Name: RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 42 s
Description: Öğrenin, maya hücrelerinde RNA içeren oligonükleotidler kullanarak kromozomal düzeyde RNA/DNA hibritleri oluşturma yöntemini. Bu teknik, genetik bilginin RNA'dan genomik DNA'ya aktarımını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Gürcistan Kanseri Koalisyonu hibe R9028 tarafından desteklenmiştir.

Gerekçe Thermo Scientific Dharmacon oligos, 50 80-mers kullanımı istismar, burada oligos hedef kromozomal DNA tavlama aşağıdaki maya hücreleri genomik DNA genetik bilgi aktarabilirsiniz hangi bir gen düzeltme testi dayalı bir prosedür mevcut. Oligos tarafından hedef Başarılı beklenen fenotip gösteren maya kolonileri görünümünü tarafından atılırsa. Istenilen genetik modifikasyon oligo dizisi dahil bir veya daha fazla ribonucleotides içinde yapılır ise, genetik bilginin RNA yolu böylece kromozom hedef DNA, kromozom seviyesinde hedefleme işlemi sırasında bir RNA / DNA hibrid formları doğrudan akar. Thermo Scientific Dharmacon RNA içeren oligo ribonukleotid / s DNA onarım sentezi yoluyla hedef gen için şablon olarak hizmet edebilir ya da DNA içine gömülü olabilir ve DNA replikasyonu sırasında şablon olarak hizmet vermektedir. Bu deneylerde maya / Saccharomyces cerevisiae / ökaryot model sistemi kullanmak; Ancak, benzer bir yaklaşım, diğer organizmalar veya hücre tipleri de uygulanabilir . Bu video, biz bir hedef maya genomik lokus homoloji ile tasarlanmış bir Thermo Scientific Dharmacon oligo ve hedef gendeki bir mutasyon düzeltmek için ortada bir ribonukleotid içeren. RNA içeren oligo dönüşüm sonra, belirli bir frekansta, oligo RNA yolu kromozomal DNA içine dahil ve DNA replikasyon sırasında DNA sentezi için şablon olarak hizmet olabilir gösterir hedeflenen sitenin düzeltme gözlemliyoruz. RNA yolu içinde taşınan genetik bilgi stably aşağıdaki hücre nesillere aktarılır. Burada Thermo Scientific Dharmacon RNA içeren oligo ve yaklaşım kromozomal DNA aktarılması RNA bilgilerini tespit etmek için maya hücre dönüşüm adımları açıklar. A. RNA içeren Oligo Bu Deney tasarımı kullanılan Maya bir genetik kusur düzeltmek için bir RNA içeren oligo tasarladık S. trp5 lokustaki cerevisiae kromozomal DNA. Protokolünde kullanılan maya suşu, iki baz silinmesi ve bir saçmalık mutasyon (Şekil 1A) ile bir mutant gen trp5 içerir . Böyle bir maya suşu, triptofan auxotrophic mutant ve triptofan olmadan medya koloniler teşkil etmemektedir. TRP5 geninin DNA dizisi Saccharomyces Genom Veritabanı (http://www.yeastgenome.org/) kullanılabilir. Bu protokolde kullanılan Thermo Scientific Dharmacon RNA içeren oligo 2-baz DNA ekleme, silme mutasyon ve trp5 allel (Şekil 1A) anlamsız mutasyon düzeltmek için tasarlanmış bir ribonukleotid düzeltmek için tasarlanmış 65-mer, . Oligo sırası şu şekilde tasarlanmıştır: 5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-rG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Bu oligo 200 nM ölçekte Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) tarafından sentezlenir ve desalted, deprotected SAYFA arıtma olmadan kullanılamaz. Maya Dönüşüm RNA içeren Oligo (Storici ark değiştirilmiş, 2007 1) B. Hazırlık <ol><li> Oligo tüpleri dahil olmak üzere bir deney, pipetler, girdap, raflar, deneysel alan ve her şeyi başlamadan önce potansiyel RNaz kontaminasyonu temizlemek için RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile araştırmacı tarafından giyilen eldiven için kullanılacak malzemeler silin. RNaz içermeyen su, kimyasal reaktifler, tüpler ve tüm adımları pipet uçları kullanın. Bu deneyde her adım RNaz arındırılmış olmalıdır. </li><li> Thermo Scientific Dharmacon RNA içeren oligo şirketten 250 pmoles / ul stok solüsyonu RNaz ücretsiz su ve pelet çözmek için gayretle vorteks alınan süspanse edin. -80 ° C saklayınız </li><li> Dönüşüm hemen önce, buz üzerinde RNA içeren oligo Çözülme ve RNaz ücretsiz tüpler RNaz içermeyen su ile 50 pmoles / ml ye tamamlanır. Her dönüşüm RNA içeren oligos 1 nmole gerektirir. </li><li> Oligos ikincil yapıları ortadan kaldırmak için 2 dakika süreyle 100 ° C ısıya blok RNA içeren oligos seçilmiş bir miktar denatüre. </li><li> Denatürasyon sonra hemen buz tüpü yerleştirin. Dönüşüm kadar buz üzerinde tutun. </li><li> Karşılık gelen bir deneyde kontrol olarak DNA sadece oligo kullanılır. Bu oligo -20 ° C den yukarıda açıklandığı gibi, çözülmüş ve RNA içeren oligo olarak dönüşüm için hazırlanmıştır. </li></ol> C. RNA içeren Oligo kullanarak Maya Hücreleri Dönüşüm <ol><li> Trp5 mutant maya hücreleri ile zengin YPD sıvı bir ortamda 5 ml inoküle edin ve 30 ° C gecede (bkz. Malzemeleri) büyümeye. </li><li> 50 ml YPD sıvı ortam içine 1.5 ml gecelik kültür aktarın. </li><li> 4 saat için 30 ° C çalkalayıcı (225 rpm) hücreler inkübe edin. </li><li> Çözüm 1 ve Çözüm 2 imm hazırlayınediately önce RNaz ücretsiz tüpler dönüşüm (Malzeme bakınız). </li><li> 50 ml RNaz ücretsiz tüp ve 2 dakika süreyle 1562 g karşılık gelen 3000 rpm dönüş için hücre kültürü aktarın. Hücre yağış pelet yaklaşık. 