3 Larvaların segmental sinirler Görselleştirme ^Rd Instar Drosophila Larvaların Hazırlıkları

Aksonal transport, larval segmental sinirlerin görüntülenmesiyle incelenebilir. Üçüncü instarda bir drosophila. Larva öncelikle; optik loblara, ventral gangliyona ve segmental sinirlere zarar vermeden MSS'yi açığa çıkaracak şekilde diseke edilir.

Prosedürün ikinci adımı, lavayı formaldehitte sabitlemek ve ardından birincil antikor ile gece boyunca, ikincil antikor ile ise karanlıkta bir saat boyunca inkübe etmektir. Daha sonra lava bir lam üzerine monte edilir ve aksonal taşıma kusurları, protein lokalizasyonu ile protein dağılımı immunfloresan mikroskopi aracılığıyla incelenebilir.

Bu yöntem aksonal transport hakkında bilgi sağlayabilse de, sinaps ve kas morfolojisi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, özellikle beyin segmental sinirlerini ve kaslarını sağlam tutmak suretiyle yapılması gereken bu izin verilen diseksiyon işlemini başlangıçta gerçekleştirmekte zorlanacaklardır. Bu prosedüre başlamak için 1x diseksiyon tamponu fiksatifi, 1x PBT ve %5 BSA çözeltisi hazırlayın.

Diseksiyon öncesinde gösterilen tabloda detaylandırıldığı üzere, diseksiyona başlamak için temiz bir çift 5 numara pens, temiz bir çift düz ağızlı makas ve iğneler hazırlayın; belirli bir genotipe sahip üçüncü evre yıldız larvaları bir Petri kabına toplamak için mikro kaşık kullanın. Ardından, tüm besinlerden arındırmak için larvaları, deiyonize suyla doldurulmuş bir Petri kabında yıkayarak temizleyin.

Ardından bir larvayı, sırtı yukarı bakacak şekilde S koruma kabına yerleştirin. Larvayı ön ve arka uçlarından iğneleyin. İğnelenmiş larvanın üzerine, ince makas kullanarak bir damla tek seferlik diseksiyon tamponu damlatın.

Dorsal orta hattın posterior ucuna yakın bölgedeki lavayı kıstırın. Makas kullanarak, lava kütikülünü posterior uçtan anterior uca kadar kesin. Diseke edilen lavanın üzerine bir damla 1x diseksiyon tamponu damlatın.

Bir iğne kullanarak, larvanın ortasına yakın bir bölgedeki kütikülün bir yan kenarını tutun ve kütikülü başka bir iğne ile sabitleyin. Kütikülün ikinci yan kenarı için, diyagramda gösterildiği gibi her iki yan tarafta ikişer iğne kullanılır. Şimdi, iki optik lob ve ventral gangliyonlar ile birlikte yalnızca beyni bırakacak şekilde bağırsakları, yağ cisimcikleri ve trakeaları dikkatlice çıkarın.

Segmental sinirler eklenmiş haldeyken, larvaların koruma kabına sabitlenmesiyle birlikte fiksasyon ve antikor boyama işlemleri gerçekleştirilir. Diseksiyonu yapılmış larvaları 50 µL fiksatif içerisinde 30 dakika boyunca inkübe edin. Fiksasyon sonrası fiksatifi her 15 dakikada bir yenileyerek, larvaları bir kez PBT ile 30 dakika boyunca durulayın.

Tampon çözeltiyi her 10 dakikada bir değiştirirken, larvaların her zaman tampon içinde daldırılmış olduğunun unutulmaması önemlidir. Birincil antikor çözeltisini, %5 BSA çözeltisi içerisinde uygun konsantrasyona seyrelterek hazırlayın. Optimal konsantrasyonlar farklı antikorlar için farklılık gösterir.

Plastik bir kabı suyla ıslatılmış Kimwipe ile kaplayarak nemli bir bölme oluşturun. Sonuncusunu PBT ile değiştirin.

Hazırlanan primer antikor çözeltisi ile durulayın ve nemli oda içerisinde dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Diseke edilmiş larvaları, tamponu her 10 dakikada bir yenileyerek, bir kat PBT içerisinde 30 dakika boyunca durulayın. Sekonder antikoru, %5 BSA çözeltisi içinde uygun konsantrasyona seyrelterek hazırlayın.

Bazı sekonder antikorlar ışığa duyarlı olduğundan, nemli hazneyi folyo ile sarın. Larvaları sekonder antikor çözeltisi ile 25 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Sekonder antikor ile inkübasyon tamamlandığında, tamponu her 10 dakikada bir yenileyerek larvaları 30 dakika boyunca 1x PBT ile durulayın ve ardından diseke edilen larvaları lam üzerine yerleştirmeden önce monte edip görselleştirme aşamasına geçin.

Slaytı, diyagramda gösterildiği gibi, ortasına bir lamelin sığabileceği kadar boşluk bırakarak iki dikey oje hattı çekerek hazırlayın. Ojenin tamamen kurumasını bekleyin. Bu görüntüde gösterildiği gibi, slayt üzerindeki dikey oje hatlarının arasındaki boşluğa bir damla montaj tamponu yerleştirin.

Slayt artık montaja hazırdır. Son larva PBT süresini tamamladıktan sonra larvaları geri alın. Durulayın ve yan pinleri larvalardan nazikçe çıkarın.

Kütikülün yırtılmamasına dikkat edin. Geriye kalan iki pini çıkarın, larvayı pensle alıp hazırlanmış lama yerleştirin. Larvanın ters dönmediğinden ve ventral yönünün yukarıda olduğundan emin olun.

Yan tarafı yukarı gelecek şekilde üzerine nazikçe bir lamel yerleştirin ve burada gösterildiği gibi kenarlarını oje ile mühürleyin. Larvalar artık floresan mikroskop altında görüntüleme için hazırdır. Bu temsilî görüntü, sinaptik vezikül proteini olan sistin dize proteinine karşı antikorlarla boyanmış yaban tipi bir larvaya aittir.

Lava segmental sinirleri düzgünce boyanmıştır. Burada, bir motor protein mutandı olan lava, CSP'ye karşı antikorlarla boyanmıştır. Segmental sinirler, CSP için parlak boyanan masif birikimler göstermektedir.

Bu prosedürü uygularken, beyne bağlı segmental sinirleri korumanın ve kasları sağlam tutmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu videoyu izledikten sonra, diseksiyon işleminin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Floresan mikroskop kullanarak aksonal transportu incelemek için immünboyama yapılmış üçüncü larval segmental sinirleri sabitleyin.