Name: Kültür İlköğretim Fare Embriyonik Fibroblastlar Sinyal Molekülleri Adenovirüs aracılı Genetik Kaldırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Öğrenin, adenovirüs aracılı Cre rekombinaz ile fare embriyonik fibroblastlarda koşullu gen silme yöntemini. Rac1'in aktin dinamiğindeki rolünü incelemek için kullanılan bu teknik, gen fonksiyonu çalışmalarında yüksek verimlilik sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Toronto, Ontario bölgesindeki Mount Sinai Hastanesi Dr. Rizaldy Scott birincil Rac1 Flox / Flox fare embriyonik fibroblastlar onun hediye için teşekkür etmek istiyorum . Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR, 2.009-93.526 MOP) ve Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC 327.372-06 RG) Enstitüleri NJ hibe işletim tarafından desteklenmiştir. SH ve MW CGSMA ve sırasıyla CIHR ve NSERC, KKS-M ödül tarafından desteklenmektedir. Steve Hawley ve Melanie Wills bu kağıt için aynı derecede katkıda bulunmuştur.

Çözülme hücreleri <ol><li> Sıvı azot donmuş fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) (bireysel embriyo primer kültürlerden gelen, daha önce oluşturulan) alın. </li><li> 37 flakon çeker çözülme hücreleri ° C su içeriğini tamamen çözülmüş kadar dönen. </li><li> 10cm hücre kültürü plakası% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiştir DMEM 9ml ekleyin. </li><li> Plaka açılan akıllıca çözülmüş hücre süspansiyonu ekleyin, 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör gecede hücrelerin ve dağıtmak için yer plaka plaka hafifçe sallayın. Hücreleri DMSO (donma süreci) duyarlı hücreleri (yaklaşık dört saat sonra kaplama) plaka yapıştırılır sonra, ilk medya taze medya ile değiştirilmesi olduğunu unutmayın. Ayrıca çözülme sonrasında bu hücrelerin izdiham dikkat donmuş hücreleri sayısı bağlıdır, hücrelerin dondurulması sonra iyileşme oranı ve hücrelerin büyüme oranı. </li></ol> Pasajlanması hücreleri <ol start="5"><li> Hücreleri confluency aslında% 100 (yani: ertesi gün) büyüdü, medya aspirat steril PBS 5ml ile hücre yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve yaklaşık 5 dakika için inkübatör 10mM EDTA yeri ve plakası içeren 1 ml tripsin eklemek, hücreleri plaka ayırmak için izin verecek. </li><li> Hücreleri müstakil, tripsinize hücreleri kümeleri dağıtmak, medya 9ml içeren yeni bir plaka üzerine açılan bilge bu süspansiyon 1mL eklemek, ve bu yerde 37 ° C inkübatör gecede medya 9ml eklemek, pipet 2-3 kez . Alternatif medya FBS varlığı tripsin inaktive, hücreler tripsin sulandırmak için ilk yıkanmış olabilir. </li></ol> Kapak fişleri üzerine hücrelerinin sayımı ve kaplama <ol start="8"><li> Inkübatör gelen hücreleri çıkarmak, bu sefer yerine 9ml tripsinize hücreleri 5-6mL ortam eklemek dışında, yıkama ve daha önce olduğu gibi trypsinize. </li><li> Pipet hücreleri tek bir hücre süspansiyonu iyice içine tam ayrılma sağlamak ve ayrı bir mikrofuge'de boru tripan mavi 15μL ile birleştirmek için 15μL kaldırmak. </li><li> Bu hücre / tripan mavisi süspansiyon birkaç kez aşağı yukarı pipetleme Mix ve hemasitometre 15μL ekleyin. </li><li> Mikroskop altında, ölü hücreleri mavi görünecektir. Hemasitometre 4X4 ızgaraları birinde renksiz / clear (yaşam) hücrelerinin sayısını. Diğer üç 4X4 ızgaraları (gösterilir A, B, C ve D) Bu sayımı tekrarlayın ve süspansiyon mcL başına hücre sayısını hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="Denklem 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Denklem 1"></li><li> Protokol optimizasyonu sayesinde, deney sonuca görünüm için uygun hücre yoğunluğu 30.000 hücreleri sonuçları kaplama olduğunu tespit ettik. </li><li> 30.000 hücreleri için gerekli olan hücre süspansiyonu hacmini hesaplamak için, aşağıdaki denklemi kullanın: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="Denklem 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Denklem 2"></li><li> Şimdi altı sıra çanak her bir kuyunun içine steril bir cam kapak kayma yeri ve her iyi medya 2mL eklemek ve ardından hücre süspansiyonu hacmi 30.000 hücreleri için gerekli olan her bir kuyunun içine açılan bilge eklemek. Biz daha sonraki bir zaman noktasında floresan mikroskobu kullanarak hücrelerin görselleştirme olacak gibi, bu deney için kullanılan cam kapak fişleri olduğunu unutmayın; tüm uygulamalar mutlaka mikroskopi gerektirir ve böylece fişleri gerekli olmayabilir kapsayacak. </li></ol> Virüs İletimi <ol start="15"><li> Birkaç saat veya gece boyunca (hücrelerin kapak fişleri uymasını sağlamak için yeterli bir süre) sonra, medyayı çıkartın ve 1 ml serum serbest DMEM hücreleri yıkayın. </li><li> Ayrıca virüs için her bir kuyu için 1 ml serum ücretsiz medya ekleyin. Bu deneme için, adeno-Cre virüs vektör Biolabs ticari olarak elde edilmiştir. </li><li> Önceki protokol optimizasyonu 500 enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) birincil MEFS hücre canlılığı çok az veya hiç etkisi ile yüksek verimli gen transdüksiyonu sağladığını göstermiştir. İçişleri Bakanlığı aşağıdaki gibi hesaplanacaktır: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="Denklem 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Denklem 3"> <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="Denklem 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Denklem 4"></li><li> Enfekte olduğu her iyi virüs doğrudan hesaplanan hacim ekleme, plaka gecede 37 ° C inkübatör içine virüs ve yer hücrelerini dağıtmak için hafifçe sallayın. </li><li> Ertesi sabah, kaldırmak için virüs içeren hücreler medya ve 1ml steril PBS içinde hücre yıkayın ve sonra her bir kuyu için düzenli medya 2mL eklemek. </li><li> Bu deneyde örneklediği Rac1 hücrelerinin durumda, yaklaşık 72 saat sonrası transdüksiyon hücreleri morfolojik değişiklikler meydana geldi. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Hücreler görselleştirmek edildid aktin boya Phalloidin (sadece görüntüleme amaçları için) boyama ve Guelph Üniversitesi İleri Analiz Merkezi Leica TCS-SP5 multiphoton konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak görüntülü. Şekil 1, virüsü değil, aynı hücrelere göre adeno-Cre virüse maruz Rac1 Flox / Flox hücreleri sözleşmeli ve uzamış morfolojisi gösterir . <img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 (sağda) aynı kaynaktan enfekte olmamış hücrelerdeki göre adeno-Cre virüsü (solda) ile enfekte Rac1 Flox / Flox hücreleri arasındaki karşılaştırma.