0.3 cm 3. </li><li> 50 ml, 2 dakika süreyle 3000 rpm'de RNaz ücretsiz su ve spin ile süpernatant ve yıkama hücreler çıkarın. </li><li> Orta mümkün olduğunca mevcut olabilir kültür ortamı ve RNases kurtulmak için adım 6 5 kez tekrarlayın. </li><li> Çözüm 1 ve 2 dakika süreyle 3000 rpm'de spin 5 ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. </li><li> Çözüm 1 250 ul supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Bu hücre miktarı 7-8 dönüşümler için yeterli. </li><li> Kısım 50 ul RNaz ücretsiz mikrosantrifüj tüpler hücre süspansiyonu, 20 ul RNA içeren oligo çalışma çözümü (1 nmole), ya da sadece DNA-oligo çalışma çözümü (1 nmole), ya da steril su 20 ul 20 ul negatif kontrol için bir oligo. Sonra her bir dönüşüm tepki için 300 ul Çözüm 2 ekleyin. Kendileri gibi taşıyıcı oligos hareket olarak, dönüşüm sürecinin somon sperm DNA eklemenize gerek yoktur. </li><li> Vortex şiddetle homojen karıştırın. </li><li> 30 ° C de 30 dakika bir çalkalayıcı dönüşüm reaksiyonları inkübe edin. </li><li> Isı şoku 42 ° C de 15 dk. </li><li> 4 dakika süreyle 2236 g, 5000 rpm devir hızına karşılık gelen hücreler aşağı spin. </li><li> 100 ul steril su supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. </li><li> Bu hücre süspansiyonu bir kısım alın ve 100.000 kat ve yaklaşık kullanarak bir YPD plaka plaka hücreleri tarafından steril su ile seyreltilmiş. 30 - 15 steril cam boncuk ve inkübe ° C 2 gün boyunca. </li><li> Plaka yeniden süspanse hücrelerin her biri yaklaşık kullanarak triptofan (SC-Trp) olmadan sentetik tam katı besiyeri Petri kabı dönüşüm reaksiyonu. 30 - 15 steril cam boncuk ve inkübe ° C 4-5 gün (Şekil 2). </li></ol> RNA içeren Oligo D. Gen Düzeltme Analizi <ol><li> RNA içeren oligo için gen düzeltme frekansı hesaplamak için seçici besiyeri (Şekil 2) yanı sıra YPD orta yetiştirilen kolonileri, DNA tek oligo ve hayır-oligo kontrol sayısını. Elde edilen sayı karşılaştırın. Spontan reversion oranı iki-baz silme ve anlamsız mutasyon trp5 allellerin kullanılan maya suşu 10-9 daha azdır, dolayısıyla biz hiçbir oligos hücreleri eklenir seçici orta koloniler oluşturulmasını bekliyoruz. </li><li> Birkaç dışarı Streak rastgele tek koloni izolatları elde etmek için orta YPD üzerine transformant koloniler aldı. Koloni büyümesi için iki gün bekleyin, sonra birkaç (en az 5) tek koloniler ve YPD ve seçici orta yamalar yapmak. </li><li> Koloni PCR (Şekil 1B) RNA içeren oligo tarafından hedef bölge (250-1,000 bp) yükseltmek için bir çift astar tasarlayın. (Storici ve Resnick değiştirilmiş, 2006 2) aşağıdaki gibi koloni PCR prosedürü. <ol><li> Süspanse edin hücreleri (yaklaşık 1 mm3) su 50 ul bireysel yamaları alınan ve 1 adet lyticase ekleyin. 100 ısı blok inkübasyonu takiben 10 dakika, ° C çözüm hücreler ve bırakın genomik DNA kırmak için 5 dakika oda sıcaklığında inkübe </li><li> PCR koşulları: PCR reaksiyon hücre tabanda çözüm ul içeren 10, 50 pmoles ileri ve geri primerler, 10 mM dNTP, Taq polimeraz 1 birim, 10x tampon ve 5 ul 1 ul steril su ile ayarlanır. 50 ul son hacim. 30 devir 95 30 s, 30 s: 55 ° C ° C ve 1 dakika 72 ° C;; son uzatma süresi 7 dakika 72 ° C, daha sonra örnekleri PCR programı 95 ° C'de 3 dakika 4 tutulur ° C Bu tepkime için bir uzatma süresi 1 dakika kb / varsayılır. </li><li> PCR ardından, örnekler PCR ürünü gözlem için% 1 veya% 2 (PCR ürünü beklenen boyutuna göre) agaroz jel (Şekil 3) üzerinde çalışmaktadır. </li></ol></li><li> RNA içeren oligo tarafından aktarılan genetik bilgi maya genomik hedef bölgede yeni bir kısıtlama sitesi (Şekil 1B) oluşturuyorsa, bu, uygun bir restriksiyon enzimi ile PCR ürününün sindirerek doğru bilgi transferi doğrulamak mümkün. RNA içeren oligo tarafından üretilen herhangi bir sınırlama sitesi ise, 6. adıma gidin. Digest belirli bir restriksiyon enzimi kullanılarak PCR ürünleri. Sindirim reaksiyonu restriksiyon enzimi ul PCR ürün, tampon, BSA (bazı enzimler için kullanılan enzim için talimat gerekli olmayabilir), 0.5 ul, 6 ve 15 ul steril su içerir. Numuneler kullanılan enzim için spesifik sıcaklığında 1 saat inkübe edilir. </li><li> Genetik modifikasyon gözlemlemek için% 2 agaroz jel aynı satırda sindirilir örnekleri ile birlikte sindirilmemiş bir örneği çalıştırmak b transferRNA içeren oligo y RNA yolu (Şekil 3). </li><li> PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünleri arındırmak ve DNA dizi analizi için onları hazırlamak. Ürün yükseltmek için kullanılan aynı primerler ile sıralama için örnekler gönderin. </li><li> Seçilen bir referans dizisi (Şekil 4) ile birden fazla dizilerinin uyum sağlayan bir yazılım kullanarak DNA dizi analizi sonuçları analiz edin. </li></ol> E. RNA içeren oligo Alkali Arıtma (Şekil 5) <ol><li> Her reaksiyon için RNA içeren oligo veya DNA-oligo 1 nmole (250 pmoles / ml stok solüsyonu 4 ul), 1.5 ml tüp içine ekleyin. </li><li> Hidroliz 1 M NaOH 4 ul ekleyin ya da alternatif olarak negatif kontrol olarak 1 saat 4 ul H 2 O ekleyin ve bir su banyosunda 65 ° C'de inkübe Daha sonra su banyosunda buz hareket ettirin. </li><li> 2 ul 1.2 M HCl, H 2 O 1 M Tris-HCl ve 4 ul ul 4, ya da alternatif olarak H 2 O 6 ul ve negatif kontrol için 1 M Tris-HCl 4 ul ile nötralize edin. Dönüşüm kadar buz üzerinde tutun. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Kusurlu trp5 gen ve RNA içeren oligo düzeltilebilir TRP5 allel şematik diyagramı.) Trp5 mutant gen 2-baz silinmesi (siyah üçgen) ve 1-baz saçmalık mutasyon (yıldız) içerir. Tek iplikli RNA içeren 2-baz ekleme (mavi döngü) ve bir Van91 I restriksiyon enzimi sitesi (braket gösterilen) üreten 1-RNA baz ikame (kırmızı dikdörtgen) oligo genetik kusurları düzeltmek için maya hücreleri dönüştü. trp5 gen. B) TRP5 genin RNA içeren oligo (düzeltilmiş üsleri mavi dikdörtgenler olarak belirtilmiştir) tarafından onarıldıktan sonra, Van91 I site TRP5 gen oluşturulur. TRP5 gen sadece bir Van91 I restriksiyon sitesi de dahil olmak üzere 278 bp parçası PCR primerleri bir çift (P1 ve P2) tarafından yükseltilir. Van91 P1 ve P2 PCR ürününün sindirim sonra oluşturulan 177 bp ve 101 bp parça de gösterilir. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. RNA içeren oligo Dönüşüm sonucudur.) Maya hücreleri hiçbir oligo ile dönüştürülmüş SC-Trp ortamda herhangi bir koloni oluşturmak yok, plakaları ab bakın. B) Tabaklar cg show maya kolonileri SC-Trp büyüyen hücreleri sonra RNA içeren oligo 1 nmole dönüşür. C) Tabaklar hl show maya kolonileri SC-Trp büyüyen hücreleri sonra 1 nmole ile ilgili DNA tek kontrol oligo dönüşür. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Genetik bilgi aktarımı Algılama RNA içeren hedeflenen genomik bölge P1 ve P2 ile amplifiye Van91 I restriksiyon enzimi ile sindirilir PCR örneklerinin% 2 agaroz jel elektroforezi yükseltme PCR ürün sınırlama sindirim maya kromozomal DNA oligo. Lanes 1, 8 ve 15, 100 boyutları, 200, 300, 400 ve 500 bp DNA merdivenin sol tarafta belirtilen şeritli 2, PCR trp5 mutant suşunun genomik DNA amplifiye trp5 lokus ürünü; 3 şeritli, PCR şeritli 9 14 ürün sadece DNA-oligo tarafından hedeflenen bir Trp + koloni elde edilen genomik DNA amplifiye; Van91 I sınırlama sindirim şeritli 4-7, PCR ürünleri elde edilen genomik DNA, RNA içeren oligo tarafından hedef Trp + koloniler amplifiye 2 ila 7 şerit PCR ürünleri. 10 ila 14 şerit kesilmemiş PCR ürün gruplarından varlığı TRP5 lokus (CCACATTCTGG) Van91 Ben kısmi sindirimi ile açıklanabilir. Van91 (CCANNNN NTGG) için kesme sitenin birden çok dizileri göz önüne alındığında, TRP5 oluşturulan site enzim için en uygun hedef olmayabilir. Aslında, yukarıdaki tüm PCR ürünleri sıralama aşağıdaki DNA (bkz. Şekil 4) oligos tarafından yapılan dışında herhangi bir ek değişiklikleri algılamak. Van91 P1 ve P2 astar ve sindirim ürün grupları ile amplifiye 278 bp PCR bant, 177 bp ve 101 bp sağdaki oklarla gösterilmiştir . <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig4tmb.jpg" border="0" alt="Şekil 4Başparmak" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4Thumb"> Şekil 4. RNA içeren oligo gen düzeltme gösteren DNA dizi analizi sonuçları. Genomik bölge A) DNA Elektroferogram RNA içeren oligo tarafından hedef. DNA dizisi (kutulu mavi) G RNA içeren oligo rG türemiştir. Ayrıca kutulu CG üslerinin yerleştirilmesi. Diğer tüm PCR ürünleri sonuçlar Sıralama floresan sinyalleri ile arka plan üzerinde, aynı zamanda bu kadar net. B) Trp + transfo TRP5 bölge DizilerDNA sadece oligo (T1) ve RNA içeren oligo (T2-T5), üstünde fikir birliği sırayla maç ve hedef rmants (Genomik DNA, kırmızı oligos göre hedefleme önce trp5 mutant hücreler ile karşılaştırıldığında gölgeli). Onarım RNA içeren alt oligo iki temel DNA ekleme ve tek-baz (G) kırmızı ile işaretlenmiş RNA ikame vardır. Sarı gölge gösterisi ile mavi kutulu bölgelerde RNA içeren DNA sadece oligo oligo olarak sıra tam silme mutasyon ve tüm test örnekleri anlamsız mutasyon düzeltildi. Kesik çizgiler RNA içeren oligo dizisi konumu işaretleyin. Lütfen Şekil 4 büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2152/2152fig4.jpg">buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5. Alkali tedavi RNA içeren oligo gen düzeltme önler. RNA içeren oligo (R) dönüşümü frekans, kırmızı çubuğunda ve mavi çubuk sadece DNA-oligo (D) gösterilir gösterilir . Hata çubukları her oligo için 3 bağımsız dönüşümler için ortalama standart hata temsil eder. DNA sadece oligo NaOH tedavi ile benzer frekans dönüşüm olmadan ve görüntüler. Farklı NaOH ile 0 tedavisi sonrasında, RNA içeren oligo dönüşüm frekans düşer. Bu nedenle, RNA içeren oligo hazırlık DNA sadece oligo ile kontamine değildir, bu nedenle, gözlenen dönüşüm frekans RNA içeren oligo özel.

