RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, maya hücrelerini RNA içeren oligolarla transforme ederek canlı maya hücrelerinde kromozom düzeyinde RNA-DNA hibritleri oluşturmaktır. Bu, bölünen maya hücrelerine tek zincirli, RNA içeren bir oligo aktarılarak gerçekleştirilir. Oligo daha sonra, bir RNA-DNA hibriti oluşturmak için bir maya kromozomu üzerinde bulunan mutasyona uğramış bir marker genin tamamlayıcı bölgesiyle eşleşecektir; ikinci bir adım olarak, RNA içeren oligo ile transforme edilen hücreler seçici besiyerlerine ekilir.

Bu işlem, oligonun RNA kısmının mutasyona uğramış marker genin düzeltilmesi için kalıp görevi gördüğü hücrelerin büyümesine olanak tanır. Ardından, RNA içeren oligonun gen düzeltme sıklığını belirlemek amacıyla seçici besiyerinde büyüyen maya koloneları sayılır ve elde edilen sonuçlar, oligonun RNA dizisinden maya genomundaki mutasyona uğramış marker gene genetik bilgi aktarımının gerçekleştiğini ortaya koyar. Bu durum; restriksiyon enzim sindirim analizi, sekans analizi ve alkali duyarlılık testi ile kanıtlanmaktadır.

Merhaba, ben Georgia Teknoloji Enstitüsü biyoloji okulunda bulunan Dr. Francesca'nın laboratuvarı olan HIN'in kurucusuyum. Bugün size canlı maya hücrelerinde kromozomal düzeyde RNA-DNA hibritleri oluşturma prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, genomik DNA'ya gömülü RNA varlığının hücreler tarafından nasıl tolere edildiğini incelemek ve in vivo ortamda RNA-DNA hibrit stabilitesini hangi faktörlerin etkilediğini belirlemek için kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamadan önce; oligo tüpleri, pipetler, vorteks rafları, deney alanı ve araştırmacının giydiği eldivenler dahil olmak üzere deneyde kullanılacak tüm malzemeleri RNA dekontaminasyon solüsyonu ile silin. Olası RNA kontaminasyonlarını önlemek için prosedür boyunca RNA içermeyen su, kimyasal reaktifler, tüpler ve pipet uçları kullanın.

Maya hücrelerinin genomik DNA'sına genetik bilgiyi aktarmak için RNA içeren bir oligo elde edin. Burada kullanılan maya suşu, iki baz kaybı ve bir nonsense mutasyonu içeren mutant bir trip five geni taşımaktadır. Böyle bir maya suşu, triptofan atrofik bir mutanttır ve triptofan içermeyen besiyerlerinde koloni oluşturmaz.

RNA içeren oligo, delesyon mutasyonunu düzeltmek için tasarlanmış iki bazlık bir DNA insersiyonuna sahip 65 MER'dir. Ek olarak, oligo, elde edilen trip beş alelinin nonsense mutasyonunu düzeltmek için bir ribonükleotid içerir; yazılı protokolde açıklandığı şekilde, RNA içeren oligoyu 250 micromolar'lık bir stok çözelti olarak hazırlayın. RNA içeren oligo ile transformasyondan 16 saat önce inoküle edin.

Beş mililitre zengin maya peptit dekstroz veya YPD sıvı besiyerine trip beş mutant maya hücreleri ekleyin ve hücreleri 30 °C'de gece boyunca büyütün. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, gece boyu büyütülen kültürden 1,5 mililitreyi 50 mililitre YPD sıvı besiyerine aktarın. Hücreleri, transformasyon çözme işleminden hemen önce 30 °C'lik bir çalkalayıcıda dakikada 225 devir hızında dört saat boyunca inkübe edin.

RNA içeren oligoları ve karşılık gelen sadece DNA içeren oligoları buz üzerinde tutun. Karşılık gelen sadece DNA içeren oligolar pozitif kontrol olarak kullanılır. Oligoları, RNA içermeyen tüplerde, RNA içermeyen su ile 50 µM konsantrasyona seyreltin.

