Name: 3 Larvaların segmental sinirler Görselleştirme Rd Instar Drosophila Larvaların Hazırlıkları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Öğrenin aksiyonel taşıma mekanizmalarını Drosophila melanogaster üçüncü instar larvalarında immünofloresan mikroskopi ile incelemeyi. Bu yöntem nörolojik hastalıkların anlaşılmasına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SG, Buffalo New York Devlet Üniversitesi ve John R. Oishei Vakfı fonları tarafından desteklenmektedir.

1. Reaktiflerin hazırlanması <ol><li> 1x Diseksiyon Tampon 128 mM NaCl, 4mm CaCl 2, 4mm MgCl 2, 2 KCl mM, 5mM Hepes ve 36mm Sakkaroz kullanarak hazırlayın. PH 7.2 ve filtre çözüm sterilize edin. </li><li> Fiksatif% 16 formaldehit ve 1x Diseksiyon Tampon 1:1 seyreltme kullanarak hazırlayın. </li><li> 1x Fosfat kullanarak hazırlayın 1x PBT Saline (PBS) 1:100 oranında 7.2 ve Triton X-100 PH Tamponlu. </li><li> Hazırla% 5 1x PBS içinde% 0.01 Azid Na Bovine Serum Albumin (BSA). </li></ol> 2. Diseksiyon için hazırlanması <ol><li> Sylgard yemekler diseksiyon için kullanılır. Sylgard 184 silikon elastomer tabanı dökme ve bir Petri kabı içine ajan karışım kür yemekleri hazırlayın. Karışımı kullanmadan önce tamamen katılaşmaya ve kurumaya bırakın. </li><li> Diseksiyonu önce # 5 forseps temiz bir çift, düz bıçak vannas makas temiz bir çifti, ve pimler toplamak. </li></ol> 3. 3. Instar Larva diseksiyonu <ol><li> Üzerine belirli bir genotip 3. instar larvalar bir petri dolaşıp toplayın. </li><li> Gıda kurtulmak için deiyonize su larvalar yıkayın. </li><li> Dorsal yüzü yukarı ile bir larva, sylgard tabağına yerleştirin. Anterior ve posterior ucunda larva Pin. </li><li> 1x Diseksiyon Tampon tutturulmuş larva bir damla yerleştirin. Ince makas nip dorsal orta hat posterior sonuna yakın larva kullanma. Makas kullanarak, ön ucu ile arka sonundan itibaren larva manikür kesti. </li><li> Yeni 1x Diseksiyon Tampon bir damla disseke larva üzerine yerleştirin. Bir iğne kullanarak, manikür larva ortasına yakın bir lateral kenar almak ve manikür pin. Başka bir iğne ucu ile, ikinci şemada gösterildiği gibi kütikül lateral kenarı pin. Her yan tarafında iki iğne kullanılır. Aşağıdaki diyagrama bakınız. </li><li> Dikkatlice bağlı segmental sinirler ile iki optik loblar ve ventral ganglionlar sadece beyin bırakarak, bağırsak, yağ organları, ve trakea çıkarın. Prosedürün geri kalan sylgard çanak yapılır. </li></ol> 4. Dissected Larva fiksasyonu <ol><li> Her 15 dakikada bir düzeltme yerine, 30 dakika boyunca düzeltme disseke larva inkübe edin. </li><li> Fiksasyon sonra, 30 dakika boyunca her 10 dakikada bir tampon değiştirerek 1x PBT larva durulayın. Larva her zaman bir tampon gerektiğine dikkat etmek önemlidir. </li></ol> 5. Dissected Larva Antikor Boyama <ol><li> 1x PBT Na Azid% 5 BSA uygun konsantrasyona seyreltilmesi ile birincil antikor hazırlayın. Optimal konsantrasyonları farklı antikorları için farklı olacaktır. </li><li> Son 1x PBT hazırlanan primer antikor çözümü ile temizleyin, durulayın ve nemli bir odasında 4 ° C gecede inkübe değiştirin. Nemli odasına kim-mendil ile suya batırılmış bir plastik tabak astarı tarafından yaptırılmıştır. </li><li> Ertesi gün, 30 dakika boyunca her 10 dakikada bir tampon değiştirerek 1x PBT disseke larva durulayın. </li><li> 1x PBT Na Azid% 5 BSA uygun konsantrasyona seyreltilmesi ile ikincil antikor hazırlayın ve bir saat boyunca 25 ° C'de ikincil antikor çözümü ile larva kuluçkaya yatmaktadır. Sekonder antikorlar ışığa karşı hassastır, ışık önlemek için nemli oda folyo ile sarın. </li><li> Inkübasyondan sonra, her 10 dakikada bir tampon değiştirerek, 30 dakika boyunca 1x PBT larva yıkayın. </li></ol> 6. Dissected Larva Montaj ve Görselleştirme <ol><li> Slayt larva montajından önce, (bkz. diyagram) oturup bir kapak kayma için yeterli bir boşluk, orta oje iki dikey çizgiler yaymak slayt hazırlamak. Tamamen oje kuru olsun. </li><li> Slayt üzerinde dikey oje hatları (bkz. diyagram) arasındaki boşluğu montaj tampon bir damla yerleştirin. Slayt montaj için hazır. <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.2.1.jpg" alt="Şekil 1 adım 6.2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1 adım 6.2"> <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.2.2.jpg" alt="Şekil 2 adım 6.2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2 adım 6.2"></li><li> Son 1x PBT durulama sonra lateral pimleri, yavaşça çıkarın. Manikür gözyaşı değil dikkatli olun. </li><li> Kalan iki pinleri dikkatlice çıkarın ve forseps ile larva pick up ve larva hazırlanan slayt yatay yerde. Larva devrildiğinde ve odaklı ventral yüzü yukarı değildir emin olun. </li><li> Üstüne bir kapak kayma yavaşça yerleştirin ve tırnak cilası ile kenarları mühür (bkz. diyagram). Larva şimdi bir floresan mikroskop altında görünüm için hazırdır. <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.5.jpg" alt="Şekil 1 adım 6.5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1 adım 6.5"></li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2128/2128fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: vahşi bir tür larv larva segmental sinirler bir temsili resimsinaptik vezikül protein sistein dize proteinine karşı antikor (CSP, Zinsmaier ve ark 1994). Segmental sinirler sorunsuz lekeli olduğunu unutmayın. Bar = 20μm <img src="/files/ftp_upload/2128/2128fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: sinaptik vezikül protein sistein dize protein (CSP) karşı antikorlar kullanarak bir motor protein mutant larva larva segmental sinirler bir temsilcisi görüntü. Segmental sinirler CSP (oklar) parlak leke büyük birikimleri unutmayın.