<ol><li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-templated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li>
<li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li>
<li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li>
<li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+H%3A+the+enzymes+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li>
</ol>

Bu yazı için video üretimi, bu yayında kullanılan reaktifler ve alet üreten Thermo Fisher Scientific sponsor oldu.

RNA hücrelerde genomik DNA genetik bilgi aktarımı olabilir aslında sentetik RNA içeren oligos (Dharmacon sentezlenmiş oligos) 1 istismar keşfedildi. Bu, hücrelerin DNA sentezi için şablonlar olarak RNA içeren moleküllerin ya da sadece RNA dizileri kullanabileceğiniz ilke kanıtı oldu. RNA içeren, sadece genetik bilginin RNA, genomik DNA ters transkripsiyonu DNA kopyalama ara gerek kalmadan doğrudan transfer edilebilir gösteriye yol açmadığı oligos değil, aynı zamanda RNA&#39;nın homolog şablon olarak kullanılabilir olması kanıtı DNA hasarı 1,3 tamiri. Oligos biz burada sunulan örnekte olduğu gibi, RNA sadece yapılan veya bir DNA dizisi gömülü sadece tek bir ribonukleotid içeren olabilir. RNA içeren oligo genomik kusurlu trp5 allel anlamsız mutasyon düzeltmek için tasarlanmış bir gömülü ribonukleotid vardır. Ribonukleotid genomik DNA genetik bilgi transferi hedeflenen hücrelerin fenotipi (hücre triptofan eksik orta büyüyen) bir değişiklik ortaya çıkar. RNA içeren oligo ile elde edilen gen düzeltme frekansı ölçülür ve kontrol DNA sadece oligo ile karşılaştırıldığında. Çeşitli maya genler mutasyona farklı hücre arka plan, bu gen düzeltme tahlil yaparak, biz faktörü / s özellikle RNA içeren oligos tarafından hedef etkileyecek şekilde algılayabilir. Böylece, hücrelerin RNA / DNA hibritleri istikrar nasıl düzenleyen mekanizmalar ortaya çıkarabilir. Bir sadece RNA içeren oligos farklı türevlerini tasarımı DNA modifikasyonu şablon olarak hizmet etmek, belirli bir RNA sistem için olasılığını belirleyebilirsiniz ve DNA içine gömülü özel RNA dizilerinin istikrar belirleyebilirsiniz. Ayrıca, tercih edilen in vivo yüzeylerde RNA / DNA hibritleri ile etkileşen faktörler nelerdir tanımlayabilirsiniz. Ağırlıklı olarak kısa kullanılarak, in vitro çalışmalarda çeşitli RNA içeren oligos RNases H in vivo fonksiyonları yanı sıra, RNaz H enzimler 4, DNA ile bir melez RNA tanıyabilir faktörlerin fonksiyonu karakterize etmek için yapılmış olsa da RNA / DNA hibrid istikrarı çoğunlukla bilinmemektedir etkileyebilecek diğer proteinlerin kimlik olarak. Yararlanma imkanı RNA içeren önemli bir uzunluğu (50-80-mers) ve en iyi kalite oligos (Thermo Scientific Dharmacon RNA içeren oligos gibi) doğrudan in vivo moleküler süreçleri geniş bir yelpazede incelenmesi yolu açık ilgi hücreleri. Olarak kullanarak, bu video, dönüşüm gösterilen RNA içeren oligos aslında RNases tarafından bozulmasını önlemek için, DNA molekülleri kullanarak dönüşümü ile karşılaştırıldığında sadece birkaç ek adımlar gerektirir. Bu nedenle, RNA içeren oligos maya sistemi ile sınırlı değil. Kullanarak dönüşümü DNA oligos dönüşüm yetkin herhangi bir organizma ya da hücre tipi uygulanabilir. Sonuç olarak, hücrelerini hedef RNA içeren oligos hücrelerinin in vivo DNA gömülü ve RNA / DNA hibritler ve ribonucleotides oluşturmak için fırsat sağlar . In vivo olarak istikrar, fonksiyon ve bunların sonuçlarını RNA üretilir / DNA hibritleri potansiyel olarak bilinmeyen DNA onarım mekanizmaları açığa çıkarmak ve hedef gen için yeni stratejiler ortaya koymak, analiz ve karakterize edilebilir .

A. Dönüşüm reaktifleri ve medya (Storici ve Resnick değiştirilmiş, 2006 <ol><li> YPD (Maya Peptonlu Dekstroz): 1 litre için 10 g maya özü, 20 g soya pepton, 20 g dekstroz. YPD katı ortam yapmak için 15 g agar ekleyin. Kullanmadan önce Otoklav. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Çözüm 1: 0.1 M lityum asetat. Dönüşüm hemen önce hazırlayın. Çözüm 1 çalışan bir çözümdür, böylece toz doğrudan hazırlanır. Hisse senedi bir çözüm oldu. Oda sıcaklığında tutun. LiAc DNA maya hücre duvarının geçirgenliği artar. </li><li> Çözüm 2: lityum asetat 0.1 M ve% 50 polietilen glikol 4000. Ayrıca çözüm 2 çalışan bir çözümdür ve doğrudan tozundan yapılır. Stok solüsyonu hazırlanır. Oda sıcaklığında tutun. PEG mevduat maya hücreleri üzerine oligos. </li><li> RNA içeren oligos (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80-mers, desalted deprotected ve non-saflaştırılmış. 250 pmoles / ml süspanse edin. -80 ° C saklayınız </li><li> Desalted ve non-saflaştırılmış DNA sadece oligos, 50-80-mers,. 50 pmoles / ml süspanse edin. -20 ° C&#39;de muhafaza </li><li> SC-Trp (Sentetik eksiksiz bir medya eksik triptofan) katı ortam. </li><li> Otoklav ile sterilize 0.5 cm çapında cam boncuklar. </li><li> RNaz-off: RNaz dekontaminasyon çözüm. </li><li> DNaz / RNaz içermeyen, steril santrifüj tüplerine. </li><li> DNaz / RNaz içermeyen, steril konik tüpler. </li><li> ZAP ile DNaz / RNaz içermeyen, steril aerosol pipet uçları: 1-200 ml, 100-1000 ml. </li></ol> B. Colony PCR malzemeleri. <ol><li> Desalted ve non-saflaştırılmış DNA primerleri. 50 pmoles / ml steril su içinde eritin. -20 ° C&#39;de muhafaza </li><li> Taq DNA polimeraz, tampon, dNTP. </li><li> PCR tüpleri. </li></ol> C. PCR saflaştırma. <ol><li> PCR saflaştırma kiti. </li></ol> D. Jel Elektroforez. <ol><li> Agaroz. </li><li> 1 x TBE tamponu (45 mM Tris-borat ve 1 mM etilendiamin tetraacetate) 10x TBE seyreltilir. </li><li> Prestained moleküler ağırlık belirteci. </li><li> DNA yükleme boya. </li></ol> E. Kısıtlama sindirim. <ol><li> Kısıtlama enzimler, 10x tamponlar, BSA. </li></ol> F. RNA içeren oligo Alkali tedavi. <ol><li> 1 M NaOH çözeltisi. </li><li> 1.2 M HCl çözeltisi. </li><li> 1 M Tris-HCl, pH 7.4 çözüm. </li></ol>