<ol><li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li>
<li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. owney, Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li>
<li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li>
<li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li>
<li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li>
<li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li>
</ol>

Hayvan Bakım Kanada Konseyi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

İlişikteki video rekombinant virüs Cre recombinase kullanarak in vitro tüketim belirli bir gen nasıl kullanılabileceğini örnek teşkil etmektedir. Ancak bu protokolün geliştirilmesi ele değer bazı belirli noktaları ortaya yaptı. <ul><li> Adenovirüs ile çalışırken uygun güvenlik prosedürleri, her zaman kullanılmalıdır. Virüs ile çalışırken her zaman bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giyilmelidir. Medya ve plastik eşya, en az 30 dakika süreyle% 10 oranında çamaşır suyu ile tedavi edilmelidir ve plastik eşya bundan sonra otoklava olmalıdır. </li><li> Kaçının tekrarlanan donma-çözülme, bu virüs titresi etkileyebilir ve böylece transdüksiyon etkinliğini azaltmak gibi virüs stokunun. Küçük miktarda virüs stokunun başlangıçta ayrı tüpler içine aliquoted olmalıdır. </li><li> 50-500 gelen değişen Mois yöntemi geliştirme sırasında test edildi ve verimli transdüksiyon oranları hücre canlılığı üzerine olumsuz etkileri olmadan, çoğu durumda gözlendi. </li><li> Adeno-GFP transdüksiyon verimlilikleri hızla ekrana yöntem geliştirme sırasında kullanıldı. Bu kontrol (veya boş bir vektör), hücresel değişikliklere neden olmaz sadece bu viral enfeksiyon sağlamak için deney sırasında yapılmalıdır. Aynı şekilde, hücrelerde ilgi floxed gen eksize herhangi bir hücresel değişiklikler (yani morfoloji veya canlılığı değişiklikler) neden değilse, o zaman adeno-GFP ile aynı hücre tipi bulaşmasını virüs transdüksiyon göstermek için kullanmak önemli bir kontrol meydana gelen. </li></ul> Kültür kaskadlar sinyalizasyon inceleme ötesinde, adeno-Cre yaklaşımı da, deney hayvanları 3,4 genler koşullu kaldırın ve 6 içinde bir organizmanın hücreleri belirli toplumlarda etiket in vivo olarak istihdam edilmiştir . Konak hücre içine Cre recombinase başka genlerin de tanıtmak için adenovirüs sistemi adapte edilebilir. Bu teslim vektör kullanarak iki temel avantajı, yüksek iletimi ve gen teslim verimliliği ve konak DNA ile entegrasyon eksikliği. Ancak, yeni rekombinant adenovirüs nesil Emek yoğun olabilir. Burada açıklanan protokol bu nedenle daha önce geliştirilen adeno-Cre virüs istismar adenoviral sistemi gücünü sürdürür ve kaplin faiz, Rac1 floxed allel. Bu deney koşullu vuruş sayesinde, MEFS floxed Rac1 allel taşıyan adeno-Cre virüs kullanarak transdüksiyon gerçekten Rac1 eksikliği hücreleri 2,5 hücresel morfoloji karakteristik değişiklikleri önde gelen Rac1 eksizyonu neden olduğunu doğrulamıştır.

<table><tbody><tr><td>Ad-CMV-Cre virüsü</td><td>Vector Biolabs</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>DME Yüksek glukozlu besiyeri 500mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td></td></tr><tr><td>FBS Kanada menşeli 500mL</td><td>VWR international</td><td>CAA15-701</td><td></td></tr><tr><td>PEN-STREP 1X çözelti 100mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X falloidin</td><td>Invitrogen</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td></td></tr></tbody></table>

kültür İlköğretim fare embriyonik fibroblastlar sinyal molekülleri adenovirüs aracılı genetik kaldırma

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Genetik olarak çeşitli hücre sinyalizasyon kaskadlar belirli bileşenleri kaldırmak için modern sinyal iletimi analizi yeteneği ayrılmaz bir araç olmuştur. Cre-loxP sisteminin kullanımı yoluyla bu koşullu silme işlemini gerçekleştirmek için özel bir yöntem. Bu yöntem ile ilgi gen Cre recombinase protein için özel tanıma dizileri loxP siteleri, yan içerir. Sözde floxed (loxP sitesi ile çevrili) DNA Cre-aracılı bir rekombinasyon loxP siteleri olay ve müdahale gen 3 sonraki eksizyonu bu enzim sonuçlarına maruz kalması. Cre recombinase ilgi site yönetmek için birkaç farklı yöntem bulunmaktadır. Bu video, floxed Rac1 allel 1 içeren embriyolar elde edilen birincil fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) bulaştırmak için Cre recombinase gen içeren bir adenovirüs kullanımını göstermektedir. Deneyler için Rac1 MEFS seçimi için gerekçe bu aktin hücre iskeletinin 2,5 değişiklikler nedeniyle Rac1 silinmesi, üzerine belirgin morfolojik değişiklikler görülebilmektedir. Viral iletimi ve Cre ifade takiben 72 saat, hücreleri aktin boya Phalloidin kullanılarak boyandı ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak görüntülü edildi. Adeno-Cre virüsüne maruz kalmış MEFS, enfekte olmamış hücrelere oranla daha önceki raporlarda 2,5 tutarlı sözleşmeli ve morfolojisinde uzatılmış ortaya çıktığını gözlendi. Cre recombinase teslim adenovirüs yöntem adeno-Cre virüs kolaylıkla ulaşılabilir olduğu gibi avantajlı ve hücrelerin yaklaşık% 100 Cre yoluyla gen delesyonu optimize edilmiş adenoviral enfeksiyonu ile elde edilebilir.

