Name: Sınıf Anahtarı Rekombinasyon murin B Hücreleri Saf İndüksiyon ve Değerlendirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Öğrenin, manyetik hücre ayrıştırma ve LPS ile uyarım kullanarak murine dalak B hücrelerinde sınıf anahtarı rekombinasyonunu in vitro analiz etme yöntemini. Bu teknik, B hücre bağışıklığı ve antikor üretimi mekanizmalarını araştırmak için güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yararlı tartışmalar için Martin laboratuvara minnettarız. Bu yayın, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (MOP-89.783) bir hibe ile desteklenmektedir. PM Kanada Araştırma Başkanı Tier II Ödülü tarafından desteklenmektedir.

Adım: manyetik zenginleştirme ile dalak B hücreleri izolasyonu <ol><li> Deneysel farelerin bağışıklık sisteminin olgunlaşmasını sağlamak için 8-12 hafta arası olmalıdır. </li><li> Servikal dislokasyon fare Euthanize ve% 70 etanol ile ıslatın. Cerrahi karnın sol hypochondrium kas ve deri yoluyla bir kesi yaparak, dalak kaldırmak ve fosfat üç büyük parçalar halinde kesip tamponlu salin (PBS). Tüm alet ve reaktifler steril olduğundan emin olun. </li><li> Lapa hafifçe PBS içine 70 mikron hücre süzgecinden 1 ml şırınga pistonu kauçuk sonu dalak kullanarak. Taşlama büyük (yani prolifere) hücreleri rüptürüne yol açabilir gibi bir itme hareketi yerine taşlama hareket kullandığınızdan emin olun. </li><li> 5 dakika için en fazla 350 g hücreleri aşağı Spin ve pelet PBS içinde tekrar süspansiyon haline getirin. Hemasitometre kullanarak yeniden süspanse hücre sayımı. </li><li> 1x10 8 hücre / ml PBS içinde bir kap ile 5 ml steril bir polistiren tüp% 5, normal sıçan serumu (tüp başına 2 mL maksimum hacim) ile bir süspansiyon hazırlayın. </li><li> Ml için her hücre EasySep Negatif Seçim Fare B Hücre Zenginleştirme kokteyl 50 mcL ekleyin. Karışımı Pipet, tüpler kap ve 15 dakika boyunca buzdolabında yer. </li><li> Her hücre ml için 100 mcL EasySep Biotin Seçim Kokteyl ekleyin. Karışımı Pipet, tüpler kap ve 15 dakika boyunca buzdolabında yer. </li><li> EasySep Manyetik Nanopartiküller hücrelerin her ml için 100 mcL (nanopartiküller iyice karıştırılır ve çözüm homojen sağlamak) ekleyin. Karışımı Pipet, tüpler kap ve 5 dakika buzdolabına koyun. </li><li> PBS ve 5 dakika için bir EasySep mıknatıs yer 2.5ml Top çözüm. Mıknatıs ve tüp ters çevirin ve hızla, yeni bir polistiren tüp içine dökün. Olumsuz seçilen hücreleri manyetik tüp duvarları bağlı olacak gibi tüp sallamayın. </li><li> Saflık hücre süspansiyonu daha da artırmak için, tüp ek bir 5 dakika için cazibe merkezi haline yerleştirilemeyen ve yeni bir tüp dökülür olabilir. Bu genel hücre kurtarma azaltabilir. </li><li> B hücre saflık, B hücre yüzey belirteçleri akış sitometrik analizi ile tespit edilebilir. Zenginleştirme ardından, biz sürekli olarak&gt;% 95 B220 pozitif hücrelerin bir saflığa bakın. </li></ol> Adım: II KAKE hücre boyama <ol><li> Ml başına 1 x 10 6 hücre bir final konsantrasyonda albumin% 0.1 sığır serumu ile desteklenmiş sıcak PBS içinde izole hücrelerin tekrar </li><li> KAKE (steril dimetil sülfoksit seyreltilmiş) bir 5mM stok solüsyonu hazırlayın ve tüp hücrelerin her ml için 2μL ekleyin. 10μM son konsantrasyonu birincil B hücreleri boyama için en uygunudur. </li><li> 37 inkübe ° C de 10 dakika karanlıkta (not: KAKE ışığa duyarlı ve mümkün olduğunda karanlık tutulmalıdır). </li><li> Sığır buzağı serum eşit miktarda hücrelere ekleyerek 5 dakika buz üzerinde inkübe leke Quench. </li><li> Kültür ortamı ile tüpler g. (tarifi için adım III) tepesi ve 350 santrifüj hücreleri tarafından yıkayın Medyanın en az 5 kat daha hacimli eşdeğer, sığır buzağı serum viskozitesi karşı ve hücreler için bir pelet üretmek için eklenmesi gerektiğini unutmayın. </li><li> Hücrelerin kültür ortamında iki kez daha yıkayın. Hücrelerinin uyarılması için hazırız. </li></ol> Adım III: LPS ile hücre uyarımı <ol><li> % 10 fetal sığır serumu ve 50 mcM β-mercaptoethanol / RPMI 1640 Ürünü in vitro B hücre kültür ortamı hazırlayın. </li><li> 50μg/mL son bir konsantrasyonda LPS ekleyerek stimülasyon orta hazırlayın. Düz dipli her bir kuyunun 96-iyi doku kültürü plakası stimülasyon orta kısım 125 mcL. </li><li> 3.2 x 10 6 hücre / ml son bir konsantrasyonda LPS olmadan KAKE lekeli B hücreleri kültür ortamı hazırlayın. Stimülasyon orta ve hafifçe pipetleme karışım içeren kuyu hücre süspansiyonu 125 mcL ekleyin. </li><li> Her iyi şimdi 25 mcg / mL nihai LPS konsantrasyonu 4 x 10 5 hücreler içerir. Bu değerlerde değişiklikler istediğiniz gibi olsa da bu, hücre çoğalması ve sınıf değiştirme optimal düzeyde sağlar. </li><li> Hücreler 37 ° ° C'de ve% 5 CO 2 72 96 saat. 48 saat sonra, büyük bir hızla çoğalan B hücreleri kümeleri, mikroskop altında açıkça görülebilir. </li></ol> Adım IV: sınıf anahtarlama Flow sitometrik analizi <ol><li> Sınıfı anahtarlama bakmak için hazır olduğunuzda, kendi kültür koşulları hücreleri çıkarmak ve 1 mL boyama tamponu (% 2 büyükbaş buzağı serumu ile PBS) iki kez yıkayın. </li><li> 350 g ve inkübasyon onları aşağı iplik hücreleri, pelet hücreler non-spesifik antikor boyama önlemek için% 5 normal fare serumu ve 15 dakika boyunca buz üzerinde FcBlock per106 hücrelerinin 1μg tampon boyama, 100μL te onları. Hücre engelleme buz üzerinde yapılmalıdır. </li><li> Hücrelerin yıkama olmadan, floresan etiketli anti-fare IgG3 antikor 10 6 hücre başına 1μg eklemek ve izin hücreler 30 dakika boyunca buz üzerinde leke. </li><li> 200-300 mcL boyama tampon santrifüj ve tekrar süspansiyon hücreler iki kez yıkayın. Hücreler flow sitometri ile değerlendirilmesi için hazırız. </li><li> KAKE 492 nm'de optimal heyecan (argon-iyon lazer) ve 517 nm dalga boyunda yayar. IgG3 antikorunun eksitasyon ve emisyon spektrumu konjuge floresan boya bağlıdır. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Manyetik zenginleştirme sonra, hücre süspansiyonu ayırt edilemeyen küçük dairesel hücreleri (Şekil 1A) homojen bir nüfus gibi görünmelidir. 48-72 saat sonra stimülasyon, genişlemiş hızla çoğalan hücreleri izole salkım (Şekil 1B) açıkça görülebilir. Apoptozis tabi olmayan hızla çoğalan hücrelerin büyük bir kısmı küçük ve granül görünecektir. KSS normal hücrelerin en çok 7 ölmeye başlamadan önce stimülasyon sonrasında 72 ve 96 saat arasında en yüksek seviyelerde tespit edilebilir. Bu aşamada, hücreleri, hücre bölünmeleri daha sonra kızı hücre popülasyonu görünen anahtarlamalı hücreleri ile bir dizi geçirmiş olmalı. LPS stimülasyon 96 saat sonra IgG3 KAKE seyreltme ve yüzey ekspresyonu bir temsilcisi akış sitometrik arsa Şekil 2'de görülebilir. Tablo 1: geçiş kokteyller İzotip. Not: Uyarıcı konsantrasyonu değerleri yalnızca tavsiyelerdir. Titrasyonları gerekli olabilir. <table border="1"><tbody><tr><td> İstenen İzotip </td><td> Uyarım Kokteyl </td></tr><tr><td> IgG1and IgE </td><td> LPS (25μg/mL) ve IL-4 (10 ng / ml) </td></tr><tr><td> IgG1and IgE </td><td> Anti-CD40 (10μg/mL) ve IL-4 (10 ng / ml) </td></tr><tr><td> IgG2a </td><td> LPS (25μg/mL) ve IFN-γ (10 ng / ml) </td></tr><tr><td> IgG2b ve IgG3 </td><td> LPS (25μg/mL) </td></tr><tr><td> IgA </td><td> LPS (25μg/mL), TGF-β (2 ng / ml) ve IL-5 (1.5 ng / ml) </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 İzolasyon ve dalak B hücreleri LPS stimülasyon. (A) Manyetik LPS stimülasyon önce dalak B hücreleri zenginleştirilmiş. (B) 48 saat sonra 25 mg / ml LPS ile uyarılması. Proliferatif hücreler, kumlama ve apoptotik hücrelerin bir arka plan küme olarak görülür. <img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2, 96 saat sonra Silahların Yayılmasının Önlenmesi ve sınıf anahtarı rekombinasyon . (A) LPS için KAKE seyreltme, 96 saat sonra kültür hücreleri uyarılır. Her bağımsız zirve bağımsız bir hücre bölünmesi ile ilgili KAKE floresan bir seyreltme temsil eder. (B) IgG3 ifade, hücre bölünmesinin birkaç tur sonra bir IgG3 pozitif nüfusunun ortaya çıkması gösteriyor.