rna içeren oligonükleotidler kullanarak dönüşüm genomik dna, rna / dna hibritlerin Üretimi

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Sentetik kısa nükleik asit polimerleri, oligonükleotidler (oligos), moleküler biyolojinin en işlevsel ve en yaygın araçları. Oligos istenen herhangi bir DNA veya RNA dizisi içeren imal edilebilir ve geniş bir taban ve şeker değişiklikler içerecek şekilde hazırlanmış olabilir. Ayrıca, oligos spesifik nükleik asit değişiklik taklit etmek ve böylece, DNA hasarı ve onarım mekanizmalarının etkilerini araştırmak için önemli bir araç olarak hizmet edebilir dizayn edilebilir. Olduğunu saptadık Thermo Scientific Dharmacon RNA içeren 50 ve 80 nükleotidler arasında uzunluğa sahip oligos in vivo, işlevleri ve kromozomal RNA / DNA hibritleri sonuçları ve DNA içine gömülü ribonucleotides, çalışma için uygun olabilir. RNA / DNA hibritleri kolayca hücreleri ve bu melez hücrelerin genetik bütünlüğü ne ölçüde etkileyebilir RNA / DNA hibritleri istikrarı hakkında çok az bilinmektedir, ancak, DNA replikasyonu, onarımı ve transkripsiyon sırasında oluşabilir. Bu nedenle, RNA içeren oligos, kromozomal DNA ribonucleotides tanıtmak ve RNA / DNA hibritleri seçilen uzunluğu ve taban kompozisyon oluşturmak için mükemmel bir vektör temsil eder. Burada, ökaryotik model sistem maya / Saccharomyces cerevisiae / genom içine ribonucleotides eklenmesi için protokol sunuyoruz . Ancak, laboratuvar kullanılan Thermo Scientific Dharmacon RNA içeren oligos bakterilerin insan hücreleri, farklı hücre sistemlerinde kromozomal düzeyde RNA / DNA hibritleri oluşturmak için.

Bu çalışma kromozomal düzeyde bir RNA / DNA hibrid formu ve maya hücreleri genomik DNA, RNA genetik bilginin transferi ortaya nasıl gösterir.

RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi

Sentetik kısa nükleik asit polimerleri olan oligonükleotidler (oligolar), moleküler biyolojinin en fonksiyonel ve yaygın kullanılan araçlarıdır. Oligolar ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, maya hücrelerini RNA içeren oligolarla transforme ederek canlı maya hücrelerinde kromozom düzeyinde RNA-DNA hibritleri oluşturmaktır. Bu, bölünen maya hücrelerine tek zincirli, RNA içeren bir oligo aktarılarak gerçekleştirilir. Oligo daha sonra, bir RNA-DNA hibriti oluşturmak için bir maya kromozomu üzerinde bulunan mutasyona uğramış bir marker genin tamamlayıcı bölgesiyle eşleşecektir; ikinci bir adım olarak, RNA içeren oligo ile transforme edilen hücreler seçici besiyerlerine ekilir.Bu işlem, oligonun RNA kısmının mutasyona uğramış marker genin düzeltilmesi için kalıp görevi gördüğü hücrelerin büyümesine olanak tanır. Ardından, RNA içeren oligonun gen düzeltme sıklığını belirlemek amacıyla seçici besiyerinde büyüyen maya koloneları sayılır ve elde edilen sonuçlar, oligonun RNA dizisinden maya genomundaki mutasyona uğramış marker gene genetik bilgi aktarımının gerçekleştiğini ortaya koyar. Bu durum; restriksiyon enzim sindirim analizi, sekans analizi ve alkali duyarlılık testi ile kanıtlanmaktadır.Merhaba, ben Georgia Teknoloji Enstitüsü biyoloji okulunda bulunan Dr. Francesca'nın laboratuvarı olan HIN'in kurucusuyum. Bugün size canlı maya hücrelerinde kromozomal düzeyde RNA-DNA hibritleri oluşturma prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, genomik DNA'ya gömülü RNA varlığının hücreler tarafından nasıl tolere edildiğini incelemek ve in vivo ortamda RNA-DNA hibrit stabilitesini hangi faktörlerin etkilediğini belirlemek için kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamadan önce; oligo tüpleri, pipetler, vorteks rafları, deney alanı ve araştırmacının giydiği eldivenler dahil olmak üzere deneyde kullanılacak tüm malzemeleri RNA dekontaminasyon solüsyonu ile silin. Olası RNA kontaminasyonlarını önlemek için prosedür boyunca RNA içermeyen su, kimyasal reaktifler, tüpler ve pipet uçları kullanın.Maya hücrelerinin genomik DNA'sına genetik bilgiyi aktarmak için RNA içeren bir oligo elde edin. Burada kullanılan maya suşu, iki baz kaybı ve bir nonsense mutasyonu içeren mutant bir trip five geni taşımaktadır. Böyle bir maya suşu, triptofan atrofik bir mutanttır ve triptofan içermeyen besiyerlerinde koloni oluşturmaz.RNA içeren oligo, delesyon mutasyonunu düzeltmek için tasarlanmış iki bazlık bir DNA insersiyonuna sahip 65 MER'dir. Ek olarak, oligo, elde edilen trip beş alelinin nonsense mutasyonunu düzeltmek için bir ribonükleotid içerir; yazılı protokolde açıklandığı şekilde, RNA içeren oligoyu 250 micromolar'lık bir stok çözelti olarak hazırlayın. RNA içeren oligo ile transformasyondan 16 saat önce inoküle edin.Beş mililitre zengin maya peptit dekstroz veya YPD sıvı besiyerine trip beş mutant maya hücreleri ekleyin ve hücreleri 30 °C'de gece boyunca büyütün. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, gece boyu büyütülen kültürden 1,5 mililitreyi 50 mililitre YPD sıvı besiyerine aktarın. Hücreleri, transformasyon çözme işleminden hemen önce 30 °C'lik bir çalkalayıcıda dakikada 225 devir hızında dört saat boyunca inkübe edin.RNA içeren oligoları ve karşılık gelen sadece DNA içeren oligoları buz üzerinde tutun. Karşılık gelen sadece DNA içeren oligolar pozitif kontrol olarak kullanılır. Oligoları, RNA içermeyen tüplerde, RNA içermeyen su ile 50 µM konsantrasyona seyreltin.Bir molün üç transformasyonu için yeterli örnek sağlamak amacıyla her bir oligonun 70 µL'sini hazırlayın; bazı fazlalık denatürasyon işlemleriyle birlikte, RNA içeren ve yalnızca DNA içeren oligoları oligoların sekonder yapılarını ortadan kaldırmak için 100 °C'lik ısı bloğunda iki dakika boyunca ısıtın. Denatürasyondan hemen sonra tüpleri, transformasyon gerçekleşene kadar buz üzerinde bekletin. Çözelti bir ve çözelti ikiyi transformasyondan hemen önce RNazsız tüplerde hazırlayın. Hücre kültürünü 50 mL'lik RNazsız bir tüpe aktarın ve 3000 rpm (1.562 ×g) hızda iki dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri 50 milliliters RNase içermeyen su ile yıkayın. Hücreleri tekrar dakikada 3000 devir hızında iki dakika boyunca santrifüjleyin. Kültür ortamından ve son santrifüjden sonra mevcut olabilecek tüm RNase'lerden kurtulmak için bu işlemi beş kez tekrarlayın.Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri beş mililitre çözelti içinde yeniden süspanse edin. Bir. Örneği dakikada 3000 devirde iki dakika boyunca santrifüj edin, süpernatantı dökün ve hücrelere 250 mikrolitre çözelti bir ekleyin. Bu hücre miktarı yedi ila sekiz transformasyon için yeterlidir.Hücre süspansiyonunun 50 µL'sini, RNA içermeyen yedi adet mikro santrifüj tüpünün her birine paylaştırın. Ardından, üç tüpe 50 µM konsantrasyonunda RNA içeren oligodan 20 µL; üç tüpe 50 µM konsantrasyonunda yalnızca DNA içeren oligodan 20 µL ve negatif kontrol için bir tüpe oligo içermeyen 20 µL steril su ekleyin.Ardından, yedi transformasyon reaksiyonunun her birine 300 µL çözelti iki ekleyin. Bileşenleri karıştırmak için örnekleri kuvvetlice vorteksleyin. İnkübasyonun ardından, transformasyon reaksiyonlarını bir çalkalayıcıda 30 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.Numunelere 42 °C'de 15 dakika boyunca ısı şoku uygulayın. Ardından hücreleri, 2.236 ×g'ye karşılık gelen dakikada 5.000 devir hızında dört dakika boyunca santrifüj edin. SUP ajanını uzaklaştırın ve üç tüpün her biri için hücreleri 100 µL steril su içerisinde yeniden süspande edin.Bu hücre süspansiyonundan bir alikot alın ve her bir alikotu steril su ile 100.000 kat seyreltin. Plaka başına yaklaşık 15 steril cam boncuk ekleyin ve 100.000 kat seyreltilmiş hücrelerden 100 µL'yi üç adet YPD plakasına ekleyin. Her bir transformasyon reaksiyonundan elde edilen resüspande hücrelerden 100 µL'yi triptofan içermeyen sentetik komple katı besiyeri içeren bir Petri kabına ekleyin ve plakaları eşit şekilde çalkalayın.Ardından boncukları uzaklaştırın. Hücreleri YPD plaklarında 30 °C'de iki gün boyunca ve triptofan içermeyen sentetik komple katı ortamda ekili hücreleri 30 °C'de dört ila beş gün boyunca inkübe edin. RNA içeren oligo, sadece DNA içeren oligo ve oligo içermeyen kontrol için gen düzeltme frekansını hesaplamak amacıyla, seçici ortamda ve YPD ortamında büyüyen koloni sayılarını sayın ve karşılaştırın.Hücrelere oligolar eklenmediğinde seçici ortamda hiç