Name: RNAi Tarama için ilgilendim Ana Faktörler Vaccinia Virüs Enfeksiyonu Drosophila Hücre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-25T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Keşfedin yüksek verimli RNAi tarama yöntemini, Drosophila hücreleri kullanarak Vaccinia virüsü enfeksiyonuna katkıda bulunan konakçı faktörlerini belirlemek için. Bu teknik, immunofloresan mikroskopi ile kantitatif analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIAID (R01AI074951 U54AI057168) ve SC Penn Genom Frontiers Enstitüsü hibeleri ile desteklenen; NIH T32HG000046 TSM; NIH T32GM07229 ve T32AI007324 LRS.

Bölüm 1: 384 Şey Tabaklar RNAi <ol><li> Tarama için kullanılan reaktifler Standardizasyon esastır. Biz bireysel birçok Schneider medya, fetal sığır serumu, ve boyama reaktifleri test edin. Sonra biz, tüm ekranı için aynı çok kısım ve kullanın. </li><li> Herhangi bir tahlil için, salt biyolojik en müsait olduğunu belirlemek için birkaç farklı hücre hatları test etmek en iyisidir. Biz genellikle S2 DRSC hat kullanın. </li><li> 25 ° C tam Schneider medya Drosophila hücreleri büyütün. <ol class="lalpha"><li> Schneider medya </li><li> % 10 ısı inaktive FBS </li><li> 1X L-glutamin </li><li> 1X Kalem / strep antibiyotik </li></ol></li><li> Drosophila hücreleri yarı yapışık ve her dört günde bir, matara kapalı hücreleri pipetleme ve taze bir balona 01:10 hücreleri seyreltilmesi trypsinization olmadan geçişli. Hücreler deneyler için log fazı olmalıdır. </li><li> Plaka-plaka ve günden güne değişkenlik tüm sıvı eklemeleri için çok iyi plakaları otomatik sıvı taşıma kullanımı ile en aza indirilmiştir. Biz WellMate (Matrix) kullanın. </li><li> WellMate tüp hazırlayın. <ol class="lalpha"><li> Sprayhood ve% 70 etanol ile WellMate. </li><li> % 70 etanol ile ambalaj ve sprey tüp çıkarın. </li><li> WellMate pozisyon dağıtım boru kaset takın. </li><li> 25 ml% 70 etanol ile Başbakan boru. </li><li> 15 dakika, sonra başbakan başka bir 25 mL etanol etanol içinde tüp sterilize edin. </li><li> 50 ml steril PBS ile astarlanırsa boru durulayın. </li></ol></li><li> Şişeyi ve sayısı hücreleri yerinden oynatın. Pelet hücreleri (300xg, 5 dk)% 25 daha fazla olduğunu. Ortalama numaralı seribaşı hücrelerinin sayısı tahlil uzunluğuna göre optimize edilmesi gerekir. Otomatik görüntü analizi yaparken, hiçbir hücre topaklanma ile tek tek tabakalı bir görüntü segmentasyonu için idealdir. </li><li> 1.7x10 6 hücre / ml serum serbest Schneider medya pelet hücreleri tekrar </li><li> Biz 384 kuyucuğu 250ng/well bir konsantrasyonda dsRNA piyasada mevcut kütüphanesi ile önceden aliquoted ekran gerçekleştirmek. Her plaka birkaç kuyu elle eklenir, kontroller için boş bırakılır. Biz bir negatif kontrol olarak lusiferaz dsRNA kullanın. Biz güçlü bir RNAi kontrol olarak karşı dsRNA Konu (dIAP) kullanın. Dramatik hücre ölümü bu anti-apoptotik faktör sonuçlarının yıkmak ve aşağı knock kalitesini değerlendirmek için hızlı bir görsel yoludur. Son olarak, biz, bizim tahlil okuma kullanarak viral enfeksiyon inhibe doğrulamak için bir pozitif kontrol olarak, bu durumda beta-galacosidase viral muhabiri karşı dsRNA kullanabilirsiniz. Hücre tohumlama, kısım 1 ul dsRNA kolay görünüm için izin vermek için iyi köşeye zamanda plaka dsRNA lekelenme, daha sonra hücrelerin eklemeden önce kuyunun altındaki (300xg, 1 dak.) Üzerine çift iplikçikli santrifüj. </li><li> Her bir kuyu için yukarıda hazırlanan 10 mcL hücre eklemek için WellMate kullanın. </li><li> 300xg, 1 dakika santrifüj plakalar üzerine hücreleri Spin. </li><li> 45 dakika boyunca 25 ° C inkübatörde inkübe edin. </li><li> 20 mcL tam Schneider medya ekleyin ve 300xg, 1 dakika santrifüj. </li><li> Nemlendirilmiş Tupperware kapları koyun tabak, suda ıslatılmış kağıt havlu ile kaplı. 