<ol><li>Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+differentiation+and+isotype+switching+is+related+to+division+cycle+number%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number.</a> J Exp Med. 184, 277-281 (1996).</li>
<li>McCall, M. N., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+recombination+and+germ-line+transcription+are+division-regulated+events+in+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes.</a> Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).</li>
<li>Manis, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+links+DNA+damage-response+pathways+to+immunoglobulin+heavy+chain+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination.</a> Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).</li>
<li>de Yebenes, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-181b+negatively+regulates+activation-induced+cytidine+deaminase+in+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells.</a> J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).</li>
<li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li>
<li>Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNF8%2FRNF168+ubiquitin+ligase+cascade+facilitates+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).</li>
<li>Zaheen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+constrains+germinal+center+size+by+rendering+B+cells+susceptible+to+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis.</a> Blood. 114, 547-554 (2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class-switch+recombination%3A+interplay+of+transcription%2C+DNA+deamination+and+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair.</a> Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).</li>
<li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli+that+enhance+IgA+class+switching+increase+histone+3+acetylation+at+S+alpha%2C+but+poorly+stimulate+sequential+switching+from+IgG2b%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b.</a> Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).</li>
<li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+class+switching+differs+among+SJL%2C+C57BL%2F6+and+129+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice.</a> Int Immunol. 19, 545-556 (2007).</li>
</ol>

