Sınıf Anahtarı Rekombinasyon murin B Hücreleri Saf İndüksiyon ve Değerlendirme

Humoral bağışıklık yanıtı sırasında, antijen tarafından aktive edilen B hücreleri çoğalır ve yanıt ilerledikçe antikorlar salgılar. Proliferasyonu ve sınıf değişimini değerlendirmek için varsayılan IgM antikor IZOTİPİ, daha çeşitli olan IgG, IgA veya IgE izotipleriyle değiştirilir. İn vitro splenik B hücreleri, manyetik hücre ayrıştırma yöntemi kullanılarak deneysel bir fareden izole edilir.

Proliferasyonu izlemek için hücreler, bakteriyel LPS ile yapılan işlemle stimüle edilen floresan boya CFSE ile boyanır; LPS stimülasyonu aynı zamanda IgG3 izotipine sınıf değişimi de indükler ve bu durum, proliferasyonla birlikte akış sitometrisi ile izlenebilir. Bugün size saf splenik B hücrelerinin izolasyonu ve aktivasyonu için bir teknik göstereceğim. Bu teknik, in vitro sınıf değişim rekombinasyonu ve proliferasyonu incelemek için kullanılabileceği gibi, aktivasyonla indüklenen sitidin deaminazın fonksiyonu ve regülasyonu da dahil olmak üzere B hücresi immünitesi alanındaki temel soruları yanıtlamak için de kullanılabilir.

İşleme, ötenazi uygulanmış bir fareyi %70 ethanol ile ıslatarak başlayın. Bağışıklık sisteminin tam olgunluğa eriştiğinden emin olmak için farenin sekiz ila 12 haftalık olması gerekir. Karın bölgesinin sol hipokondriyumundaki deri ve kas dokusu boyunca steril makasla bir insizyon yapın. Dalığı komşu dokulardan ayırmak için makas veya pens kullanın.

Ardından, örneği PBS içerisinde üç büyük parçaya bölün. Sonra, bir mililitrelik bir şırınga pistonunun kauçuk ucunu kullanarak, dalağı 70 mikronluk bir hücre süzgeci üzerinden nazikçe PBS'ye ezin. Öğütme hareketi yerine itme hareketi kullandığınızdan emin olun.

Öğütme işlemi, daha büyük proliferasyon gösteren hücrelerin yırtılmasına yol açabileceğinden, hücreleri beş dakika boyunca 350 G'den fazla olmayan bir hızda santrifüjleyerek çöktürün. Ardından pelletini PBS içinde yeniden süspande edin.

Resüspande edilen hücreleri, steril beş mililitrelik polistiren tüp içerisinde bir hemositometre kullanarak sayın. %5 normal sıçan serumu içeren PBS içerisinde mililitrede 1 × 10⁸ hücre konsantrasyonunda bir süspansiyon hazırlayın. Her tüpe maksimum iki mililitre eklenebilir.

Ardından, her mililitre hücre için 50 µL EP negatif seçilim fare B-hücresi zenginleştirme kokteyli ekleyin. Sonra tüplerin kapaklarını kapatın ve 15 dakika boyunca buzdolabında bekletin.

Her bir mililitre hücre için 100 µL EP biotin seçim kokteyli ekleyin. Tüplerin kapağını kapatın ve biotin seçim kokteyli ile inkübasyonun ardından 15 dakika boyunca buzdolabında bekletin. EP manyetik nanopartikülleri ile biotin seçim kokteyli karışımını birleştirin ve her bir mililitre hücre için 100 µL ekleyin. Karışımı pipetleyin, tüplerin kapağını kapatın ve beş dakika boyunca buzdolabında bekletin.

Çözeltiyi PBS ile 2.5 mililitreye tamamlayın ve bir cept mıknatısına yerleştirin. Beş dakika sonra, mıknatıstaki tüpü ters çevirin ve içeriği hızla yeni bir polistiren tüpe boşaltın. Negatif seçilen hücreler tüp duvarlarına manyetik olarak bağlanacağından tüpü sallamayın. Hücre süspansiyonunun saflığını daha da artırmak için, hücrelerin bulunduğu yeni tüpü beş dakika boyunca mıknatiste tutun ve ardından tekrar yeni bir tüpe boşaltın.

Bu adım, genel hücre geri kazanımını azaltabilir. B hücresi saflığı, B hücresi yüzey belirteçlerinin akış sitometrisi analizi ile değerlendirilebilir. Zenginleştirme sonrasında, hücrelerin %95'inden fazlası B two 20 pozitif olmalıdır.

İzole edilen hücreleri, steril dimetil sülfoksit içinde dilüe edilmiş 5 mM'lık CFSE boya stok çözeltisinden, nihai konsantrasyonu mililitre başına 1 milyon hücre olacak şekilde %0,1 BSA eklenmiş ılık PBS içinde yeniden süspande edin. Tüpteki her bir mililitre hücre için iki µL ekleyin. CFSE, stimüle edilen hücrelerin hücre bölünmesini izlemek için kullanılır.