384 hacmi küçük, böylece, buharlaşma da kenarına kuyuların okumaları artefakt değişikliklere yol açabilir biyoloji, büyük etkileri olabilir. Bunu aşmak için, tabak, yüksek nem altında tutulmalıdır. </li><li> Sağlam demonte izin vermek için üç gün boyunca inkübe edin. Ortamı değiştirmek veya bu süre içinde nemlendirilmiş kapları açmak için gerek yoktur. </li></ol> Bölüm 2: Vaccinia Virüs ile Enfekte <ol><li> 15 dakika boyunca Quatricide sterilize edilen çok-kanallı aspiratör, daha sonra% 70 etanol içinde durulayın. </li><li> Yukarıda açıklandığı gibi WellMate hazırlayın. </li><li> Serum serbest medya tam bir medya 01:05 seyreltilmesi ile enfeksiyon için 2% FBS ile Schneider medya hazırlayın. </li><li> 0,8 um şırınga aracılığıyla hücresel enkaz kaldırmak veya saflaştırılmış virüs kullanmak için filtre Filtre ham virüs stokunun. </li><li> 2 enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) elde etmek için% 2 serum Schneider medya vaccinia virüs sulandırınız. </li><li> WellMate boru PBS çıkarın ve tüp hava kabarcıkları serbest kadar seyreltilmiş virüs başbakan. </li><li> DsRNA ile tedavi edilen Drosophila hücreleri plakaları medya hafifçe kaldırmak için sterilize çok kanallı aspiratör ve vakum manifoldunun kullanın. </li><li> WellMate kullanarak plakaları üzerine de başına 30 mcL virüs koyun. </li><li> 300xg plakaları 1 dakika santrifüjleyin. </li><li> WellMate boru sterilize edin. 25 mL% 10 blea ile Başbakanch, 10 dakika bekleyin ve bir 25 ml% 10'luk çamaşır suyu ile başbakan. </li><li> Başbakan tüp 50 ml su ile 50 ml% 70 etanol ile izledi. Ambalajın boru dönün. </li><li> Nemlendirilmiş Tupperware konteyner plakaları geri dön. 48 saat boyunca 25 ° C'de inkübe edin. </li></ol> Bölüm 3: Boyama Tabaklar <ol><li> 10 dakika için 15 mcL% 4 formaldehit / PBS plakaları sabitleyin. Sıvı bir multi-kanal aspiratör ve vakum manifoldunun her adımı kullanarak kaldırılır. Plakalar, steril ekipman giderildi var ve reaktifler artık gerekli değildir. </li><li> Kaldır düzeltmek ve 30 mcL PBST (PBS +% 0,1 Triton-X) eklemek için kullanabilirsiniz WellMate. Ve tekrar 10 dakika inkübe edin. Tüp sterilize edilmelidir gerekmez hariç İşlet, yukarıda açıklandığı gibi WellMate. </li><li> Vaccinia enfeksiyonu saptamak için erken / geç vaccinia organizatörü tarafından yönlendirilen bir β-galaktosidaz muhabiri kullanın. </li><li> 10 dakika boyunca sıvı ve inkübe blok hücreleri (2% BSA ile PBST) çıkarın. </li><li> Blok primer antikor sulandırınız, sıvı kaldırmak ve her biri de çok kanallı kullanarak tekrar pipet (Matrix) 15 mcL antikor ekleyin. </li><li> Levhalar (300xg, 1 dak) Spin, net bir etiket ile kaplayın ve 4 ° C gecede inkübe. </li><li> Primer antikor çıkarın ve PBST 3 kez, her biri 10 dakika kuyuların yıkamak için WellMate kullanın. </li><li> Floresan ile işaretlenmiş sekonder antikor (FITC) ve blok içinde leke nükleer seyreltin ve multi-kanal tekrar pipet kullanarak kuyulara 15 mcL ekleyin. </li><li> Inkübe plakalar 1 saat oda sıcaklığında, ışıktan korunmalıdır. </li><li> Kuyu PBST 3 kez, WellMate kullanarak her biri 10 dakika yıkayın. </li><li> 4 net etiket, kapak ve mağaza ile plaka Seal ° C üç hafta kadar. </li></ol> Bölüm 4: Görüntüleme ve Görüntü Analiz <ol><li> 20X büyütmede otomatik bir mikroskop görüntü tabak kullanın. </li><li> Toplam çekirdekleri (DAPI) ve enfekte olmuş hücreleri (FITC) görüntüleri yakalayın. Dinamik aralık maksimize etmek için, her kanal için ayrı ayrı pozlama süresi optimize edin. </li><li> Beklenen odak düzlemi altındaki ve üstündeki uçakları yayılan görüntüleri, arayla 1um, Z yığını alarak otomatik odaklama fonksiyonu ince ayar yapın. Optimal odak düzlemli bulunmaktadır, buna göre otomatik odaklama ayarlarını. </li><li> Resim tüm plaka, Hoechst kanal (DAPI) ve virüs kanal (FITC) başına en az üç fotoğraf çekmek. Bir bütün olarak iyi temsil eden görüntüler