Name: Medulloblastom Hücre bağışıklık Fare İntrakranial Ortotopik Allografting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 10 s
Description: Öğrenin medulloblastoma doku izolasyonu ve bağışıklık sistemi baskılanmış farelere intrakraniyal allogreft yöntemini. Bu teknik ikincil tümör oluşumunu in vivo ortamda çalışmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmada, Vanderbilt-Ingram Kanser Merkezi Destek Hibe (P30 CA068485), Çocukluk Çağı Beyin Tümörü Vakfı ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NS042205) hibe ile desteklendi.

1. Tümör taşıyan Serebellum ve Tümör Doku ayrılma Micro-diseksiyonu <ol><li> Tümör dokusu alımı <ol><li> Medulloblastom taşıyan Hasta fareler genellikle runted ve hidrosefali ve posterior felç ve devrik zaman duruş yeniden yetmezliği de dahil olmak üzere tipik bir nörolojik semptomlar gösterilecek. Tümör dokusu almak için, karbon dioksit Solunduğunda fareler euthanize. Servikal dislokasyon, posterior kafatasına basınç oluşturur ve tümör dokusu bütünlüğünü tehlikeye düşürebilecek bir prosedür gerçekleştirmek için imporant. </li><li> Decapitation kafatası iyi bir görünüm için saç ve kas dokusu mümkün olduğunca ortadan kaldırarak, bir makas kullanarak ölümünden sonra hemen yapılır. Kafatası yüzeyi,% 95 etanol ile ıslatılmış Kimwipe ile temizleyin. </li><li> Ince makas, kafatasının orta hat boyunca bir açılış kesmek ve kafatası doku tümör taşıyan serebellum da dahil olmak üzere tüm beyin maruz kalmaktadır, bu noktada ince cımbız kullanarak kaldırmak için kullanın. </li><li> Sağlıklı yetişkinlerin cerebella iyi tanımlanmış hemisferlerin ve vermis görüntüler, Tümör taşıyan farelere cerebella genellikle düz bir yüzey ve göze çarpan kan damarları ile amorf, büyümüş. Steril teknikleri kullanarak, buz fosfat cımbız ve yer kullanarak serebellar tümör almak Mg 2 olmadan tamponlu salin (PBS) + ve Ca 2 +. </li></ol></li></ol> Not: tüm araçları kullanmadan önce otoklava% 95 etanol ve buhar dezenfekte edilmektedir. <ol start="2"><li> Tümör dokusu Fototerapisi <ol><li> 4 dakika boyunca oda sıcaklığında 3 dakika 37 inkübasyon tarafından ince makas, ° C ile doku kıyma, PBS den 4 kez tümör dokusu hacmi yaklaşık% 50 Accutase (PBS içinde seyreltilmesi) tümör dokusu transferi sonra doku ilave bir 3 dakika için 1 ml Pipetman tekrarlayan pipeting uğrar. Bu yöntem, tek hücre ve küçük hücresel agrega karışımı boyun eğmek zorundadır. </li><li> Hücresel süspansiyon PBS ve 1000xg pelet hücreleri için 5 dakika süreyle santrifüj ile 3 kat sulandırınız. (Yukarıdaki prosedürler vallahi basın, &quot;medulloblastom kök hücrelerin izolasyonu, zenginleştirme ve bakım&quot; olarak tarif edilmiştir) </li></ol></li></ol> Glutamin, Penisilin-Streptomisin, N2, B27, insan EGF (25 ng / ml) ve temel FGF (25 ng / ml) ile Neurobasal orta oluşan taze hazırlanmış sinir kök hücre orta hücre pelletini tekrar. Çözümün hücre yoğunluğu hesaplayın ve uygun daha fazla dilüsyonları bir ayrışmış tümör hücrelerinin uygun bir numarası, örneğin 5x10 5, steril bir konik uçlu 10μL şırınga içine 4 mcL çözüm yük ki bu tür ek sinir kök hücre orta yapmak . Inoküle hücreleri tam sayısı spesifik deneysel gereksinimlerine uygun olarak araştırmacı tarafından belirlenmelidir. Bir mini 200μL mikrosantrifüj tüp hücre çözümü (PCR tüp) buz üzerinde tutun. 2. Alıcı Fare Anestezik Prosedürleri Cerrahi işlem için, kemirgen cerrahi adanmış bir dezenfekte alan prosedürün süresi için gereklidir. İdeal olarak, hayvan hazırlanması, faaliyet alanı ve hayvan kurtarma için ayrı fakat bitişik alanları ile uzun bir tezgah kurdu. Cerrahi eldivenler, muayene eldivenleri, ameliyat için gerekli. Aseptik teknik, bel üzerinde eldivenli ellerini tutarak muhafaza ve sadece kuru steril bir yüzey steril nesneleri işlemek için kullanılır. <ol><li> Ketamin (fare ağırlığı 1 kg başına 100 mg ketamin) ve xylazine (fare ağırlığı 1 kg başına 10 mg ksilizin) oluşan bir karışım anestezi için kullanılır. Anestezikler intraperitoneal Yönetici. </li><li> Genellikle tam etkili olabilmesi için anestezikler için 3-5 