Bu video floxed Rac1 allel taşıyan birincil fare embriyonik fibroblastlar bulaştırmak için Cre recombinase gen taşıyan bir adenovirüs kullanın.

Kültür İlköğretim Fare Embriyonik Fibroblastlar Sinyal Molekülleri Adenovirüs aracılı Genetik Kaldırma

Çeşitli hücre sinyal iletim kaskadlarının belirli bileşenlerini genetik olarak uzaklaştırabilme yeteneği, modern sinyal iletim araştırmalarında temel bir araç olmuştur...

Modern genetik analizler, belirli genlerin hücrelerden, organlardan veya tüm organizmalardan hedeflenmiş olarak uzaklaştırılmasını sağlayan tekniklere büyük ölçüde dayanmaktadır. Bu nakavt deneyleri, genin hücresel bağlamdaki işlevinin ortaya çıkarılmasına yardımcı olur. Nakavt sonucunda ortaya çıkan moleküler, morfolojik ve fizyolojik fenotiplerin tümü, silinen dizilim tarafından kodlanan gen ürünlerinin rolü hakkında ipuçları sağlar.Fareler gibi model organizmalarda, koşullu bir gen delesyonu gerçekleştirmenin yaygın bir yöntemi, hedef genin veya ekzonun, Cre Rekombinaz enzimi için tanıma dizileri olarak hizmet eden loxP bölgeleriyle çevrelenmesidir. Ardından, "floxe" edilmiş alel olarak adlandırılan yapının geri dönüşümsüz eksizyonu Cre tarafından katalize edilir ve böylece söz konusu dizi genomdan uzaklaştırılır; sisteme Cre Rekombinaz dahil etmek için in vivo olarak gerçekleştirilenler ve doğrudan yerleşik hücrelerle çalışılanlar da dahil olmak üzere birkaç farklı yöntem mevcuttur.Bu özel uygulama için, flox aleli taşıyan transgenik bir fareden izole edilmiş ve kültüre edilmiş fibroblast hücrelerine Cre iletmek amacıyla bir adenovirüs kullanacağız. Bu yöntem, transgen iletiminde yaklaşık %100 verimlilik sağlar. Virüs hücrelere uygulandığında, bir endositik vezikül içine alınır ve ilgilenilen transgeni de içeren DNA'sının por kompleksi üzerinden çekirdeğe nüfuz edebileceği nükleer zarf bölgesine taşınır.Hücresel mekanizma daha sonra enjekte edilen geni transkribe edebilir ve protein ürünlerinin hücre üzerinde etki göstermesine olanak tanır. Bu durumda, viral olarak kodlanan Cree Rekombinaz enzimi, konak hücre genomundan flocked alelini kesip çıkarır. Kanada'nın Ontario eyaletindeki Guelph şehrinde bulunan Guelph Üniversitesi'ndeki Jones Laboratuvarı'ndanız.Laboratuvarımızda, sinyal iletimi kavramı ve çeşitli sinyal iletim kaskadlarının belirli bileşenleri kaldırıldığında neler olduğuyla ilgileniyoruz. Bugün, aktin organizasyonu ile ilgili bir kaskadı inceleyeceğiz. Sinyal iletimi, bilgiyi ileten ve aktin yeniden organizasyonu gibi fenotipik değişiklikleri tetikleyen bir dizi biyokimyasal bileşen aracılığıyla gerçekleştirilir.İlgilendiğimiz protein, hücre yapışması, migrasyonu ve morfolojisi dahil olmak üzere aktin dinamiklerinin düzenlenmesinde önemli rol oynayan küçük bir GTPaz olan RAC1'dir. Bu araştırmada, bu geni uzaklaştırmak ve hücredeki rolünü doğrulamak için CRE LAX P sistemini kullanacağız. Daha önce, döllenmeden 12 gün sonra, bir RAC1 aleli floxlanmış embriyonik farelerden fibroblast hücreleri izole edilmiştir.Bu hücreler daha sonra uzun süreli saklama için sıvı azota yerleştirilmiştir ve biz, tek bir embriyoyu temsil eden bu hücrelerden tek