yakalamak için iyi bir içinde birkaç farklı bölgelerden gelen siteleri seçin. </li><li> Segment resmi bir dergide yazmak ve her plaka için nükleer boyanma (toplam hücreleri) ve enfeksiyon (FITC) pozitif hücrelerin toplam sayısını hesaplamak için Kont Çekirdekler modülleri kullanmak için yazılım MetaXpress kullanın. </li><li> Yüzde enfeksiyon (100 * FITC pozitif / toplam hücre) hesaplayın ve dönüşümü giriş. </li><li> Adayları belirlemek için, her plaka medyan ve çeyrekler açıklığı dayalı sağlam bir Z skoru kullanın. Bu yöntem aykırı ve nonsymmetric veri duyarsız ve böylece, hatta zayıf veya orta derecede hit 10 tanımlanması daha fazla güç sağlar. Her plaka için, medyan log-dönüştürülmüş verileri çıkarılır. Daha sonra elde edilen değerler 0.74 kez çeyrekler açıklığı (75 persentil ve 25. yüzdelik değerleri arasındaki fark) tarafından ayrılır. 0,74 faktörü yaklaşık bir standart normal dağılım için kullanılır. </li><li> Sağlam Z skoru plaka medyan standart sapma mesafe bir ölçüsüdür. Örneğin, 2 sağlam bir Z-skoru iyi% enfeksiyonu plaka medyan veya p &lt;0.05 ~ 2 standart sapma gösterir. </li><li> Hücre sayısı, sitotoksik adayları belirlemek için analiz edin. Nükleer sayar sağlam Z skoru hesaplayın. Adaylar ile sağlam bir yinelenen ekranlarında Z &lt;-2 sitotoksik olarak kabul edilir. </li><li> Sitotoksisite olmadan&gt; yinelenen ekranlarında 2 veya &lt;-2 (p &lt;0.0025) yüzde enfeksiyon için sağlam bir Z skoru Wells birincil ekran potansiyel aday olarak kabul edilir. </li><li> Olumlu adayların bağımsız reaktifler kullanılarak doğrulanır. dsRNAs mRNA başka bir bölgeye ilgi genlerin karşı oluşturulan ve yukarıdaki gibi test edilmektedir. </li><li> Iki bağımsız dsRNAs aynı fenotipe sahip olduğunuz bu genlerin daha fazla çalışma için kabul edilebilir. </li></ol> Bölüm 5: Temsilci Görüntüler ve Enfeksiyon Oranları yorumlanması <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 bulaşmamış kuyu iyi bulaşmış bir temsilcisi immünofloresan mikroskobu ile ölçülen vaccinia ifade beta-galaktosidaz (βgal) protein, pozitif boyanma hücreleri içeren, vaccinia virüs proteinler için herhangi bir boyama görünmüyor.Virüs = yeşil, çekirdeklerin = mavi. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Otomatik görüntü analiz yazılımı, kullanıcı tarafından belirlenen parametreler kullanılarak her görüntü enfeksiyon rakamlarla . Bir temsili görüntü, hücre çekirdekleri ve viral antijen eksprese eden hücrelerin sayısı toplam sayısı, büyüklüğü ve yerel arka plan boyanma üzerinde boyanma yoğunluğu dayanan sayılır. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 iplik (dIAP) demonte hedef genlerin sağlam RNAi tükenmesi için bir pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir. Bu anti-apoptotik faktör demonte dramatik hücre ölümüne yol açar. Çekirdekler = mavi. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 lusiferaz demonte enfeksiyon çift iplikli RNA tedavi etkisi için bir negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. Lusiferaz tükenmesi, tedavi edilmezse hücrelere göre enfeksiyon üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Virüs = yeşil, çekirdeklerin = mavi. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 βgal protein demonte enfeksiyon okundu olarak tahlil βgal protein düzeyleri kullandığından beri, bir enfeksiyon azaltılması için bir pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir. Enfekte hücrelerin yüzdesinde bir azalma βgal sonuçlar tükenmesi. Virüs = yeşil, çekirdeklerin = mavi. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6, enfekte hücrelerin yüzdesinde bir azalma hücresel faktör Rab5 sonuç demonte . Rab5 endositoz katılmak için bilindiğinden, bu faktör, büyük olasılıkla vaccinia virüs giriş katkıda bulunmaktadır. Bu ekran bir örnek uç temsil eder. Virüs = yeşil, çekirdeklerin = mavi.