dakika sürer. Bir farenin ayak / kuyruk tutam tam anestezi olup olmadığını belirleyin. Oftalmik merhem fare gözleri küçük bir miktar koyun. Sürekli fare normal nefes olduğundan emin olmak için izleme, işletim alanı için tam anestezi fare getirin. </li></ol> 3. Tümör Hücrelerinin Aşılama İntrakranial <ol><li> , Orta beyin ve beyincik yukarıdaki posterior kafatası ortaya çıkarmak için bir saç kesme makinesi kullanarak fare dorsal arka baş bölgesinde, tıraş. </li><li> Alkol ped ile silerek bir pamuk uçlu aplikatör kullanarak maruz kalan kafa derisi Betadine çözümü uygulayın. Bu iki sterilizasyon adımları iki kez tekrarlayın. </li><li> Steril bir neşter kullanılarak posterior kafa derisi çeyrek inç kesi olun. Matkap sağ 0,5 mm burr hole 2 mm ve 2 mm steril bir diş matkap kullanarak lambda posterior. </li><li> Fare çerçevesinde tutun üzerine kesiciler çengel stereotaktik çerçeve üzerine yerleştirin. Dikkatle ineceği ve çapak deliğe tümör hücre çözümü 4 mcL yüklü konik uçlu 10 mcL şırınga pozisyon. Syri kez eğimnge iğne kafatası yüzeyi altında, başka bir 3 mm alçalma ve daha sonra 0.5 mm yükselmek. Yavaşça alıcının beyincik, 30 saniyelik bir zaman dilimi içinde sabit bir güçle, tümör hücrelerinin istenilen miktarda enjekte. Onun yerine iğne, enjeksiyon tamamlanmasından sonra ek bir iki dakika bırakın. Daha sonra iğne ve şırınga çıkarın. AutoCLIP kullanarak yara Klip. </li><li> Kendi vücut ısısını korumaya yardımcı olmak için, ameliyat sonrası bir ısınma battaniye üzerinde fare tutun. Hareketlilik ve solunum desenler sürekli izlenecektir. Fare anestezi kurtarır sonra, steril bir konut kafesine geri koyun. Gıda ve su alımı, davranış, tımar ve gözleri kırmızı boyanması için günlük izleyin. Kesi yerinde enfeksiyon belirtileri için kontrol edin. Gün 7 cerrahi sonrası autoclips çıkarın. 2-6 ay ortalama fareler korumak ve ileri çalışmalar için tipik medulloblastom belirtileri gösteren bu fedakarlık. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar İkincil medülloblastomlar alıcı farelerde geliştirilen yüksek birincil tümörlerin benziyordu. Cerebella ikincil tümörleri taşıyan tüm bağlar olarak bakıldığında genellikle belirgin ektopik kan damarları ile amorf, büyümüş. Ikincil tümör dokusu immünohistokimyasal analizleri, tümör hücrelerinin, açık, güçlü SmoM2 YFP ve Math1 ve Pax6 gibi serebellar granül nöron öncüleri, belirteçleri yüksek proliferatif olduğunu ortaya çıkardı. Ayrışmış ve kültür rapor yöntemleri kullanarak (&quot;İzolasyon, zenginleştirme ve medulloblastom kök hücreleri bakım&quot; tuşuna basın Jüpiter), ikincil medulloblastom tümör hücreleri hızla genişledi olabilir zaman, açık birden fazla kök hücre belirteçleri, clonogenic ve daha fazla tümör oluşumunu başlatabilir ek immün sistemi baskılanmış alıcıları naklediliyor. <img src="/files/ftp_upload/2153/2153fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Tipik tüm montaj ve ikincil medulloblastom doku kesit 5x10 5 primer tümör hücrelerinin enjeksiyonundan 26 gün sonra gelişen ikincil medulloblastom dokusu tipik bir örneği. Hematoksilen boyama yüksek sitoplazmik / nükleer oranı ve nükleer polimorfizm de dahil olmak üzere, tipik hücresel morfoloji medulloblastom ortaya koymaktadır. Ki67 ifade belirtildiği gibi bu ikincil tümör hücrelerinin yüksek proliferatif ve aynı zamanda güçlü bir membranöz SmoM2-YFP ifade. <img src="/files/ftp_upload/2153/2153fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. İkincil medulloblastom hücrelerin in vitro kültürü ve genişletilebilir Birincil fare medulloblastom hücreleri (&quot;İzolasyon, zenginleştirme ve medulloblastom kök hücreleri bakım&quot; tuşuna basın Jüpiter) açıklanan protokol kullanarak, bu ikincil medulloblastom hücrelerinin kültürlü ve birden fazla geçit için genişletilmiş. Resim, 4 gün ve 14 gün kültüre aynı temsilcisi tümör koloni gösterir. Kültür tümör hücrelerini bipolar, uzun hücresel agrega yoğun bir çekirdek genellikle yetersizdir sitoplazma ve yayar. Bu büyüme temas inhibisyonu göstermezler. Küçük yuvarlak hücreler kırmızı kan hücreleri vardır.

