılmış bir rezervuara yerleştirin. Çözeltinin üzerindeki boşluğa gazı hapsetmek ve %5 karbondioksit, %95 oksijen gazı ile dengelemek için tüpün ve şişenin etrafına paraform sarın.

Bir cam hava dağıtım tüpü kullanarak, yığın ısı ile 25 mililitre hedef ortama 0,75 gram ekleyerek %3 düşük jelleşme sıcaklığı arosu hazırlayın. Çözelti karıştırılırken yaklaşık 115 santigrat derecedir. Çözelti kabarcıklar olmadan berraklaştığında, erimiş agar çözeltisini 42 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin.

Kayıt odasını ters çevrilmiş mikroskopta kurun. Gümüş, gümüş klorür referans elektrodunun üzerine beş santimetrelik bir agar köprüsü kaydırın ve kayıt odasına yerleştirin. Pipet ucu direnci, bir pipeti dahili çözelti ile doldurarak, pipet tutucuya yerleştirerek, pipet tutucuyu amplifikatör kafası aşamasına koyarak ve fizyolojik kayıtlar için görsel pigmenti korumak için pipeti çözeltiye indirerek ölçülebilir, tüm prosedürler kızılötesi gözlük kullanılarak kızılötesi ışık altında gerçekleştirilmelidir, ancak tüm prosedürler burada oda ışığında gösterilecektir.

Fareye ötenazi uygulandıktan sonra, gözleri hızlı bir şekilde çıkarmak için kavisli makas kullanın. Yuvarlanmalarını önlemek için gözleri bir parça filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Daha sonra forseps ile bir gözünüzü yerinde tutun ve korneada bir yarık açmak için ince bir çift taraflı bıçak kullanın.

Göz küresi delinir delinmez. Gözü, amaç ortamı ile doldurulmuş 60 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Korneadaki yarığı giriş noktası olarak kullanarak, korneanın kalan kısımlarını kesmek için küçük makas kullanın.

Ardından lensi ve vitreus mizahını çıkarın ve retinanın göz kabına bağlı kaldığından emin olun. Hedeflerle dolu hafif ve sıkı bir kaba koyun. Ortam, 32 santigrat derecede% 95 oksijende% 5 karbondioksit ile dengelenmiştir.

Sonraki hemis sn. 10 numara neşter bıçağı kullanan göz kapaklarından biri. Retinayı retina pigment epitelinden ayırın.

Dokunun düz bir şekilde yaşamasını sağlamak için retinanın kenarlarını çıkarın. 35 milimetrelik bir Petri kabını erimiş düşük jelleşme sıcaklığındaki agar ile doldurmak için lateks ampullü küçük bir cam makarna pipeti kullanın ve kıvamını test etmek için forsepsleri agarın içinden sürükleyin. Agar katılaşmaya başladığında, retinayı agarın tepesine aktarın.

Daha sonra retinaya dokunmadan, etrafındaki fazla solüsyonu emmek için bükülmüş bir parça Kim mendil kullanın. Doğrudan retinanın üzerine iki ila üç damla daha agar damlatın ve retinayı silindirin merkezine yakın tutarken etrafına bir duvar oluşturmak için hızlı bir şekilde plastik bir silindir yerleştirin, ek erimiş agarda damlatın, Petri kabını soğuması için bir buzlu su banyosuna aktarın. 30 saniye sonra, dokuyu çıkarın ve agar bloğunu çıkarmak için bir piston kullanın, retinadan en uzak taraftan itin

Retinayı içeren küçük bir agar bloğunu kesmek için tek taraflı bir tıraş bıçağı kullanın ve bloğu numune diski üzerindeki agar geri tepmesine karşı yerine süper yapıştırın. Numune diskini titreşen mikrotom ağacına aktarın ve buz gibi soğuk hedef yığınlarını ağaca dökün, böylece retinalı bloğun tamamen suya daldırılmasını sağlayın. Retinayı kesmek dört ila beş saniye sürecek şekilde ayarlanmış bir ileri bıçak hızı ile maksimum bıçak titreşim hızını kullanarak yaklaşık 200 mikron kalınlığında retina dilimleri kesin. Bir kere.

Bloktan kullanılabilir her dilimi birer birer kesmek için 11 numaralı neşter bıçağı kullanın. Retinayı içeren dilimleri kayıt odalarına yerleştirin ve basılı tutun. Dilim ankrajları kullanarak, dilim ankrajını geçen naylon iplikler

Retinayı çevreleyen agarı basılı tutun ve retinayı engelsiz bırakın. Kayıtlar için. Kayıt odasını dik mikroskop aşamasına aktarın.

Perdeyi kapatın ve dilimi kızılötesine duyarlı bir kamerada görüntülemek için kızılötesi ışık kaynağını açın. Mikroskop altında, uygun kesme açısında sağlam fotoreseptörlere sahip bir retina dilimi tanımlayın. Dilimleme işleminden dolayı bir miktar yüzey hasarı görülebilir.

Ucu kırık bir pipet kullanarak ölü hücre cisimlerini nazikçe emdirin Bu ince hücre tabakasını çıkarmak için, sağlıklı bir canlı hücre tabakası ortaya çıktığında, konumu ilgilenilen tabakalarda bulunan bir hücre cismini tanımlayın. Pipet ucunu hücre zarını çukurlaştıracak şekilde hareket ettirin ve yüksek dirençli bir sızdırmazlık sağlamak için nazik, negatif veya içe doğru basınç uygulayın. Tüm hücre modu, hücreye girmek için elektroda negatif basınç uygulanarak elde edilebilir.

Ardından, yanıtları uyandırmak için LED'leri kullanarak retina dokusunu ışıkla uyarın. Kaydın sonunda, pipetin dahili solüsyonundan hücreye diyalize giren Fluor için uygun uyarma ışığını kullanarak bir görüntü yakalayın. Burada, karanlığa adapte olmuş bir retinal nöronun artan güçteki ışık parlamalarına karşı ışıkla uyarılmış potansiyelleri gösterilmektedir.

Bu şekil, hücrelerin Fluor Lucifer sarı uyarılmış floresan ile doldurulduğu bir retina diliminden alınan bir floresan resmidir ve yama kayıtlarının yapıldığı hücrelerin morfolojisini gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, karanlığa uyarlanmış retina dilimlerinden yama kelepçesi kayıtları yapmanın bazı karmaşıklıklarını daha iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürün amacı, kontrollü aydınlatma altında ışıkla uyarılan tepkileri ölçmektir.

Bunu yapabilmek için önce retinayı izole etmemiz, burguya gömmemiz ve ardından tek hücreli kayıtlar yapabileceğimiz retina dilimleri hazırlamamız gerekiyor.