koloni oluşumu beklenmez; tek koloni izolatları elde etmek için rastgele seçilen birkaç transforme koloniyi YPD ortamına çizgi şeklinde ekin. Koloni büyümesi için hücreleri 30 °C'de iki gün boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, birkaç tek koloni seçin ve YPD ile seçici ortam üzerine yamalar (patch) yapın.Bir günlük inkübasyonun ardından, triptofan içermeyen sentetik tam katı besiyerinde, oligo ile transforme edilmiş hücrelerde büyüme gözlemlenirken, triptofan içermeyen seçici sentetik tam katı besiyerindeki oligosuz kontrol suşunda büyüme gözlemlenmez. Ardından, koloni PCR'ına başlamak için koloni PCR'ı kullanarak RNA içeren oligonun hedeflediği bölgeyi amplifiye edecek bir primer çifti tasarlayın. Münferit bölgelerden alınan hücreleri, bir ünite liyaz içeren 50 µL su içerisinde yeniden süspande edin; hücreleri parçalamak ve genomik DNA'nın çözeltiye salınmasını sağlamak için örnekleri önce 10 dakika boyunca oda sıcaklığında, ardından beş dakika boyunca 100 °C'deki bir ısıtma bloğunda inkübe edin.PCR reaksiyonlarını PCR tüplerinde hazırlayın, her bir tüp düzeneğine 10 µL hücre süspansiyonu ekleyin ve amplifikasyon reaksiyonunu yazılı protokolde açıklandığı şekilde gerçekleştirin. PCR ürününü gözlemlemek için elde edilen örnekleri %1'lik agaroz jelde yürütün. Bu deneyde oligo içeren RNA tarafından aktarılan genetik bilgi, maya genomik hedef bölgesinde yeni bir VAN 91 1 restriksiyon bölgesi oluşturduğundan, PCR ürününün van 91 1 restriksiyon enzimi ile sindirilmesiyle bilginin doğru aktarıldığı doğrulanabilir.Sindirimi reaksiyonunu altı µL PCR ürünü, tampon çözelti, 0.5 µL BSA, restriksiyon enzimi ve toplam hacim 15 µL olacak şekilde steril su içerecek şekilde hazırlayın. Numuneleri 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. RNA içeren oligonun RNA dizisi tarafından aktarılan genetik modifikasyonu gözlemlemek için, sindirilmemiş bir numuneyi sindirilmiş numunelerle birlikte %2'lik bir agaroz jelinin aynı sırasına yükleyip çalıştırın.PCR ürünlerini bir PCR saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın ve DNA dizileme için hazırlayın. Numuneleri, ürünü amplifiye etmek için kullanılan primerlerle aynı primerler kullanılarak dizilemeye gönderin. Son olarak, her reaksiyon için RNA içeren oligonun bir molünü veya yalnızca DNA içeren oligoyu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktararak RNA içeren oligonun alkali işlemini gerçekleştirmek amacıyla, birden fazla dizinin seçilen bir referans diziyle hizalanmasına olanak tanıyan bir yazılım kullanarak DNA dizileme sonuçlarını analiz edin.Ardından, hidroliz için bir molar sodyum hidroksitin dört mikrolitresini veya negatif kontrol için dört mikrolitre su ekleyin. İnkübasyonun ardından numuneleri bir saat boyunca 65 °C'deki bir su banyosunda inkübe edin. Reaksiyonu buza aktarın.Hidroliz reaksiyonunu iki mikrolitre 1.2 molar hidroklorik asit, dört mikrolitre bir molar tris hidroklorür ve negatif kontrol için dört mikrolitre su ile nötralize edin. Altı mikrolitre su ve dört mikrolitre bir molar tris hidroklorür ekleyin. Örnekleri, gerçekleştirilebilecek olan transformasyona kadar buz üzerinde tutun.Az önce açıklandığı gibi, herhangi bir oligo ile transforme edilmemiş maya hücreleri, triptofan içermeyen sentetik komple katı besiyerinde koloni oluşturmazlar. Buna karşılık, RNA içeren oligo ile transforme edilen hücreler, triptofan içermeyen sentetik komple katı besiyerinde büyütüldüğünde koloni oluştururlar.Hücreler sadece kontrol oligo olan bir nanomol ilgili DNA ile transforme edildikten sonra, maya kolonileri triptofan içermeyen sentetik komple katı besiyerinde de büyür; RNA içeren oligodan maya kromozomal DNA'sına genetik bilgi aktarımının gerçekleştiği, gösterildiği üzere hedeflenen genomik bölgeyi çoğaltan PCR ürününün VAN 91 1 restriksiyon sindirimi ile belirgindir. Trip. beş mutant suşunun genomik DNA'sından çoğaltılan trip. beş lokusunun PCR ürünü görülebilmektedir.Ayrıca, DNA'ya özel oligo ile hedeflenen bir trip plus koloniden elde edilen genomik DNA'dan amplifiye edilen PCR ürünü gösterilmiştir. RNA içeren oligo ile hedeflenen trip plus kolonilerinden elde edilen genomik DNA'dan amplifiye edilen PCR ürünleri de jele yüklenmiştir. Aynı PCR ürünlerinin van 91 1 kısıtlama enzim sindirimi sonuçları, 278 baz çiftlik bir amplifiye PCR bandı ile van 91 1 sindirimi sonucunda oluşan 177 baz çiftlik ve 101 baz çiftlik sindirim ürünü bantlarını ortaya çıkarmaktadır.DNA dizilemesi, buradaki RNA içeren oligo ile gerçekleştirilen gen düzeltmesini ortaya koymaktadır. RNA içeren oligo tarafından hedeflenen genomik bölgenin DNA elektroferogramı gösterilmiştir. DNA dizisindeki g, RNA içeren oligo go'daki RG'den kaynaklanmaktadır.Ayrıca kutu içerisinde, yalnızca DNA içeren oligo ve RNA içeren oligo tarafından hedeflenen trip beş bölgesinin CG baz dizilerinin trip artı transformantlarına eklenmesi yer almaktadır; bunlar konsensus dizisiyle eşleşmekte ve oligo hedeflemesi öncesindeki trip beş mutant hücrelerinkilerle karşılaştırılmaktadır. Alttaki onarım RNA içeren oligoda, iki bazlık bir DNA eklemesi ve bir bazlık bir RNA substitusyonu bulunmaktadır.Mavi kutu ve sarı gölge ile belirtilen bölgeler, hem RNA içeren oligonun hem de sadece DNA içeren oligonun, test edilen tüm örneklerde delesyon mutasyonunu ve anlamsız mutasyonu kesin olarak düzelttiğini göstermektedir; kesikli çizgiler RNA içeren oligo dizisinin konumunu belirtmektedir. Alkali işlemi, RNA içeren oligo tarafından gerçekleştirilen gen düzeltmesini engellemektedir; RNA içeren oligo ve sadece DNA içeren oligo ile gerçekleşen transformasyon frekansı gösterilmiştir. Hata çubukları, her bir oligo için üç bağımsız transformasyonun ortalamasının standart hatasını temsil etmektedir.Sadece DNA içeren oligo, sodyum hidroksit işlemiyle ve işlemsiz benzer transformasyon sıklığı sergiler. Buna karşın, RNA içeren oligo ile transformasyon sıklığı, sodyum hidroksit uygulamasının ardından sıfıra iner. Bu nedenle, RNA içeren oligo ile yapılan hazırlık, sadece DNA içeren oligo ile kontamine olmamıştır.Böylece, gözlemlenen transformasyon frekansı RNA içeren oligoya özgüdür. Size kromozomal düzeyde bir RNA-DNA hibriti oluşturmayı ve maya hücrelerinde genetik bilginin RNA'dan genomik DNA'ya aktarımını incelemeyi gösterdik. Bu prosedürü uygularken, RNA içeren oligoların mükemmel kalitede olduğundan emin olmak ve RNA'dan arındırılmış koşullar altında çalışmak önemlidir.İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