İzotip değişimi için kritik bir süreç. Primer B hücrelerinin boyanması için 10 micromolar final konsantrasyonu optimaldir. Karanlıkta, 37 degrees Celsius'de 10 dakika boyunca inkübe edildi.

CFSE'nin ışığa duyarlı olduğunu ve mümkün olduğunca karanlıkta tutulması gerektiğini unutmayın. İnkübasyonun ardından, hücrelerinize eşit hacimde sığır buzağı serumu ekleyip buz üzerinde inkübe ederek boyamayı söndürün. Hücreleri yıkamak için tüpleri kültür ortamı ile doldurun; sığır buzağı serumunun viskozitesini dengelemek ve hücrelerin bir pelet oluşturmasını sağlamak için ortam hacminin en az beş katı kadar ekleme yapılmalı, ardından 350 G'de santrifüj edilmelidir. Hücreleri kültür ortamında iki kez daha yıkayın; hücreler artık stimülasyon için hazırdır.

RPMI 1640'ı %10 fetal bovin serum ve 50 micromolar Beto me capita ethanol ile takviye ederek in vitro B hücresi kültür ortamı hazırlayın. Ardından, son konsantrasyonu 50 micrograms per milliliter olacak şekilde LPS ekleyerek stimülasyon ortamı hazırlayın. Stimülasyon ortamından 125 microliters miktarında aliquot'ları düz tabanlı 96 kuyucuklu bir doku kültürü plağının her bir kuyucuğuna paylaştırın.

LPS içermeyen kültür ortamındaki CFS E boyalı B hücrelerini, mililitre başına 3,2 x 10⁶ hücre olacak son konsantrasyonda hazırlayın. Hücre süspansiyonundan 125 µL'yi stimülasyon ortamı içeren kuyucuklara ekleyin ve pipetleme yoluyla hafifçe karıştırın. Her bir kuyucuk şu anda 25 µg/mL son LPS konsantrasyonunda 400.000 hücre içermektedir.

Bu, optimal hücre proliferasyonu ve sınıf değişimi seviyeleri sağlar. Bu değerlerde istendiği takdirde değişiklikler yapılabilse de, hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında 72 ila 96 saat boyunca inkübe edin. 48 saat sonra, sınıf değişimini incelemek için mikroskop altında büyük, proliferasyon halindeki B hücresi kümeleri net bir şekilde görülecektir.

Spesifik olmayan antikor boyanmasını önlemek için hücreleri inkübatörden çıkarın ve bir mililitre boyama tamponu ile iki kez yıkayın. Hücreleri 350 G'de santrifüjleyerek çöktürün. Ardından hücreleri, milyon hücre başına %5 normal fare serumu ve bir mikrogram FC blok içeren 100 mikrolitre boyama tamponu içerisinde yeniden süspande edin ve yıkama yapmadan buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. Milyon hücre başına bir mikrogram oranında floresan işaretli anti-US IgG üç antikoru ekleyip buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, hücreleri iki kez yıkayın ve iki ile 300 mikrolitre arasındaki boyama tamponu içerisinde yeniden süspande edin.

Hücreler artık akış sitometrisi ile değerlendirilmeye hazırdır. CFSE, bir argon iyon lazeri ile 492 nanometrede optimum şekilde uyarılır ve 517 nanometrede emisyon yapar. IgG üç antikorunun uyarılma ve emisyon spektrumu, konjuge olduğu floresan boyaya bağlıdır.

Manyetik zenginleştirmenin ardından, hücre süspansiyonu ayırt edilemeyen küçük dairesel hücrelerden oluşan homojen bir popülasyon gibi görünmelidir. 48 ila 72 saatlik stimülasyondan sonra, genişlemiş proliferasyon gösteren hücrelerin izole kümeleri net bir şekilde görülecektir. Proliferasyon göstermeyen hücrelerin büyük bir kısmı, apoptoza girdikleri için küçük ve granüler görünecektir.

CSR normalde, hücrelerin çoğunun ölmeye başlamasından önce, stimülasyondan 72 ila 96 saat sonra en yüksek seviyelerde tespit edilebilir. Bu aşamada, hücreler bir dizi hücre bölünmesinden geçmiş olmalı ve anahtarlanmış hücreler sonraki yavru hücre popülasyonunda ortaya çıkmalıdır. Bu protokolleri takiben, herhangi bir genin bir ID fonksiyonu ve sınıf değiştirme rekombinasyonu süreci üzerindeki etkisini incelemek için rna, AI aracılı gen nakavt gibi diğer teknikler kullanılabilir.