<ol><li>Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+high-throughput+RNAi+screens+in+cultured+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells.</a> Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).</li>
<li>Chotkowski, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus+infection+of+Drosophila+melanogaster+induces+a+protective+RNAi+response%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response.</a> Virology. 377, 197-206 (2008).</li>
<li>Blondel, D., Petitjean, A. M., Dezelee, S., Wyers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+in+Drosophila+melanogaster+cells%3A+regulation+of+viral+transcription+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus in Drosophila melanogaster cells: regulation of viral transcription and replication.</a> J Virol. 62, 277-284 (1988).</li>
<li>Sessions, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+insect+and+human+dengue+virus+host+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of insect and human dengue virus host factors.</a> Nature. 458, 1047-1050 (2009).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+RNAi+screening+in+Drosophila+S2+cells%3A+what+have+we+learned+about+host-pathogen+interactions%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic RNAi screening in Drosophila S2 cells: what have we learned about host-pathogen interactions?</a> Curr Opin Microbiol. 11, 262-270 (2008).</li>
<li>Hao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+RNAi+screen+identifies+host+genes+important+for+influenza+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication.</a> Nature. 454, 890-893 (2008).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPI+activity+coupled+with+fatty+acid+biosynthesis+is+required+for+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">COPI activity coupled with fatty acid biosynthesis is required for viral replication.</a> PLoS Pathog. 2, e102-e102 (2006).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+reveals+a+specific+sensitivity+of+IRES-containing+RNA+viruses+to+host+translation+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen reveals a specific sensitivity of IRES-containing RNA viruses to host translation inhibition.</a> Genes Dev. 19, 445-452 (2005).</li>
<li>Moser, T. S., Jones, R. G., Thompson, C. B., Coyne, C. B., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Kinome+RNAi+Screen+Identified+AMPK+as+Promoting+Poxvirus+Entry+through+the+Control+of+Actin+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A Kinome RNAi Screen Identified AMPK as Promoting Poxvirus Entry through the Control of Actin Dynamics.</a> PLoS Pathog. 6, e1000954-e1000954 (2010).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells%3A+a+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).</li>
</ol>