<ol><li>Schuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+granule+neuron+precursor+identity+is+a+critical+determinant+of+progenitor+cell+competence+to+form+Shh-induced+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Acquisition of granule neuron precursor identity is a critical determinant of progenitor cell competence to form Shh-induced medulloblastoma.</a> Cancer Cell. 14, 123-134 (2008).</li>
<li>Yang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li>
<li>Kessler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+alters+the+fate+of+preneoplastic+cells+in+a+mouse+model+of+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">N-myc alters the fate of preneoplastic cells in a mouse model of medulloblastoma.</a> Genes Dev. 23, 157-170 (2009).</li>
<li>Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y., Y, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+Atoh1+disrupts+Sonic+Hedgehog+signaling+in+the+developing+cerebellum+and+prevents+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma.</a> Science. 326, 1424-1427 (2009).</li>
<li>Salsano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+neurogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+NEUROG1+identifies+a+subgroup+of+medulloblastomas+not+expressing+ATOH1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Expression of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor NEUROG1 identifies a subgroup of medulloblastomas not expressing ATOH1.</a> Neuro Oncol. 9, 298-307 (2007).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Verim ikincil tümör oluşumu aşağıdaki gibidir allografting başarılı medulloblastom hücre sağlamak için birkaç kritik faktörler: Birincisi, sadece doku disosiasyon için% 50 Accutase kullanımı ve uzun süreli enzim tedavisi hücre canlılığını anlamlı bir azalma yol olarak doku üzerinde sindirimi yoktur. Ayrıca sadece 1 mL boyutu Pipetman küçük ipuçları da ayrışmış hücreleri fiziksel hasar oluşturabilir kullanın. Allografting için tek hücreler ve küçük agrega karışımı ince. İkincisi, Hamilton şırınga yüklemeden önce karıştır...

<table><tbody><tr><td>Neurobasal besiyeri</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td>25ng/ml</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td>25ng/ml</td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B27(-RA)</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td>50% </td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>2mM</td></tr><tr><td>Stereotaksik cihaz</td><td>Stoelting Co.</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Foredom esnek şaftlı matkap, askılı tip</td><td>Stoelting Co.</td><td>58650</td><td></td></tr><tr><td>Büyük prob tutucu</td><td>Stoelting Co.</td><td>51633</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L şırınga, 26 ga., eğimli uç</td><td>Stoelting Co.</td><td>51105</td><td></td></tr><tr><td>Matkap ucu .75mm</td><td>Stoelting Co.</td><td>51455-3</td><td></td></tr></tbody></table>

medulloblastom hücre bağışıklık fare İntrakranial ortotopik allografting

Intracranial Orthotopic Allografting of Medulloblastoma Cells in Immunocompromised Mice

