Bitki dokusunun toplam RNA ekstraktındaki spesifik mikroRNA'yı tespit etmek ve ölçmek için Northern Blot

MikroRNA'lar, miRNA'lar, küçük, tek sarmallı, kodlamayan RNA'lardır. miRNA, bir multiprotein kompleksine dahil olur ve gen ekspresyonunu negatif olarak düzenlemek için tamamlayıcı hedef mRNA dizilerine daha fazla bağlanır.

Bitki dokularından toplam RNA'dan spesifik miRNA'yı tespit etmek için, izleme boyaları ve bir RNA denatüre edici ajan olan formamid içeren jel yüklemeli bir boya ekleyin. Elektroforezden önce RNA'yı denatüre etmek ve ikincil yapı oluşumunu önlemek için numuneyi ısıtın.

Numuneyi ve standart RNA işaretleyicilerini önceden monte edilmiş bir denatüre edici poliakrilamid jelin kuyularına yükleyin. RNA fragmanlarının boyuta dayalı ayrılmasını kolaylaştıran elektroforez çalıştırın.

Jeli, bir elektroblotlama kaseti üzerindeki önceden ıslatılmış filtre kağıtlarına aktarın. Tamponla ıslatılmış bir naylon kurutma zarını jelin üzerine hizalayın. Ardından, önceden ıslatılmış filtre kağıtlarını istifleyin. Electroblotting yapın.

Elektrik akımı, miRNA da dahil olmak üzere negatif yüklü RNA'nın jelden pozitif yüklü naylon membran yüzeyine hareket etmesine neden olur. Membranı ultraviyole ışığa maruz bırakın; bu, RNA'ları zara çapraz bağlar ve böylece RNA kaybını önler.

Membranı, arka plan gürültüsünü azaltmak için spesifik olmayan bağlanma bölgelerini işgal eden bloke edici maddeler içeren hibridizasyon tamponunda inkübe edin.

Spesifik olarak ona bağlanmak için hedef miRNA'ya tamamlayıcı bir radyoaktif işaretli RNA oligonükleotid probu ekleyin. Membranı tamponla yıkayın, bağlanmamış probları çıkarın.

Radyoaktif hibridizasyon sinyal yoğunluklarını tespit etmek ve ölçmek için bir fosfor görüntüleme sistemi kullanın. Yüksek çözünürlüklü sinyal, bitki dokusundaki spesifik miRNA ekspresyonunu gösterir.