Yukarıda özetlenen protokol birincil fare B hücreleri sınıfı anahtarlama sırasında YARDIM ifade ve fonksiyonunu analiz etmek için standart bir tahlil sağlar. Bu protokol, diğer isotypes (Tablo 1 8, 9 özetlenmiştir) geçiş ikna etmek için uyarılması medya değişiklikler yapılabilir, ancak bakteriyel LPS, IgM gelen IgG3 geçiş ikna etmek için kullanır . Biz henüz bilinmeyen nedenlerden dolayı, fetal buzağı serumu sınıf in vitro gözlenen anahtarlama düzeyini etkileyen belirtti. Bu aynı ...

<table><tbody><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Fare B Hücresi Zenginleştirme Kiti</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19754</td><td></td></tr><tr><td>Polistiren tüpler</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Hücre Proliferasyon Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Dana Serumu</td><td>Hyclone</td><td>SH30072.03</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Kültür Besiyeri</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; kaynaklı Lipopolisakkaritler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6529</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Normal Fare Serumu</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>011-000</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış Sıçan Anti-Fare CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan Anti-Fare IgG3</td><td>BD Biosciences</td><td>553401</td><td></td></tr></tbody></table>

sınıf anahtarı rekombinasyon murin b hücreleri saf İndüksiyon ve değerlendirme

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Humoral bağışıklık, B hücreleri ve antikor salgılanmasını aracılığıyla tarafından yapılmaktadır bağışıklık sisteminin dalıdır. B hücre aktivasyonu üzerine, immünglobulin lokus bağlama kapasitesi ve salgılanan antikorlar effektör fonksiyonu değiştirmek için bir dizi genetik değişiklikler geçer. Bu süreç olduğu varsayılan IgM, IgG, IgA, veya IgE antikor izotip yerine sınıf anahtarı rekombinasyon (KSS) olarak bilinen bir genomik rekombinasyon olayı tarafından vurgulanır. Her izotip, böylece bağışıklık bakım KSS önemli hale farklı efektör fonksiyonlarına sahiptir. Immünglobulin lokus çeşitlendirilmesi enzim aktivasyonla indüklenen sitidinin deaminaz (AID) aracılığı ile. Bu süreci ayrıntılı olarak açıklayan bir şematik video online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). YARDIM faaliyet ve KSS yolağının genellikle B hücre fonksiyonu ve farelerde humoral bağışıklığın değerlendirilmesi incelenir. Bu raporda açıklanan protokol fare dalak ve sınıf diğer antikor isotypes (bkz. Tablo 1) IgG3 geçiş ikna etmek için bakteriyel lipopolisakkarit (LPS) ile sonraki stimülasyon B hücre izolasyonu bir yöntem sunuyor. Buna ek olarak, floresan hücre boyama boya Carboxyfluorescein succinimidyl ester (KAKE) uyarılan hücreler hücre bölünmesi, anahtarlama 1, 2 izotip için çok önemli bir süreç izlemek için kullanılır. YARDIM yönetmelik ve KSS oluştuğu mekanizması hala net değildir ve bu nedenle, in vitro sınıf anahtarı tayinlerde bu süreçlerin çeşitli fare modelleri test etmek için güvenilir bir yöntem sağlar. Bu testleri daha önce, knockout farelerde 3 kullanarak gen eksikliği bağlamında kullanılmaktadır . Ayrıca, in vitro B hücreleri anahtarlama, RNA demonte veya transgen ifade 4-6 gen ekspresyonu modüle viral transdüksiyon öncesinde olabilir . Deneyler bu tür veriler YARDIM aktivite, KSS reaksiyon çözünürlük ve fare antikor-aracılı bağışıklık anlayışımızı etkiledi.

Antijen maruz kalma ardından, aktive B hücreleri alt popülasyonlar farklı efektör fonksiyonları ile antikor isotypes üretmek için sınıf anahtarı rekombinasyon (KSS) olarak bilinen bir süreç geçmesi. Bu raporda açıklanan protokol KSS uyarılan ve nasıl analiz edilebilir açıklıyor<em&gt; In vitro</em&gt; B hücre fonksiyonu eğitim amaçlı.