<ol><li>Gunawardena, S., Goldstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Axonal+Transport+and+Neuronal+Viability+by+Amyoid+Precursor+Protein+Mutations+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila.</a> Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).</li>
<li>Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralysis+and+early+death+in+cysteine+string+protein+mutants+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila.</a> Science. 263, 977-980 (1994).</li>
</ol>

Drosophila larva segmental sinirler aksonal taşıma mekanizmaları incelemek için güçlü bir sistem. 3. instar larva diseksiyonu doğru yapılırsa, kas ve NMJs olarak MSS, PNS ve ilişkili doku, tüm bileşenleri tek bir larvanın içinde incelenebilir. Biz bu protokolü Hurd ve Saxton (1996) tarafından yayınlanan bir uyum var. Bu protokol aynı zamanda diğer nöronal antikor testi için adapte olabilir, ancak antikorlar optimizasyonu yapılmalıdır. Primer ve sekonder antikor inkübasyon sürelerinde değişiklik olabi...

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Pens</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pinler, Paslanmaz Çelik</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Mcpherson-Vannas Düz Bıçaklı 8cm Makas</td><td>Fisher Scientific</td><td>50822236</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield, Montaj Mediumu</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon elastomer</td><td>Dow Corning</td><td>4026148</td><td></td></tr><tr><td>formaldehit, %16</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>dCSP3</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Keçi Anti-Fare IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr></tbody></table>

3 larvaların segmental sinirler görselleştirme rd instar drosophila larvaların hazırlıkları

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster, özellikle uygun genetik ve tam sıralı genom, sinir sisteminin gelişimi ve işlevi eğitim için güçlü bir model sistem olarak ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, larva sinir sistemi, larva segmental sinirler, beyin ve sinir uçları vücut uzunluğu boyunca biten içinde bulunan hücre gövdeleri ile akson demetleri içerir aksonal taşıma mekanizmaları incelemek için ideal bir model sistem. Burada larva segmental sinirler içinde sinaptik vezikül proteinlerin görünüm için prosedürü açıklar. Eğer doğru yapılırsa, sinir sisteminin tüm bileşenleri, kas ve NMJs olarak ilişkili dokuları ile birlikte, sağlam, hasarsız ve görüntülenebilmekte hazır kalır. Çeşitli mutasyonları taşıyan 3. instar larvaları disseke, sabit, sinaptik vezikül antikorlar ile inkübe görüntülendi ve vahşi tip larvalara göre . Bu prosedür, larva segmental sinirler içinde kolayca görülebilir proteinlerin çeşitli dağıtım birkaç farklı sinaptik veya nöronal antikor ve değişiklikler için adapte edilebilir.

Drosophila melanogaster larvaları larva segmental sinirler içinde aksonal taşıma mekanizmalarının araştırılması için ideal bir model sistem sağlar. Bu yordamı kullanarak, 3. instar larvaları çeşitli mutasyonları taşıyan vahşi tip larva mukayese edilebilir.

3 Larvaların segmental sinirler Görselleştirme Rd Instar Drosophila Larvaların Hazırlıkları

Drosophila melanogaster, özellikle ... nedeniyle, sinir sisteminin gelişimini ve işlevini incelemek için güçlü bir model sistem olarak ortaya çıkmaktadır.