bir viyali çözerek başlayacağız. Hücre kültürü deneyleri gerçekleştirilirken, steril bir ortamın korunması önemlidir. Bu işlem, onaylı bir laminar akışlı kabinin açık yüzeylerinin silinmesinin yanı sıra, kabine giren tüm reaktif şişelerinin ve laboratuvar ekipmanlarının %70 ethanol ile püskürtülerek temizlenmesini içerir.Laminer akış kabini hazırlandıktan sonra, vial içeriği sıvı hale gelene kadar viali 37 °C sıcaklıktaki su dolu bir beherin içine daldırarak hücreleri çözdürün. Ardından, viali %70 etanol ile sterilize edin ve hücre süspansiyonunu ekleyin. Süspansiyonu, %10 fetal bovine serum ve %1 penisilin ile takviye edilmiş 9 mL yüksek glukozlu DMEM besiyeri içeren 10 cm'lik bir plağa damla damla ekleyin.Streptomisin ekledikten sonra, hücrelerin dağılması için plakayı hafifçe sallayın ve plakayı uygun bilgilerle etiketlemeyi unutmadan %5CO2 içeren 37 derece inkübatöre yerleştirin. Hücreler genellikle 24 saat içinde %100 konfluense ulaşır. Bu noktada, hücreleri yeni bir plakaya pasajlayabiliriz.Bunu yapmak için, öncelikle eski besiyerini aspire ederek uzaklaştırın. Hücreleri durulamak için beş ml steril PBS ekleyin ve ardından bunu da uzaklaştırın. Şimdi, 10 milimolar EDTA içeren bir ml tripsin ekleyin.Hücrelerin substrattan ayrılmasını sağlamak için plakayı yaklaşık beş dakika boyunca 37 °C'lik inkübatöre yerleştirin. Akışlı kabine geri dönün ve tripsinizasyon yapılmış plakaya dokuz ml besiyeri ekleyerek hücreleri 1/10 oranında seyreltin; hücre kümelerini dağıtmak için sıvıyı pipetle birkaç kez aşağı yukarı çekin ve ardından süspansiyondan bir ml alarak yeni bir 10 cm'lik plakadaki dokuz ml taze besiyerine damla damla ekleyin. Hücreleri dağıtmak için plakayı tekrar nazikçe sallayın ve 37 °C'lik inkübatöre yerleştirin.Hücreler konfluense ulaştığında, bir sonraki adım, mikroskopi ile görüntülenebilmeleri için onları cam lamel üzerine ekmektir. Hücreleri, paketleme için kullanılan tekniğin aynısını kullanarak, hücrelere tripsin ekleme ve 37 °C'lik inkübatöre yerleştirme aşamaları dahil olmak üzere hazırlayın. Hücreler plakadan ayrılırken, her kuyuya bir adet otoklavlanmış lamel gelecek şekilde cam lameller içeren altı kuyucuklu bir plak hazırlayın.Hücreler plakadan ayrıldıktan sonra, tripsinizasyon yapılmış hücrelere beş ila altı ml besiyeri ekleyin. Deneyin bir sonraki aşamasında, etkili bir virüs enfeksiyonu için uygun sayıda hücrenin yerleştirilebilmesi amacıyla hücre sayımı yapılacaktır. Hücreleri saymak için, 15 µL numuneyi eşit miktarda tripan mavisi ile birleştirin, karıştırmak için pipetle yukarı aşağı çekin ve bu çözeltiden 15 µL'sini hemositometreye ekleyin.Ölü hücreler mavi görünecektir. Bu hazırlık altında, mikrolitre başına hücre sayısını hesaplamak için dörtte dörtlük ızgara üzerindeki yalnızca canlı veya renksiz hücreleri sayın. A'dan D'ye kadar dört ayrı ızgaradaki hücreleri sayarak ve ortalamasını alarak başlayın. Daha sonra, trypan blue ile yapılan seyreltmeyi hesaba katmak için bu değeri ikiyle çarpın.Izgara bir mikrolitrenin 10'da 1'ini tuttuğu için, değeri mikrolitre başına hücre sayısı olarak ifade etmek için 10 ile çarpın. Ardından, istenen hücre