Sınıf Anahtarı Rekombinasyon murin B Hücreleri Saf İndüksiyon ve Değerlendirme

Humoral immünite, B hücreleri tarafından sürdürülen ve antikor salgılanması yoluyla aracılık edilen bağışıklık sisteminin koludur. B hücresi aktivasyonu üzerine, ...

Humoral bağışıklık yanıtı sırasında, antijen tarafından aktive edilen B hücreleri çoğalır ve yanıt ilerledikçe antikorlar salgılar. Proliferasyonu ve sınıf değişimini değerlendirmek için varsayılan IgM antikor IZOTİPİ, daha çeşitli olan IgG, IgA veya IgE izotipleriyle değiştirilir. İn vitro splenik B hücreleri, manyetik hücre ayrıştırma yöntemi kullanılarak deneysel bir fareden izole edilir.Proliferasyonu izlemek için hücreler, bakteriyel LPS ile yapılan işlemle stimüle edilen floresan boya CFSE ile boyanır; LPS stimülasyonu aynı zamanda IgG3 izotipine sınıf değişimi de indükler ve bu durum, proliferasyonla birlikte akış sitometrisi ile izlenebilir. Bugün size saf splenik B hücrelerinin izolasyonu ve aktivasyonu için bir teknik göstereceğim. Bu teknik, in vitro sınıf değişim rekombinasyonu ve proliferasyonu incelemek için kullanılabileceği gibi, aktivasyonla indüklenen sitidin deaminazın fonksiyonu ve regülasyonu da dahil olmak üzere B hücresi immünitesi alanındaki temel soruları yanıtlamak için de kullanılabilir.İşleme, ötenazi uygulanmış bir fareyi %70 ethanol ile ıslatarak başlayın. Bağışıklık sisteminin tam olgunluğa eriştiğinden emin olmak için farenin sekiz ila 12 haftalık ol

induction-assessment-class-switch-recombination-purified-murine-b

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bir gen yapısı ve fonksiyonu analizi verimli bir...

B Hücreleri Rekombinant Retroviral Üretim ve Enfeksiyon

Biz aşırı ekspresyonu veya shRNA insan Ramos B-hücre hattı ve bu hücrelerin nasıl somatik hipermutasyon ölçmek için yapıları içeren. Retroviral veya lentiviral enfeksiyonları nasıl gerçekleştirileceği...

Spesifik genlerin aşırı ekspresyonu veya demonte sonra Ramos B Hücreleri somatik hipermutasyon Değerlendirilmesi

Farelerde sınıf anahtarı rekombinasyonunun in vitro analizi, B hücrelerinin yüzeyindeki Fc reseptörlerine bağlı sitofilik IgE molekülleri nedeniyle zordur.  Sitoplazmik floresan boyama için fiksasyon ve geçirgenlikten önce yüzeye bağlı IgE'nin tripsin aracılı bölünmesini kullanarak IgE tespiti için bir yöntem tarif ediyoruz.

Doğru Algılama Fare B Lineage Hücreleri IgE-ifade

BM12 lenfositlerinin bir C57BL/6 alıcısına transferi, sistemik lupus eritematozusun yerleşik bir modelidir. Burada, bu modeli kullanarak hastalığın nasıl başlatılacağını ve T foliküler yardımcı hücrelerin, germinal merkez B hücrelerinin ve plazma hücrelerinin akış sitometrisi ile nasıl karakterize edileceğini açıklıyoruz.