Aksonal transport, larval segmental sinirlerin görselleştirilmesi yoluyla incelenebilir. Üçüncü instar bir drosophila. Larva önce diseke edilerek optik loblara, ventral gangliyona ve segmental sinirlere zarar vermeden Merkezi Sinir Sistemi (CNS) açığa çıkarılır.Prosedürün ikinci adımı, lavayı birincil antikor ile gece boyunca ve ikincil antikor ile karanlıkta bir saat boyunca inkübe etmeden önce formaldehitte sabitlemektir. Daha sonra lava bir lam üzerine monte edilir ve aksonal taşıma kusurları, protein lokalizasyonu ve protein dağılımı immünofloresan mikroskopi aracılığıyla incelenebilir.Bu yöntem aksonal transport hakkında bilgi sağlayabilse de, sinaps ve kas morfolojisi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, özellikle beyin segmental sinirlerini ve kaslarını sağlam tutarak bu izin verilen diseksiyonu gerçekleştirmenin başlangıçta zor olması nedeniyle güçlük çekeceklerdir. Bu prosedüre başlamak için, bir katı diseksiyon tamponu fiksatifi, bir katı PBT ve %5 BSA çözeltisi hazırlayın.Diseksiyon öncesinde gösterilen tabloda detaylandırıldığı üzere, diseksiyona başlamak için temiz bir çift 5 numara pens, temiz bir çift düz uçlu makas ve ra

visualization-larval-segmental-nerves-3rd-instar-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz sahnelenen hazırlamak için prosedürü...

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

Bu protokol, canlı diseksiyonu tartışıyor.

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Bu protokol, bozulmamış anesthetization ve görüntüleme için güvenilir bir yöntem...

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Larva ve pupa da chordotonal organları immunostain ve görselleştirmek için bir...

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva ve Pupa

Bu video, ekdisteroidlerin ve diğer hormonların biyosentezi ve salgılanması için önemli olan karmaşık bir endokrin yapı olan Drosophila halka bezini tanımlar. Özellikli protokol diseksiyonunu, fiksasyonunu ve immün boyamayı gösterir.

Larva Halka Bezi Diseksiyonu: Gelişimsel Endokrin Organların Drosophila'dan İzolasyonu

Kaynak: Jeong, S. Drosophila'da embriyonik motor nöronların aksonal projeksiyon modelinin görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm.  (2017)Bu video, Drosophila embriyolarında aksonal projeksiyonların görselleştirilmesini göstermektedir. Motor nöronların immünoetiketlenmesi, nöronal yapıları ortaya çıkarmak için hassas diseksiyon ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu toplu olarak ayrıntılı nöronal mimariyi ortaya çıkararak aksonal projeksiyon paternlerini vurgular.

Drosophila'da Embriyonik Motor Nöronların Aksonal Projeksiyon Modellerinin Görselleştirilmesi

Santral sinir sistemi rejenerasyon ve onarım araştırmak Drosophila larva ventral sinir kablosu kullanarak bir yaralanma paradigma açıklanmıştır. Kasıtlı geliştirilen yazılım ve genetiği ile kantitatif analiz ile birlikte zaman atlamalı ve sabit örneklerde konfokal mikroskopi lazer tarama, ardından bıçaklama MSS rejenerasyon ve onarım moleküler mekanizmalarının araştırılması için kullanılır.

Santral Sinir Sistemi Onarım İnceleyecek Bir Sakatlık Paradigma<em&gt; Drosophila</em

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Biz diseksiyon, tespit ve steroid hormon biyosentezi ve düzenleyici mekanizma çalışmaya Drosophila larvaları ve yetişkin kadınlarda Sterpidojenik organların immün için bir protokol açıklar. steroidojenik organlara ek olarak, böyle germ çizgili kök hücreleri gibi steroidojenik organların innervasyon olarak steroidojenik hedef hücreleri görselleştirmek.

Sineği boyanmasına ile steroidogenik organları ve İnteraktif Organlar görselleştirme için Protokoller<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya yöntemini ayrıntılarıyla anlatıyor . FasII antikoru ile lekelenmiş sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve sinirsel gelişim sırasında hedef tanıma için gerekli genlerin karakterize edilmesi için güçlü bir araç sağlar.

Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi<em&gt; Drosophila</em

Burada, fizyolojik koşullar altında hücresel ve hücre altı dinamikleri gözlemlemek için Drosophila melanogaster üçüncü instar larvalarından canlı eksplant beyinlerini hazırlamak, parçalamak, monte etmek ve görüntülemek için bir iş akışını tartışıyoruz.

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Öğrenin aksiyonel taşıma mekanizmalarını Drosophila melanogaster üçüncü instar larvalarında immünofloresan mikroskopi ile incelemeyi. Bu yöntem nörolojik hastalıkların anlaşılmasına katkı sağlar.

3 Larvaların segmental sinirler Görselleştirme^Rd Instar Drosophila Larvaların Hazırlıkları

Daha fazla video keşfet