Bir molün üç transformasyonu için yeterli örnek sağlamak amacıyla her bir oligonun 70 µL'sini hazırlayın; bazı fazlalık denatürasyon işlemleriyle birlikte, RNA içeren ve yalnızca DNA içeren oligoları oligoların sekonder yapılarını ortadan kaldırmak için 100 °C'lik ısı bloğunda iki dakika boyunca ısıtın. Denatürasyondan hemen sonra tüpleri, transformasyon gerçekleşene kadar buz üzerinde bekletin. Çözelti bir ve çözelti ikiyi transformasyondan hemen önce RNazsız tüplerde hazırlayın. Hücre kültürünü 50 mL'lik RNazsız bir tüpe aktarın ve 3000 rpm (1.562 ×g) hızda iki dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri 50 milliliters RNase içermeyen su ile yıkayın. Hücreleri tekrar dakikada 3000 devir hızında iki dakika boyunca santrifüjleyin. Kültür ortamından ve son santrifüjden sonra mevcut olabilecek tüm RNase'lerden kurtulmak için bu işlemi beş kez tekrarlayın.

Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri beş mililitre çözelti içinde yeniden süspanse edin. Bir. Örneği dakikada 3000 devirde iki dakika boyunca santrifüj edin, süpernatantı dökün ve hücrelere 250 mikrolitre çözelti bir ekleyin. Bu hücre miktarı yedi ila sekiz transformasyon için yeterlidir.

Hücre süspansiyonunun 50 µL'sini, RNA içermeyen yedi adet mikro santrifüj tüpünün her birine paylaştırın. Ardından, üç tüpe 50 µM konsantrasyonunda RNA içeren oligodan 20 µL; üç tüpe 50 µM konsantrasyonunda yalnızca DNA içeren oligodan 20 µL ve negatif kontrol için bir tüpe oligo içermeyen 20 µL steril su ekleyin.

Ardından, yedi transformasyon reaksiyonunun her birine 300 µL çözelti iki ekleyin. Bileşenleri karıştırmak için örnekleri kuvvetlice vorteksleyin. İnkübasyonun ardından, transformasyon reaksiyonlarını bir çalkalayıcıda 30 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

Numunelere 42 °C'de 15 dakika boyunca ısı şoku uygulayın. Ardından hücreleri, 2.236 ×g'ye karşılık gelen dakikada 5.000 devir hızında dört dakika boyunca santrifüj edin. SUP ajanını uzaklaştırın ve üç tüpün her biri için hücreleri 100 µL steril su içerisinde yeniden süspande edin.

Bu hücre süspansiyonundan bir alikot alın ve her bir alikotu steril su ile 100.000 kat seyreltin. Plaka başına yaklaşık 15 steril cam boncuk ekleyin ve 100.000 kat seyreltilmiş hücrelerden 100 µL'yi üç adet YPD plakasına ekleyin. Her bir transformasyon reaksiyonundan elde edilen resüspande hücrelerden 100 µL'yi triptofan içermeyen sentetik komple katı besiyeri içeren bir Petri kabına ekleyin ve plakaları eşit şekilde çalkalayın.

Ardından boncukları uzaklaştırın. Hücreleri YPD plaklarında 30 °C'de iki gün boyunca ve triptofan içermeyen sentetik komple katı ortamda ekili hücreleri 30 °C'de dört ila beş gün boyunca inkübe edin. RNA içeren oligo, sadece DNA içeren oligo ve oligo içermeyen kontrol için gen düzeltme frekansını hesaplamak amacıyla, seçici ortamda ve YPD ortamında büyüyen koloni sayılarını sayın ve karşılaştırın.

Hücrelere oligolar eklenmediğinde seçici ortamda hiç koloni oluşumu beklenmez; tek koloni izolatları elde etmek için rastgele seçilen birkaç transforme koloniyi YPD ortamına çizgi şeklinde ekin. Koloni büyümesi için hücreleri 30 °C'de iki gün boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, birkaç tek koloni seçin ve YPD ile seçici ortam üzerine yamalar (patch) yapın.