Medulloblastom, sinir sistemi, en sık görülen pediatrik tümördür. Hayvan çalışmalarında büyük bir vücut medulloblastom 1-4 hücre kökenli olarak serebellar granül nöron öncüleri (CGNPs) odaklanmıştır. Ancak, insan hasta (nodüler desmoplastik, klasik ve hücre / anaplastik büyük) ve medulloblastom ektopik CGNP işaretleyici 5 herhangi bir ifade ile insan hastaların bir alt kümesi bulundu olduğu gerçeğini, medulloblastom alt tiplerinin farklı klinik sunumlar öneririz. medulloblastom hücresel ve moleküler kökenleri, çok daha karmaşık ve tamamen deşifre. Bu nedenle, hücre tipi özel bir tedavi yöntemi geliştirdi dayalı alternatif medulloblastom tümör hücre-kökenli olup olmadığını belirlemek için esastır. Bu amaçla, alıcıların ikincil tümör gelişiminin sonraki analizlerde takip genetik olarak işaretlenmiş tümör hücre tiplerinin allografting intrakranial tümör başlatan hücreleri hücresel kökenli ortotopik belirlenmesini sağlayacaktır. Burada intrakranial ortotopik medulloblastom primer tümör dokusundan elde edilen hücreler, allografting için deney protokolünde tanımlamak ve bu prosedür de kurulan hücre hatları hücrelerin nakli için kullanılabilir.

Bu protokol, fare medulloblastom doku izolasyon ve ayrılma açıklar ve ikincil medulloblastom başlatmak için immün sistemi baskılanmış alıcı farelere tümör hücrelerinin sonraki allografting.

Medulloblastom Hücre bağışıklık Fare İntrakranial Ortotopik Allografting

Medulloblastoma, sinir sisteminin en yaygın çocukluk çağı tümörüdür. Çok sayıda hayvan çalışması, serebellar granül nöronlarına odaklanmıştır...

Bu prosedürün genel amacı, ikincil bir tümör başlatmak için immün yetmezliği olan bir konakçıya topikal olarak allogreft medulloblastom tümör hücreleri nakletmektir. Bu işlem, öncelikle primer medulloblastom dokusunun tek hücrelere ve küçük hücresel agregatlara ayrıştırılmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, immün yetmezliği olan farelerin intrakraniyal enjeksiyona hazırlanmasıdır.Prosedürün üçüncü adımı, tümör hücrelerinin konakçı serebellumuna mikroenjeksiyonunun gerçekleştirilmesidir. Prosedürün son aşamaları, tümör hücresi nakledilen konakçıların bakımının yapılması ve gözlemlenmesidir. Nihayetinde, görülen nörolojik semptomlar ve histolojik analiz yoluyla konakçılarda sekonder medulloblastom oluşumunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu teknik, bir tümörün hücresel kökeninin belirlenmesi ve tümörlerin başlaması ve yayılması için önemli olan faktörler gibi kanser biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Eşlik eden video makalesinde açıklandığı üzere, sparing medulloblastoma tümör dokusunu mikrodisekt edin ve disosiye edin, medulloblastoma hücre hatlarının izolasyonu, zenginleştirilmesi ve sürdürülmesi için tümör hücresi süspansiyonunu, 4 µ

intracranial-orthotopic-allografting-medulloblastoma-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Insan retinoblastom farelerde tümörlerin yaymak için bir yöntem açıklanmıştır. Tümör hücreleri bağışıklık eksikliği olan farelerde gözlerinin içine doğrudan enjekte edilir. İkincil tümörlerin başarıyla doğrudan insan tümörleri ve kültürlü tumorspheres hasat hücreler kullanılarak kurulmuştur.

Bağışıklık Eksik Fare Kuruluş ve İnsan Retinoblastom Tümörler yayılımı

Bu makalenin amacı, kemoradyoterapi çalışmaları için ortotopik glioblastoma modelinin kullanımı tanımlamaktır. Bu makale implante, hücre işleme rağmen gitmek ve bir intrakraniyal modeli kullanarak farenin radyoterapi olacaktır.

Bir Ortotopik Fare Beyin Tümörü Modelinde Kombinasyon Radyoterapi

Bu video, intrakraniyal enjeksiyon yapılarak fare beynine tümör hücrelerinin implantasyonunu göstermektedir.

İntrakraniyal Ortotopik Model: Fare Beynine Kanser Hücrelerini İmplante Etme Prosedürü

Malign gliomalar, farklı klinik ve moleküler özelliklere sahip heterojen bir yüksek infiltive glial neoplazm grubunu oluşturur. Primer ortotopik ksinograftlar preklinik hayvan modellerinde malign glioma alt tiplerinin histopatolojik ve moleküler özelliklerini rekapitulate eder.

