3 Larvaların segmental sinirler Görselleştirme ^Rd Instar Drosophila Larvaların Hazırlıkları

Aksonal taşıma, larva segmental sinirleri görselleştirerek incelenebilir. Üçüncü bir instar drosophila. Larva ilk önce diseke edilir ve optik loblara, ventral ganglion'a ve segmental sinirlere zarar vermeden CNS'yi açığa çıkarır.

Prosedürün ikinci adımı, gece boyunca birincil antikor ve karanlıkta bir saat boyunca ikincil antikor ile inkübe edilmeden önce lavın formaldehit içinde sabitlenmesidir. Lav daha sonra bir cam kızak üzerine monte edilir ve aksonal taşıma kusurları giderilir. Protein lokalizasyonu ve protein dağılımı immünofloresan mikroskobu ile incelenebilir.

Bu yöntem aksonal taşıma hakkında bilgi sağlayabilse de, sinaps ve kas morfolojisi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü başlangıçta bu izin verilen diseksiyonu gerçekleştirmek, özellikle de beyin segmental sinirlerini ve kaslarını sağlam tutmak zordur. Bu prosedüre başlamak için bir kez diseksiyon tamponu fiksatifi, bir kez PBT ve% 5 BSA çözeltisi hazırlayın.

Diseksiyondan önce gösterilen tabloda detaylandırıldığı gibi, diseksiyonu başlatmak için temiz bir çift beş numara pazı, temiz bir çift düz bıçaklı fan makası ve pimi toplayın, dolaşmayı toplamak için bir mikro kaşık kullanın. Bir Petri kabı üzerine belirli bir genotipe sahip yıldız larvalarında üçüncü. Daha sonra larvaları, tüm yiyeceklerden kurtulmak için deiyonize su ile doldurulmuş bir Petri kabında durulayarak yıkayın.

Ardından, sırt tarafı yukarı bakacak şekilde S koruma çanağının üzerine bir lav yerleştirin. Lavı ön ve arka tarafına sabitleyin. Uçlar, ince makas kullanarak sabitlenmiş lav üzerine bir kerelik diseksiyon tamponundan bir damla yerleştirir.

Arka uca yakın dorsal orta hattaki lavları sıkıştırın. Makası kullanarak lav kütikülünü arka uçtan ön uca kadar kesin. Disseke lav üzerine bir damla yeni bir kez diseksiyon tamponu yerleştirin.

Bir iğne kullanarak, lavın ortasına yakın kütikülün bir yan kenarını seçin ve başka bir iğne kullanarak kütikülü sabitleyin. İğne. Kütikülün ikinci yan kenarı, şemada gösterildiği gibi her iki yan tarafta iki pim kullanılır. Şimdi, bağırsakları ve yağ cisimciklerini ve traia'yı dikkatlice çıkarın, sadece iki optik lob ve ventral gangliyon ile beyni bırakın.

Segmental sinirler bağlıyken, daha sonra larvalar koruyucu çanağa bağlı olarak fiksasyon ve antikor boyama yapılır. Disseke edilen larvaları 30 dakika boyunca 50 mikrolitre fiksatif içinde inkübe edin. Fiksasyondan sonra her 15 dakikada bir fiksatifi değiştirerek, larvaları 30 dakika boyunca bir kez PBT'de durulayın.

Tamponu her 10 dakikada bir değiştirerek, larvaların her zaman tampona batırılması gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Birincil antikor çözeltisini% 5 BSA çözeltisi içinde uygun konsantrasyona seyrelterek hazırlayın. Optimal konsantrasyonlar farklı antikorlar için farklılık gösterir.

Kim ile plastik bir tabak kaplayarak nemli bir oda inşa edin. Suya batırılmış olarak silin. Sonuncuyu PBT'nin son bir katı ile değiştirin.

Hazırlanan birincil antikor çözeltisi ile durulayın ve ertesi gün gece boyunca nemli odada dört santigrat derecede inkübe edin. Disseke edilen larvaları her 10 dakikada bir tamponu değiştirerek 30 dakika boyunca bir kez PBT'de durulayın. İkincil antikoru %5 BSA çözeltisi içinde uygun konsantrasyona seyrelterek hazırlayın.

Ve bazı ikincil antikorlar ışığa duyarlı olduğu için nemli odayı folyoya sarın. Larvaları ikincil antikor çözeltisi ile bir saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. İkincil antikor ile inkübasyon yapıldığında, tamponu her 10 dakikada bir değiştirerek larvaları 30 dakika boyunca bir kez PBT'de durulayın ve lavı slayta monte etmeden önce disseke edilen larvaları monte etmeye ve görselleştirmeye devam edin.

Şemada gösterildiği gibi bir kapak kaymasının oturması için yeterince geniş bir boşluk bırakacak şekilde ortasına iki dikey oje çizgisi yayarak slaydı hazırlayın. Oje kuruduğunda ojenin tamamen kurumasını bekleyin. Bu resimde gösterildiği gibi slayttaki dikey oje çizgileri arasındaki boşluğa bir damla montaj tamponu yerleştirin.

Sürgü artık montaj için hazırdır. Son bir kez PBT'den sonra larvaları alın. Yanal pimleri durulayın ve nazikçe lavdan çıkarın.

Kütikülü dikkatlice yırtmamaya dikkat edin. Kalan iki pimi çıkarın ve lavları forseps ile alın ve hazırlanan slaytın üzerine yerleştirin. Lavın ters çevrilmediğinden ve ventral olarak yönlendirildiğinden emin olun.

Yukarı tarafı yukarı doğru nazikçe üstüne bir kapak fişi yerleştirin ve kenarları burada gösterildiği gibi oje ile kapatın. Larvalar artık floresan mikroskobu altında görselleştirmeye hazırdır. Bu temsili görüntü, sinaptik vezikal protein, sistin sicim proteinine karşı antikorlarla boyanmış vahşi bir lav tipidir.

Lav segmental sinirleri düzgün bir şekilde boyanır. Burada. Bir motor protein mutant lav, CSP'ye karşı antikorlarla boyandı. Segmental sinirler, CSP için parlak bir şekilde lekelenen büyük birikimler gösterir.

Bu prosedürü denerken, beyne bağlı segmental sinirleri korumayı ve kasları sağlam tutmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, nasıl inceleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Üçüncü bir immünostain'i düzeltin ve bir floresan mikroskobu kullanarak aksonal taşımayı incelemek için larva segmental sinirleri başlatın.