Drosophila genom RNAi tarama viral enfeksiyon hücresel bileşeni incelenmesi için sağlam ve etkili bir yöntem sağlar. Ev sahibi içsel immün yanıt bileşenleri ve terapötik hedefleri temsil edebilir viral replikasyon için gerekli ana protein faktörleri tanımlamak için kullanılır. Drosophila hücreleri, bir çok memeli virüs bulaştırmak. Bir ekran, tahlil yapmadan önce dikkatli bir hücre tipi, hücre sayısı ve enfeksiyon seviyesi için optimize edilmiş olmalı ve 11 pozitif ve negatif viral ve hücresel hedefleri de dahil olmak üzere kontrol edilmelidir. Önce tarama testinin dinamik aralığı en üst düzeye çıkarmak için pozitif ve negatif kontroller arasında yeterli ayırma sağlamak için önemlidir. Ekran yapıldıktan sonra, adaylar, ev sahibi mekanizmaları enfeksiyona katkıda bulunan belirlemek için işlevsel kategoriler halinde bölünmüş olabilir. Vaccinia gibi memeli virüsler için, RNAi memeli homologları katkısı ikincil analizi bir parçası olarak tespit edilmelidir. Birlikte ele alındığında, bu güçlü tarama yöntemlerinin bize virüsler, konak hücreleri ile etkileşimde bulunduğu karmaşık mekanizmaları anlamak için izin verir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Hücre kültürü&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s besiyeri</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11720</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 100X</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/streptomisin (pen/strep)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tarama&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genom çapında dsRNA kütüphanesi</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>384 kuyucuklu plakalar, şeffaf tabanlı siyah</td><td>Corning</td><td>3712</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum sızdırmazlık folyoları</td><td>Corning</td><td>6569</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf sızdırmazlık folyoları</td><td>Denville Scientific</td><td>B1212-4</td><td></td></tr><tr><td>Well Mate</td><td>Matlab</td><td>201-10001</td><td></td></tr><tr><td>24 pinli manifold</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-101</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Floresan işaretli sekonder antikorlar</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageXpressMicro otomatik mikroskop</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress görüntü analiz yazılımı</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rnai tarama için ilgilendim ana faktörler vaccinia virüs enfeksiyonu drosophila hücre