sayısını daha önce hesaplanan hücre konsantrasyonuna bölerek gerekli hacmi belirleyin. Hesaplanan hücre süspansiyonu hacmini altı kuyucuklu plağın her bir kuyucuğuna damla damla ekleyin.Bu hücreleri gece boyunca 37 °C'lik inkübatörde bırakın. Ertesi gün hücrelere virüs eklenecektir. Vector B labs'dan temin edilen den creek virüsü alikotlara ayrılmış ve -80 °C'de saklanmıştır.Bu virüsü alın ve laminer akışlı kabine geri götürün. Altı kuyuklu plakayı inkübatörden çıkarın ve kabine getirin. Besiyerini aspire edin ve hücreleri 1 mL serumsuz DMEM ile yıkayın.Şimdi, virüs eklemesi için her kuyucuğa 1 mL serumsuz besiyeri ekleyin. Viral uygulama için 500'lük bir enfeksiyon çokluğu (multiplicity of infection veya MOI) kullanıyoruz. Protokol optimizasyonu daha önce çeşitli MOI değerleri kullanılarak gerçekleştirilmiş ve 500 MOI'nin, hücre canlılığı üzerinde az veya hiç etki yaratmadan oldukça yüksek enfeksiyon oranları sağladığı tespit edilmiştir.MOI'yi hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın. İlk olarak, hedef MOI'yi (bu durumda 500) kuyuk başına düşen hücre sayısı (veya 30.000) ile çarparak gereken virüs sayısını hesaplayın; kullanılacak virüs stok hacmini belirlemek için virüs sayısını 1000 ile çarpın ve bunu virüsün başlangıç konsantrasyonuna bölün. Bu örnekte, enfekte edilecek her bir kuyucuğa 1.5 µL virüs stoğu ekleyeceğiz.Virüsü dağıtmak için plakayı nazikçe sallayın ve plakayı gece boyunca 37 derece inkübatöre yerleştirin. Ertesi sabah, virüs medyasını hücrelerden uzaklaştırın, PBS ile yıkayın ve hücrelere 2 mL standart medya ekleyin. Bu deneyde, hücrelerde fenotipik değişikliklerin yaklaşık 72 saat içinde meydana geldiğini gözlemledik.Actin din kullanılarak boyanan hücreler, Guelph Üniversitesi'ndeki İleri Analiz Merkezi'nde bulunan Leica T-C-S-S-P five çok fotonlu konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntülendi. Bu işlem, enfekte olan ve olmayan hücreler arasında morfolojik değişiklikler olduğunu ortaya çıkardı. RAC one eksik olan hücreler, enfekte olmamış geniş ve yassı hücrelere kıyasla uzamış ve ince görünmektedir.Burada, ADOC crease sisteminin, sinyal iletimi çalışmalarının ötesinde, hücrelere etkili gen aktarımı için güçlü bir yöntem olduğunu gösterdik. Bununla birlikte, bu yöntemi deney hayvanlarında genleri nakavt etmek veya belki bir organizmadaki belirli hücre popülasyonlarını işaretlemek için de kullanabilirsiniz. Adenovirüs sistemi, prensipte Cree dışındaki genleri aktarmak için de kullanılabilir.Bu iletim yöntemini kullanmanın avantajları arasında yüksek etkinlik, verimlilik ve konak hücre DNA'sı ile entegrasyonun olmaması yer almaktadır. Bununla birlikte, yaygın adenovirüslerin üretimi zahmetli olabilir. Bu nedenle, burada açıklanan protokol, daha önce geliştirilen ocre virüsünü ve RAC one mes ile oluşturulan sürümüzü kullanarak adenoviral sistemin gücünden yararlanmaktadır; bu koşullu nakavt aracılığıyla şunları göstermiş bulunmaktayız.Böylece morfoloji, RAC gibi küçük GTPazlara kısmen bağımlıdır. Sonuç olarak, Jones Lab adına videomuzu izlediğiniz için teşekkür eder, tüm gelecek araştırmalarınızda başarılar dileriz.