Primer Ortotopik Glioma Xenografts Infiltratif Büyüme ve İsocitrat Dehidrogenaz I Mutasyonu Rekapitulate

Biz, tümörün büyüme sırasında oynayan normal biyo-fiziksel kısıtlamalar tekrarıdır intravital iki foton mikroskopi için farelerde kortikal glioblastoma ortotopik bir model oluşturduk. Tümörün yukarıdaki kafatasını yerine bir kronik cam pencere, iki-foton mikroskobu ile zamanla tümörün ilerlemesinin takibini sağlar.

Ortotopik Glioblastoma Fare Modeli Beyin parankim fiziksel kısıtlamaları bakımı ve Intravital İki foton Mikroskopi için uygundur

Kök hücreler tümör tropizminden ötürü beyin tümörlerini tedavi etmek için terapötik taşıyıcıları umut vericidir. Non-invaziv intranazal kök hücre iletimi kan beyin bariyerini atlar ve klinik çeviri için güçlü bir potansiyel gösterir. Bu makale, glioma fare modelinde intranazal kök hücre sunumunun temel ilkelerini özetlemektedir.

Bir Fare Modelinde Tedavi Edici Kök Hücrelerin Glioblastomaya İntranazal Dağıtımı

Tümör arayan tedavi mezenkimal kök hücre (MSCs) invaziv glioblastoma için bir tedavi olarak umut verici. En uygun nakli MSCs teslimini iskele Tümör rezeksiyonu den içine içerir. Burada, glioblastoma tedavisinde MSC çalışmaya preklinik teknikleri de dahil olmak üzere sağlanan: görüntü güdümlü Tümör rezeksiyonu; MSC numaralı seribaşı iskele implantasyonu; ve ameliyat sonrası terapi izleme.

Görüntü güdümlü rezeksiyon Glioblastoma ve kafa içi tedavi kök hücre numaralı seribaşı iskele implantasyonu

Burada, orthotopic insan birincil beyin tümörü taşıyan immünyetmezligi farelerde hazırlık ve allojenik insan lenfosit stereotaksik yönetim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çalışmada bir kanıtı-of-concept fizibilite ve hücresel immunotherapies intrabrain teslim antitümör etkinliği için sağlar.

Orthotopic insan Glioblastoma Multiforme Xenografts fare modelleri sitotoksik bağışıklık hücrelerinin stereotaksik evlat edinen Transfer

Burada, genetiği değiştirilmiş fare modeli tümörlerinden türetilen hücrelerin intrakraniyal enjeksiyonu ile kurulan GBM için klinik öncesi bir ortotopik fare modelini tarif ediyoruz. Bu model, insan GBM'sinin hastalık özelliklerini gösterir. Translasyonel çalışmalar için, fare beyin tümörü in vivo MRG ve histopatoloji ile izlenir.

Glioblastoma multiforme'un Translasyonel Ortotopik Modelleri

Ortotopik pediatrik beyin tümörü modellerinin geliştirilmesi, kanser hücrelerini hassas bir şekilde implante etmek için stereotaksik bir cihaz kullanarak titiz bir hassasiyet gerektirir. Burada sunulan metodoloji, beyin tümörü hücrelerinin hazırlanması, intrakraniyal enjeksiyonların gerçekleştirilmesi ve beyin tümörü aşılanmasını değerlendirmek için ameliyat sonrası bir izleme sisteminin uygulanmasında yer alan adımları özetlemektedir.

Stereotaksik Cihaz Kullanılarak Beyin Tümörleri İçin Ortotopik Hasta Kaynaklı Ksenogreft Modellerinin Oluşturulması

Bu protokolün amacı, araştırmacılara intrakraniyal implantasyonlar için son derece tekrarlanabilir bir teknik sunmaktır.

Farelerde glioblastoma hasta kaynaklı ksenograft hücre hatlarının stereotaktik intrakranial implantasyonu

Öğrenin medulloblastoma doku izolasyonu ve bağışıklık sistemi baskılanmış farelere intrakraniyal allogreft yöntemini. Bu teknik ikincil tümör oluşumunu in vivo ortamda çalışmak için kullanılır.

Medulloblastom Hücre bağışıklık Fare İntrakranial Ortotopik Allografting

Daha fazla video keşfet