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Yalnızca virüs, insan hastalığının doğal salgın hastalıkların neden olabilir, ancak biyoterörizm onların potansiyel kullanımı da bir endişe, viral patojenlerin önemli bir kamu sağlığı tehdidi temsil eder. Hücresel faktörlerin daha iyi anlaşılması, çok ihtiyaç duyulan terapötikler etkisi enfeksiyon gelişimini kolaylaştıracağını söyledi. Çeşitli organizmaların tam genomu sıralama ile birleştiğinde RNA enterferans (RNAi) teknolojisi son gelişmeler genom, hücre tabanlı kayıp fonksiyon-ekranlar optimizasyonu yol açmıştır. Drosophila hücreleri nedeniyle genom ölçekli ekranlar özellikle mükellef bu sistemi 1 RNAi kolaylığı ve verimliliği. Önemlisi, virüslerin Drosophila hücreleri, tıbbi ve tarımsal önemi 2,3,4 memeli virüslerin sayısı da dahil olmak üzere geniş bir yelpazede bulaşabilir. Drosophila Önceki RNAi ekranları giriş, çeviri ve RNA çoğaltma 5 virüs enfeksiyonu da dahil olmak üzere çeşitli adımlar için gerekli konakçı faktörleri tespit ettik. Ayrıca, Drosophila hücre kültürü viral replikasyon için gerekli olan hücresel faktörlerin birçoğu da bu virüsler 4,6,7,8, 9 ile enfekte insan hücrelerinde sınırlayıcı. Bu nedenle, viral enfeksiyon sırasında eş-tarafından tercih ana faktörlerin belirlenmesi, antiviral tedavi için yeni hedeflere sunar. Burada bir örnek olarak vaccinia virüs kullanarak, viral enfeksiyon yer hücresel faktörleri belirlemek için bir yüksek verim RNAi ekran için genelleştirilmiş bir protokol mevcut.

Viral enfeksiyon katılan Roman konakçı faktörleri fonksiyonu RNAi tarama hücre tabanlı genom zarara tespit edilebilir. A<em&gt; Drosophila</em&gt; Hücre kültürü modeli RNAi kolaylığı ve verimliliği nedeniyle bu yaklaşım, özellikle mükellef. İşte biz bu tekniği kullanarak göstermek<em&gt; Vaccinia</em&gt; Örnek olarak virüs.

RNAi Tarama için ilgilendim Ana Faktörler Vaccinia Virüs Enfeksiyonu Drosophila Hücre

Viral patojenler ciddi bir halk sağlığı tehdidi oluşturmaktadır; virüsler yalnızca insan hastalıklarının doğal epidemilerine yol açmakla kalmaz, aynı zamanda ... içindeki potansiyel kullanımları da...