Bir günlük inkübasyonun ardından, triptofan içermeyen sentetik tam katı besiyerinde, oligo ile transforme edilmiş hücrelerde büyüme gözlemlenirken, triptofan içermeyen seçici sentetik tam katı besiyerindeki oligosuz kontrol suşunda büyüme gözlemlenmez. Ardından, koloni PCR'ına başlamak için koloni PCR'ı kullanarak RNA içeren oligonun hedeflediği bölgeyi amplifiye edecek bir primer çifti tasarlayın. Münferit bölgelerden alınan hücreleri, bir ünite liyaz içeren 50 µL su içerisinde yeniden süspande edin; hücreleri parçalamak ve genomik DNA'nın çözeltiye salınmasını sağlamak için örnekleri önce 10 dakika boyunca oda sıcaklığında, ardından beş dakika boyunca 100 °C'deki bir ısıtma bloğunda inkübe edin.

PCR reaksiyonlarını PCR tüplerinde hazırlayın, her bir tüp düzeneğine 10 µL hücre süspansiyonu ekleyin ve amplifikasyon reaksiyonunu yazılı protokolde açıklandığı şekilde gerçekleştirin. PCR ürününü gözlemlemek için elde edilen örnekleri %1'lik agaroz jelde yürütün. Bu deneyde oligo içeren RNA tarafından aktarılan genetik bilgi, maya genomik hedef bölgesinde yeni bir VAN 91 1 restriksiyon bölgesi oluşturduğundan, PCR ürününün van 91 1 restriksiyon enzimi ile sindirilmesiyle bilginin doğru aktarıldığı doğrulanabilir.

Sindirimi reaksiyonunu altı µL PCR ürünü, tampon çözelti, 0.5 µL BSA, restriksiyon enzimi ve toplam hacim 15 µL olacak şekilde steril su içerecek şekilde hazırlayın. Numuneleri 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. RNA içeren oligonun RNA dizisi tarafından aktarılan genetik modifikasyonu gözlemlemek için, sindirilmemiş bir numuneyi sindirilmiş numunelerle birlikte %2'lik bir agaroz jelinin aynı sırasına yükleyip çalıştırın.

PCR ürünlerini bir PCR saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın ve DNA dizileme için hazırlayın. Numuneleri, ürünü amplifiye etmek için kullanılan primerlerle aynı primerler kullanılarak dizilemeye gönderin. Son olarak, her reaksiyon için RNA içeren oligonun bir molünü veya yalnızca DNA içeren oligoyu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktararak RNA içeren oligonun alkali işlemini gerçekleştirmek amacıyla, birden fazla dizinin seçilen bir referans diziyle hizalanmasına olanak tanıyan bir yazılım kullanarak DNA dizileme sonuçlarını analiz edin.

Ardından, hidroliz için bir molar sodyum hidroksitin dört mikrolitresini veya negatif kontrol için dört mikrolitre su ekleyin. İnkübasyonun ardından numuneleri bir saat boyunca 65 °C'deki bir su banyosunda inkübe edin. Reaksiyonu buza aktarın.

Hidroliz reaksiyonunu iki mikrolitre 1.2 molar hidroklorik asit, dört mikrolitre bir molar tris hidroklorür ve negatif kontrol için dört mikrolitre su ile nötralize edin. Altı mikrolitre su ve dört mikrolitre bir molar tris hidroklorür ekleyin. Örnekleri, gerçekleştirilebilecek olan transformasyona kadar buz üzerinde tutun.

Az önce açıklandığı gibi, herhangi bir oligo ile transforme edilmemiş maya hücreleri, triptofan içermeyen sentetik komple katı besiyerinde koloni oluşturmazlar. Buna karşılık, RNA içeren oligo ile transforme edilen hücreler, triptofan içermeyen sentetik komple katı besiyerinde büyütüldüğünde koloni oluştururlar.