adenovirus-mediated-genetic-removal-signaling-molecules-cultured

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz lentiviral bir tek koku alma duyu nöron akson genetik manipülasyon ve görselleştirme tekniği ve terminal arborization...

Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo</em

Biz bir model herpes, gamma herpes 68 (γHV68) litik çoğaltma konak sinyal molekülleri arasında önemli rolleri tanımlamak için bir protokol açıklar. Genetiği değiştirilmiş fare suşları ve γHV68 litik replikasyon için embriyonik fibroblastlar kullanarak, protokol fenotipik karakterizasyonu ve viral litik çoğaltma virüs konak etkileşimler moleküler sorgulama hem de izin verir.

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

Hipotalamusun fonksiyonel ve tıbbi önemine...

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

İnsan Kaposi sarkomu ile ilişkili Herpes (KSHV) ve Epstein-Barr virüsü (EBV) ile yakından ilgili olan bir model herpesvirüs, kemirgen gamma herpes virüsü 68 (γ HV68) ile enfekte olan fareler içindeki antiviral sitokin üretimini ölçmek için bir protokolü tarif eder. Genetik olarak modifiye edilmiş olan fare soyları ve fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) kullanarak, biz antiviral sitokin üretimini in vivo ve ex vivo hem de değerlendirildi. Lentiviral transdüksiyonu ile nakavt embriyonik...

Sitokin Üretimi Viral Evasion Doğuştan Bağışıklık Sinyalizasyonu Diseksiyon

Burada birincil embriyonik fibroblastlar içine fonksiyonel cardiomyocytes overexpression GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 ve miR-133, TGF-β sinyal inhibisyon yanında (GHMT2m) aracılığıyla yeniden programlamak için sağlam bir yöntem mevcut. Bizim iletişim kuralı dayak cardiomyocytes 7 gün sonrası iletim % 60 ile olduğu kadar erken oluşturur verimlilik.

Pro-fibrotik sinyal bastırma faktörü-aracılı fare embriyonik fibroblastlar indüklenen Cardiomyocytes yeniden programlama Potentiates

Burada, TGF-β/Smad3 sinyal faaliyet bir adenovirus muhabir sistemi kullanarak canlı hücre görüntüleme için bir iletişim kuralı mevcut. Bu sistem gerçek zamanlı olarak transkripsiyon etkinlikleri izler ve her iki tek hücreleri vitro ve canlı hayvan uygulanabilirmodelleri.

Hücre görüntüleme TGF-β/Smad3 sinyal yolu Vitro ve Adenovirus muhabir sistemiyle Vivo içinde yaşamak

Burada içinde protein var koşullu olarak ters bir baskın negatif mutant yorum overexpressing tarafından inaktive bir baskın negatif indüklenebilir sistemi geliştirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

İndüklenebilir ve tersinir baskın-negatif (DN) Protein inhibisyon

Burada, genetiği değiştirilmiş fare modeli kaynaklı tümörlerde in vivo embriyonik öldürücü olan gen nakavtlarını gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz ve daha sonra nakavtın tümör büyümesi, proliferasyon, sağkalım, göç, invazyon ve transkriptom in vitro ve in vivo üzerindeki etkisini değerlendiriyoruz.

Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümör Hücrelerinde Floks Alellerinin Ex vivo Ablasyonu ile Tümörigenezde Gen Fonksiyonlarının Tanımlanması

Bu protokol, ilgilenilen genlerde delesyon barındıran fare ürotelyal organoidlerinin üretilmesi ve karakterizasyonu sürecini açıklar. Yöntemler arasında fare ürotelyal hücrelerinin toplanması, bir CMV promotörü ile Cre ekspresyonunu yönlendiren adenovirüs ile ex vivo transdüksiyon ve in vitro ve in vivo karakterizasyon bulunmaktadır.

Eski Vivo Fare Ürotelyal Hücrelerinde Adenovirüs-Cre Aracılı Gen Delesyonlarının Organoid Modeli

Bu protokol, AAV8 ile verilen küçük firkete RNA'sının intrasplenik enjeksiyonunun, karaciğerde portal ven enjeksiyonu ile aynı gen yıkım etkinliğini nasıl sağladığını açıklar ve çok daha düşük perioperatif ve postoperatif mortalite ve komplikasyonlar ile daha basit bir prosedürü temsil eder.

Adeno-ilişkili virüs serotip 8 (AAV8) ile verilen küçük firkete RNA'sının intrasplenik enjeksiyonu yoluyla karaciğerde etkili gen yıkımı

Öğrenin, adenovirüs aracılı Cre rekombinaz ile fare embriyonik fibroblastlarda koşullu gen silme yöntemini. Rac1'in aktin dinamiğindeki rolünü incelemek için kullanılan bu teknik, gen fonksiyonu çalışmalarında yüksek verimlilik sağlar.

Kültür İlköğretim Fare Embriyonik Fibroblastlar Sinyal Molekülleri Adenovirüs aracılı Genetik Kaldırma

Daha fazla video keşfet