C57BL / 6 FARELERDE SLE bm12 İndüklenebilir Modeli (SLE)

Lenfositler, adaptif immün yanıtlarda ana oyunculardır. Burada, in vitro ve in vivo lenfosit aktivasyonunda istenen moleküllerin fizyolojik fonksiyonlarını belirlemek için bir lenfosit saflaştırma protokolü sunuyoruz. Açıklanan deneysel prosedürler, kontrol ve genetik olarak değiştirilmiş lenfositler arasındaki fonksiyonel kapasiteleri karşılaştırmak için uygundur.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

Epigenetik faktörler gen ekspresyonu modüle ve B hücre işlevi düzenleyen genetik programlarla etkileşim kurabilirsiniz. İçinde vitro B hücreli stimülasyon, qRT-PCR ve yüksek-den geçerek mikroRNA-sıra ve mRNA-sıra yaklaşımlar birleştirerek, B hücreleri miRNA ve gen ifadesinde epigenetik modülasyon analiz edebiliriz.

Genom çapında modülasyon mikroRNA ve mRNA'ların B hücreleri indüklenen geçirmek sınıf--düğme DNA rekombinasyon ve Plazma hücre farklılaşması içinde analiz HDAC inhibitörü-aracılı

Bu yazıda, biz T-bağımlı ve T-bağımsız immünglobulin (Ig) izotip yanıt ELISA kullanarak farelerde karakterize için bir protokol tanımlamak. Bu yöntem tek başına veya kullanılabilir akış ile birlikte sitometresi araştırmacılar T-bağımlı ve bağımsız T antijen bağışıklama takip farelerde B hücre-aracılı Ig izotip yanıtlarında farkları belirlemek için izin verir.

Timus bağlı ve timus bağımsız immünglobulin izotip yanıt Immunosorbent Assay enzim bağlı kullanarak farelerde karakterizasyonu

Burada in vivo B-1a hücre göçve lokalizasyonu incelemek için retroviral aşırı ekspresyon ve murine B-1a hücrelerinin benimsenen transferi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, donör B-1a hücre lokalizasyonunun niceliği veya donör hücre kaynaklı salgılanan faktörlerin benimsenme sonrası salgılanan faktörlerin analizi de dahil olmak üzere çeşitli downstream fonksiyonel tahliller için uzatılabilir.

Murine B-1a Hücrelerinde CXCR4'ün Retroviral Aşırı Ekspresyonu ve Hedeflenen B-1a Hücre Nakliiçin Kemik İliği ve IgM Üretimine Geçişinde Benimsenmiş Transfer

Burada, fare Peyer'in yamalarından germinal merkez B hücrelerini kullanarak immünoglobulin ağır zincir gen lokusu içindeki somatik hipermütasyonu ölçmek için bir test sunulmaktadır.

Fare Peyer Yamalarından Germinal Center B hücrelerinin JH4 intronunda Somatik Hipermütasyon Analizi

Burada periton, dalak ve kemik iliği dokularındaki murin immün B hücre bölmesinin akış sitometrisine göre heterojenliğinin basit bir analizinde açıklanmaktadır. Protokol diğer fare dokularına uyarlanabilir ve genişletilebilir.

Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Bu protokolde bağırsak mikrobiyota antijenine özgü T hücreli benimseyen transfer kolit modeli tanımlanmıştır. CD4+ T hücreleri CBir1 TCR transgenik farelerden izole edilmiştir. Bunlar, alıcı Rag1/- farelere aktarılan ve bağırsak iltihabına yol açan immünodominant bağırsak mikrobiyota antijeni CBir1 flagellin için özeldir.

CBir1 TCR Transgenik CD4+ T Hücrelerinin İmmün Yetmezlikçi Farelere Benimsenen Transferi ile Bağırsak İltihabının İndüksiyonu

Öğrenin, manyetik hücre ayrıştırma ve LPS ile uyarım kullanarak murine dalak B hücrelerinde sınıf anahtarı rekombinasyonunu in vitro analiz etme yöntemini. Bu teknik, B hücre bağışıklığı ve antikor üretimi mekanizmalarını araştırmak için güvenilir bir protokol sunar.

Sınıf Anahtarı Rekombinasyon murin B Hücreleri Saf İndüksiyon ve Değerlendirme

Daha fazla video keşfet