Hücreler sadece kontrol oligo olan bir nanomol ilgili DNA ile transforme edildikten sonra, maya kolonileri triptofan içermeyen sentetik komple katı besiyerinde de büyür; RNA içeren oligodan maya kromozomal DNA'sına genetik bilgi aktarımının gerçekleştiği, gösterildiği üzere hedeflenen genomik bölgeyi çoğaltan PCR ürününün VAN 91 1 restriksiyon sindirimi ile belirgindir. Trip. beş mutant suşunun genomik DNA'sından çoğaltılan trip. beş lokusunun PCR ürünü görülebilmektedir.

Ayrıca, DNA'ya özel oligo ile hedeflenen bir trip plus koloniden elde edilen genomik DNA'dan amplifiye edilen PCR ürünü gösterilmiştir. RNA içeren oligo ile hedeflenen trip plus kolonilerinden elde edilen genomik DNA'dan amplifiye edilen PCR ürünleri de jele yüklenmiştir. Aynı PCR ürünlerinin van 91 1 kısıtlama enzim sindirimi sonuçları, 278 baz çiftlik bir amplifiye PCR bandı ile van 91 1 sindirimi sonucunda oluşan 177 baz çiftlik ve 101 baz çiftlik sindirim ürünü bantlarını ortaya çıkarmaktadır.

DNA dizilemesi, buradaki RNA içeren oligo ile gerçekleştirilen gen düzeltmesini ortaya koymaktadır. RNA içeren oligo tarafından hedeflenen genomik bölgenin DNA elektroferogramı gösterilmiştir. DNA dizisindeki g, RNA içeren oligo go'daki RG'den kaynaklanmaktadır.

Ayrıca kutu içerisinde, yalnızca DNA içeren oligo ve RNA içeren oligo tarafından hedeflenen trip beş bölgesinin CG baz dizilerinin trip artı transformantlarına eklenmesi yer almaktadır; bunlar konsensus dizisiyle eşleşmekte ve oligo hedeflemesi öncesindeki trip beş mutant hücrelerinkilerle karşılaştırılmaktadır. Alttaki onarım RNA içeren oligoda, iki bazlık bir DNA eklemesi ve bir bazlık bir RNA substitusyonu bulunmaktadır.

Mavi kutu ve sarı gölge ile belirtilen bölgeler, hem RNA içeren oligonun hem de sadece DNA içeren oligonun, test edilen tüm örneklerde delesyon mutasyonunu ve anlamsız mutasyonu kesin olarak düzelttiğini göstermektedir; kesikli çizgiler RNA içeren oligo dizisinin konumunu belirtmektedir. Alkali işlemi, RNA içeren oligo tarafından gerçekleştirilen gen düzeltmesini engellemektedir; RNA içeren oligo ve sadece DNA içeren oligo ile gerçekleşen transformasyon frekansı gösterilmiştir. Hata çubukları, her bir oligo için üç bağımsız transformasyonun ortalamasının standart hatasını temsil etmektedir.

Sadece DNA içeren oligo, sodyum hidroksit işlemiyle ve işlemsiz benzer transformasyon sıklığı sergiler. Buna karşın, RNA içeren oligo ile transformasyon sıklığı, sodyum hidroksit uygulamasının ardından sıfıra iner. Bu nedenle, RNA içeren oligo ile yapılan hazırlık, sadece DNA içeren oligo ile kontamine olmamıştır.

Böylece, gözlemlenen transformasyon frekansı RNA içeren oligoya özgüdür. Size kromozomal düzeyde bir RNA-DNA hibriti oluşturmayı ve maya hücrelerinde genetik bilginin RNA'dan genomik DNA'ya aktarımını incelemeyi gösterdik. Bu prosedürü uygularken, RNA içeren oligoların mükemmel kalitede olduğundan emin olmak ve RNA'dan arındırılmış koşullar altında çalışmak önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.