Bu prosedürün genel amacı, virüs enfeksiyonunda rol oynayan konak faktörlerini belirlemek için yüksek kapasiteli RNAI taramasını kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle 384 kuyucuklu plakalarda RNAI ile ilgilenilen genlerin azaltılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, hücreler ilgili virüs ile enfekte edilir, viral proteinler için boyanır ve immünofloresan mikroskopi ile viral enfeksiyon düzeyi ölçülür.Son olarak, doğrulama ve ileri çalışmalar için aday genleri belirlemek amacıyla otomatik görüntü analizi gerçekleştirilir. Nihayetinde, immünofloresan mikroskopi kullanılarak enfekte hücrelerin yüzdesinin nicelendirilmesi yoluyla enfeksiyondaki değişiklikleri gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu durum, viral enfeksiyonda yer alan yeni hücresel faktörlerin keşfedilmesine olanak sağlar.Bu yöntem virüs-konak etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilse de, ilgilenilen hücresel sürecin görsel bir okumasından fayda sağlayacak herhangi bir sistemin incelenmesinde de uygulanabilir. Bu yöntemi yeni kullanan kişilerin, değişkenliği minimize ederken tekrarlanabilir enfeksiyonlar elde etmenin önemli ölçüde optimizasyon gerektirmesi nedeniyle dik bir öğrenme eğrisi ile karşılaşmaları gerekir. Sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için, tüm bir tarama boyunca kullanılan her bir reaktif için tek bir lot numarası kullanılması esastır. S 2D RSC drosophila hücrelerini ve tamamlanmış Schneider ortamını 25 °C'de büyütün; hücreler log fazında olmalıdır.Laminar akışlı kabinde yapılacak deneyler için, yarı yapışkan hücreleri yoğun pipetleme yaparak flasktan ayırın. Hemositometre ile sayım yaptıktan sonra, deney için gereken hücrelerin %125'ini 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 300 G'de beş dakika boyunca pelletleyin. Süpernatantı aspire edin ve pelleti, serumsuz Schneider besiyerinde 1,7 x 10⁶ hücre/ml nihai konsantrasyona gelecek şekilde resüspande edin.Sterilize edilmiş ve hazırlanmış bir otomatik sıvı taşıma sistemi kullanın. Burada, plaka değişkenliğini en aza indirmek için matris kuyu eşleşmesi uygulanmıştır. Her kuyuğuna 250 nanogram çift zincirli RNA önceden eklenmiş 384 kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Hücreleri 300 G'de bir dakika boyunca plakalara çöktürün.Plakları 25 °C'de 45 dakika inkübe edin. Her birine 20 µL tamamlanmış Schneider besiyeri ekleyin. Buharlaşmanın etkilerini en aza indirmek için besiyerini 300 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün.Plakaları ve su emdirilmiş kağıt havlularla astarlanmış nemlendirilmiş sızdırmaz kapları saklayın. BSL 2 biyogüvenlik kabininde, güçlü knockdown etkilerinin oluşması için 25 °C'de üç gün boyunca inkübe edin. Hücreleri enfekte etmeden önce, ham vaccinia virüsü stokunu 0,8 micron'luk bir şırınga filtresinden süzün.Hücresel döküntüleri uzaklaştırmak için. Enfeksiyon çokluğunu elde etmek amacıyla virüsü %2 serum içeren Schneider ortamında seyreltin. Kısaltılmış MOI değeri iki prime'dır.Hava kabarcıkları tamamen gidene kadar sterilize edilmiş kuyu, seyreltilmiş virüs ile doldurulur. Vakum manifolduna bağlı sterilize edilmiş çok kanallı bir aspiratör kullanarak, çift zincirli RNA ile işlem görmüş drosophila hücrelerinin bulunduğu plakalardaki besiyeri nazikçe uzaklaştırılır. Her bir plakaya 30 µL seyreltilmiş virüs eklenir.Plakları 300 G'de bir dakika boyunca santrifüj edin. Plakları nemlendirilmiş kaba geri yerleştirin ve 25 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. BSL 2 biyogüvenlik kabininde, plaktaki besiyerini aspire edin.Ardından, her plakaya 15 µL %4'lük formaldehit sabitleyici eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Kuyucukları oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Sıvıyı çok kanallı bir aspiratörle uzaklaştırın.Her bir kuyucuğa 30 µL PBST eklemek için WELLMADE'i kullanın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Aynı yöntemle ikinci bir 10 dakikalık PBST yıkaması gerçekleştirin.İnkübasyon bloğundan sonra sıvıyı uzaklaştırın ve 2% VSA bloklama çözeltisi içeren 30 µL PBST ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Her birine bloklama çözeltisi ile seyreltilmiş 15 µL primer antikor eklemek için çok kanallı tekrarlayıcı pipet kullanın.Plakaları 300 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Her plağı şeffaf sızdırmaz film ile kapatın ve dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Hücreleri PBST ile üç kez, her yıkama 10 dakika sürecek şekilde yıkamak için well mate ve çok kanallı aspiratör kullanın.Her bir kuyucuğa nükleer boyalı, floresan işaretli sekonder antikorun 15 µL'sini eklemek için çok kanallı pipet kullanın. Işıktan korumak için kuyucukları folyo ile kapatın ve plakaları oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Hücreleri, daha önce yapıldığı gibi her yıkama 10 dakika sürecek şekilde üç kez PBST ile yıkayın.Hücrelere 30 µL PBST ekleyin ve şeffaf tavanla kapatın. Film ile kaplayıp folyo ile örtün. Otomatik mikroskopta görüntüleme yapmadan önce, kapatılmış plakaları dört °C'de üç haftaya kadar saklayın.Enfekte edilmemiş kuyucuklarda vaccinia virüsü proteinleri için herhangi bir boyanma görülmezken, temsili bir enfekte kuyucuk, immünofloresan mikroskopi ile ölçüldüğünde vaccinia tarafından eksprese edilen beta GCSE proteinleri için pozitif boyanma gösteren hücreler içerir. Otomatik görüntü analiz yazılımı, kullanıcı tarafından belirlenen parametreleri kullanarak her görüntüdeki enfeksiyon miktarını nicelleştirir.Temsili bir görüntüde, toplam hücre çekirdeği sayısı ve viral antijen eksprese eden hücrelerin sayısı, yerel arka planın üzerindeki boyama boyutuna ve yoğunluğuna göre sayılır. thread'in boyamayla belirlenen knockdown'ı, hedef genlerin güçlü RNAi depleksiyonu için pozitif kontrol görevi görür. Bu anti-apoptotik faktörün knockdown'ı, dramatik hücre ölümüne yol açar.Luciferase susturulması, çift zincirli RNA uygulamasının enfeksiyon üzerindeki etkisine karşı negatif kontrol olarak kullanılır. Luciferase eksikliğinin, tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla enfeksiyon üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Beta galakto proteinin susturulması ise enfeksiyondaki azalma için pozitif kontrol görevi görür.Analiz, enfeksiyon göstergesi olarak beta galakto protein seviyelerini kullandığından, beta galakto eksilmesi enfekte hücre yüzdesinde bir azalmaya yol açar. Hücresel faktör RAB five'in nakavt edilmesi, enfekte hücre yüzdesinde bir azalmaya neden olur. RAB five'ın endositoza katıldığı bilindiğinden, bu faktör muhtemelen vaccinia virüsünün girişi üzerinde etkili olmaktadır.Bu videoyu izledikten sonra, RNAi gerçekleştirmek, vaccinia virüsü ile enfekte etmek, boyama görüntülemesi ve 384 kuyucuklu plakaların analizi dahil olmak üzere, viral enfeksiyona katkıda bulunan konak faktörlerini belirlemek için drosophila'da RNAi taramasının nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Viral çalışmaların son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Canlı virüsler yalnızca BSL 2 biyosafety kabininde açılmalı ve canlı virüsle temas eden her şey, bertaraf edilmeden önce %10 çamaşır suyu ile sterilize edilmelidir.