generation-rnadna-hybrids-genomic-dna-transformation-using-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

RNA müdahalesi (RNAi) gen nakavt üzerinden pek çok avantajı sahip ve geniş gen işlevsel çalışmalarda bir araç olarak kullanılmıştır. DNA vektör tabanlı RNAi teknolojisi buluşu uzun vadeli ve olası indüklenebilir gen Knockdown yaptı, hem de gen susturulması fizibilite...

Kanser gen Fonksiyon Eğitim için DNA vektör tabanlı RNA Girişim

Gen ekspresyonu, mutasyonlar ve gen füzyonları için seçilen transkriptleri sorgulamak için indekslenmiş cDNA kütüphanelerinin hazırlanmasını, özel problarla hibridizasyon ve yakalama ve veri analizini içeren hedefli RNA dizileme tabanlı bir yöntemi tanımlıyoruz. Hedeflenen RNAseq, seçilen transkriptlerin bir masaüstü sıralayıcıda uygun maliyetli, hızlı bir şekilde değerlendirilmesine izin verir.

RNA Sıralama Deneyi Gen İfade ve Genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen

Bu makale, C2'- O -konumunda modifiye edilmiş RNA dodekamerlerinin katı faz sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu hakkında ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. UV-vis ve dairesiz dikroizyum fotometrik analizleri yapısal yönleri, yani tek telli veya çift telli elektronları ölçmek ve karakterize etmek için kullanılır.

Bir 2&#39;-amino asit içeren RNA Oligomerlerinin Katı Faz Sentezi Protokolü<em&gt; Ç</em&gt; Tiyofenilmetil Değiştirme ve Sirküler Dikroizm ile Karakterizasyonlar

Bu iletişim kuralı iş akışı sistemi onarıma memeli hücrelerinde noktası mutasyonların düzenleme CRISPR/Cas9-tabanlı bir gen özetliyor. Burada, gen Indel oluşumu hedef sitesindeki ölçmek için detaylı bir follow-on deneysel stratejisi ile düzenleme bir Kombinatorik yaklaşım kullanın — özünde, yerinde mutagenesis analiz.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Endogenously kurulan mRNA-protein kompleksleri kurtarılması için bir tandem RNA izolasyon yordam (seyahat) açıklanmıştır. Özellikle, çapraz vivo içindeRNA-protein kompleksleri vardır, poliadenile RNA'ların özleri ile oligo(dT) boncuk etkilenmezsiniz ve belirli mRNA'ların değiştirilmiş RNA antianlamlı oligonucleotides ile yakalanır. MRNA'ların için bağlı proteinler immunoblot analizi ile tespit edilir.

Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

Bu makalede, yerinde üretilen nükleik asit mikrodizilerinin sentezi ve uygulamalarındaki yeni gelişmeleri sunmakta ve tartışıyoruz. Özellikle, DNA sentezi protokollerinin RNA'ya nasıl genişletilebileceğini ve mikrodizilerin geri alınabilir nükleik asit kitaplıkları oluşturmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Yüksek Yoğunluklu DNA ve RNA mikrodizileri - Fotolitografik Sentez, Hibridizasyon ve Büyük Nükleik Asit Kütüphanelerinin Hazırlanması

RNA paraziti, gen ekspresyonunu belirli gelişimsel evrelerde manipüle etmek için yaygın olarak uygulanabilir ve güçlü bir tekniktir. Burada, sudalış böceği Thermonectus marmoratusbu tekniğiuygulamak için gerekli adımları açıklar , gen dizilerinin edinimi gelen yapı veya davranışı etkileyen genlerin yıkılması.

Belirli Gelişimsel Zaman Noktalarında Gen İfadesi Manipüle Etmek Için Güçlü Bir Araç Olarak Su Böcekleri RNA Girişim

In vitro transkripsiyon reaksiyonlarını düzenlemek için yeni bir DNA bağlı T7 RNA polimerazının mühendisliğini anlatıyoruz. Protein sentezi ve karakterizasyonu için adımları tartışıyoruz, kavram kanıtı transkripsiyonel düzenlemeyi doğrulıyoruz ve moleküler bilgi işlem, teşhis ve moleküler bilgi işlemedeki uygulamalarını tartışıyoruz.

Programlanabilir In vitro Transkripsiyon ve Moleküler Hesaplama için DNA-Bağlı RNA Polimeraz

Protokol, hataya açık PCR ve ters genetik kullanarak tam uzunlukta mutant RNA sentezini birleştirerek hepatit C virüsü genomunda kontrol edilebilir genetik çeşitliliği tanıtmak için bir yöntemi açıklar. Yöntem, fenotip seçimi için bir model sağlar ve 10 kb uzunluğunda pozitif anlamlı RNA virüs genomları için kullanılabilir.

Pozitif Anlamlı RNA Virüsü Varyantlarını Tasarlamak için Tersine Genetik

Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

Öğrenin, maya hücrelerinde RNA içeren oligonükleotidler kullanarak kromozomal düzeyde RNA/DNA hibritleri oluşturma yöntemini. Bu teknik, genetik bilginin RNA'dan genomik DNA'ya aktarımını incelemek için kullanılır.

RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi

Daha fazla video keşfet