rnai-screening-for-host-factors-involved-vaccinia-virus-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

RNA girişim gen fonksiyonu analiz etmek için çok etkili olduğu...

DsRNA Enjeksiyon RNAi Girişim içine Drosophila Embriyolar

Biz protein ekspresyonu ve lokalizasyonu postembryonic düzenleyiciler tanımlamak için duyarlı bir yöntem...

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

Bu videoda, yetişkin erkek Drosophila sineklerine pozitif anlamlı, tek sarmallı bir RNA virüsünün nano enjeksiyonunu gerçekleştirmek ve ardından enfeksiyon nedeniyle başlatılan antiviral yanıtları incelemek için bir prosedürü açıklıyoruz. Polimeraz zincir reaksiyonu analizi, enfekte sineklerde RNA interferansı ve JAK/STAT sinyali dahil olmak üzere bağışıklık yanıt yollarının aktivasyonunu gösteren spesifik genlerin yukarı regülasyonunu tanımlar.

Yetişkin Sineklerde Konak-Virüs Etkileşimlerini İncelemek için İntratorasik Viral Nano Enjeksiyon

Bu yayının amacı, görselleştirmek ve Drosophila çıkarılan RNA bir Geliştirilmiş Northern Blot protokolünün ameliyat adımları görüşmek embriyolar, hücreleri ve dokuları melanogaster etmektir. Bu protokol küçük RNA türünün etkin tespiti için özellikle yararlıdır.

Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş Drosophila melanogaster

Burada bir iletişim kuralı açıklamak yüksek üretilen iş RNAi tarama oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri ortaya çıkarmak için istihdam için özellikle rhabodvirus ve vaksinia virüs tedavisi, ama -ebilmek var olmak diğer oncolytic için kolayca adapte virüs platformlar veya virüs çoğaltma genellikle modüle ana bilgisayar genler keşfetmek için.

Tedavi Oncolytic virusu modüle ana faktörleri tanımlamak için genom çapında RNAi tarama

Bu yöntem, patojen işgali üç boyutlu (3D) modelleri ile böcek hücreye görselleştirmek gösterilmiştir. Hemocytes Drosophila larvaları üzerinden viral veya bakteriyel patojenler, ex vivo veya vivo içindeile bulaşmış. Virüslü hemocytes daha sonra sabit ve görüntüleme için bir confocal mikroskop ve sonraki 3D hücresel yeniden yapılanma ile lekeli.

Hemocytes mikrobiyal enfeksiyon ve çözümleme çekme--dan Drosophila melanogaster larva

Burada, Abdovirüs çoğaltma ve Abdovirüs çoğaltma kısıtlamak 2) ökaryotik ana faktörler teşvik 1) virüs kodlanmış immunomodulators tanımlamak için protokolleri mevcut. Floresan ve ışıldama dayalı yöntemlerin araştırmacılar hızla düşük sinyal noise oranları ile basit deneyleri Abdovirüs çoğaltma nicel veriler elde etmek için izin verir.

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

Bu iletişim kuralı biz standart ve birkaç yıl boyunca belirli miktarda nükleik asitler, sivrisinekler ve evi sinekler hemolymph doğrudan teslim etmek için kullanılan bir mikroenjeksiyon metodoloji açıklar. Bu iletişim kuralı en az enjeksiyon mortalite sonuçları ve ilişkili doz ölçümleri verimlilik sağlar.

Tekrarlanabilir dsRNA mikroenjeksiyon ve Oviposition Bioassay sivrisinekler ve evi sinekler

Bu iletişim kuralı, viral enfeksiyon vivo içinde virüs ana bilgisayar etkileşimi analiz için nano-enjeksiyon yöntemi ve temel teknikleri kullanarak Drosophila melanogaster içinde kurmak açıklar.

Viral enfeksiyon ve analiz Drosophila Melanogaster ana bilgisayar virüs etkileşimin kurulması

Bu iletişim kuralı bir hücre tanıma ve mikrobiyal enfeksiyonlar Gümrükleme ölçmek için yetişkin Drosophila melanogaster içinde vivo fagositoz tahlil açıklar.

Bir In Vivo fagositoz tahlil kullanarak Drosophila melanogaster, meyve sineği hücresel bağışıklık yanıtı değerlendirirken

Drosophila melanogaster'da nörodejenerasyon gösteren mutantlar için ekrana ileri genetik bir yaklaşım kullanarak bir protokol sunuyoruz. Bu bir tırmanma tahlil, Histoloji analizi, gen haritalama ve sonuçta nörokoruma süreci ile ilgili yeni genler belirlemek için DNA sıralaması içerir.

In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için

Keşfedin yüksek verimli RNAi tarama yöntemini, Drosophila hücreleri kullanarak Vaccinia virüsü enfeksiyonuna katkıda bulunan konakçı faktörlerini belirlemek için. Bu teknik, immunofloresan mikroskopi ile kantitatif analiz sağlar.

RNAi Tarama için ilgilendim Ana Faktörler Vaccinia Virüs Enfeksiyonu Drosophila Hücre

Daha fazla video keşfet