Name: Rotator-tipi Şişe Kültür Sistemi kullanılarak Kemirgen Tüm Embriyo Kültürü Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Öğrenin, rotator-tipi şişe kültür sistemi kullanarak kemirgen tüm embriyo kültürü yöntemini. Bu teknik, E12.5 sonrası rat embriyolarının gelişim biyolojisi araştırmalarında kontrollü koşullarda incelenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Sayın Hajime Ichijo yararlı tavsiyelerde video kayıt ve video düzenleme için teşekkür ederim. Ayrıca video kayıt için türlü yardımcısı Drs.Yuji Tsunekawa ve Kaichi Yoshizaki teşekkür ederim. Bu çalışma Genç Bilimci B ve Japonya MEXT öncelik Alanları Moleküler Beyin Bilimi KAKENHI tarafından desteklenmektedir. Biz destek kabul Küresel COE Japon Bilim ve Teknoloji Kurumu (JST) Japon Bilim ve Teknoloji Kurumu Evrimsel Bilim ve Teknoloji Japonya MEXT Programı &quot;Küresel Beyin Bilim Temel ve Translasyonel Araştırma Merkezi&quot; ve Çekirdek Araştırma (CREST) .

1. WEC sistemi kurmak <ol><li> Ortak WEC sistemi içinde giriş silikon tüp filtre 0.22 mikron membran). </li><li> O 2 (% 95) ve CO 2 (% 5) içeren bir gaz silindir valfini açın. Otoklava su içeren köpürme şişe ile davul içine gaz karışımı akış. </li><li> Gaz karışımı akışını hacmi 50 cc ayarlayın. </li><li> Dışında bir su şişesi içine silikon tüp izin ve gaz karışımı akışını kontrol yerleştirin. </li><li> 20 dev / dak hızında davul döndürün. </li></ol> 2. Kültür ortamı hazırlanması <ol><li> 37.0 çözülme sıçan hemen santrifüje (IC) serum ° C b). Otoklavlanmış 100 ml beher çözülmüş serum içine ekleyin D-glukoz (2 mg / ml). Kültür orta birincil kültür seviyesi (örneğin, bir başlık kullanarak) hazırlanmalıdır. </li><li> 400 seyreltme: 1 ile serum antibiyotik antimikotik (100X) sıvı ekleyin. </li><li> Kalan izofluran buharlaşacak (sıçanlarda kan toplama sırasında anestezi nedeniyle), oda sıcaklığında (RT) c) 20 dakika serum . </li><li> 0.45 mikron membran filtre kullanılarak kültür ortamı sterilize edin. </li><li> Her kültürün şişe, orta 3,0 ml dökün ve alüminyum folyo kaplı bir silikon fişi ile her şişe üst, mühür (ref 14) d). </li><li> Tyrode en tuzlu e içeren üç ya da dört bertaraf Petri kapları hazırlayın). </li></ol> 3. Anestezi, rahim sıçan ve izolasyon <ol><li> Parenteral veya inhalasyon anesteziklerin derinden zamanlanmış bir gebe sıçan anestezisi. </li><li> % 70 etanol ile anestezi gebe sıçan karın bölgesini temizleyin. </li><li> Forseps ile cilde Pick up ve) büyük makasla f cilt keserek karın duvarı exteriorize. </li><li> Forseps bir çift ile karın duvarı Pick up) torasik düzeyde g büyük makas ile karın duvarı U-şekilli büyük uzunlamasına insizyonlar makyaj. </li><li> Forseps bir çift ile sol tarafına uzak Bear bağırsak ve rahim, yumurtalık bağlı bir ucunu göstermek. </li><li> Forseps bir çift rahim sonuna Pick up ve büyük makas ile rahim ve yumurtalık arasındaki konumunu kesmek. </li><li> Gebe sıçan rahim, rahim diğer sonuna kadar rahim çevresindeki yağ keserek çıkartın. </li><li> Tyrode Kullanıcı tuzlu su içeren Petri rahim aktarın. </li><li> Rahim çıkardıktan sonra anesteziklerin aşırı idaresi veya servikal dislokasyon sıçan Euthanize. </li></ol> 4. Embriyolar rahim çıkarılması <ol><li> Kısaca yıkayın ve Tyrode Kullanıcı salin rahim), ince forseps h bir çift ile ikinci Petri kabı transfer . </li><li> Binoküler mikroskop altında, ince forseps bir çift rahim duvarına pick up ve oftalmik düz makas kullanarak kan damarları ile bağlantı mesometrium karşı tarafında rahim duvarına kesmek. </li><li> Rahim duvarı ve desidua arasında uzaya oftalmik düz makas ucu takın. Rahim duvarına boydan boya antimesometrial kenarı boyunca kesin. </li><li> Mesometrial tarafında desidua ve ince forseps i) iki çift rahim ayrı conceptuses tutam. </li><li> Uygun bir çapa sahip bir steril cam pipet ile üçüncü Petri kabı conceptuses aktarın. </li></ol> 5. Rat embriyoları diseksiyonu <ol><li> Desidua microforceps bir ucu takın ve iki çift forseps ile konseptus etrafında desidua enine bir kesi yapmak. </li><li> Plasenta tarafında desidua forseps ipuçları takın ve üst için desidua iki uzunlamasına insizyonlar yapmak. </li><li> Bu iki çift forseps ile ripping tarafından plasenta tarafında desidua çıkarın. Iki çift forseps ile kalan desidua çıkarın. </li><li> Reichert membranı Alış üzerinde yatay bir kesi yapmak ve anti-plasenta tarafında konseptus membran ayrı. </li><li> Forseps iki çifti ile yolk kesesi embriyo kafa yakın küçük bir delik açın ve oftalmik kavisli makas bir çift ile yolk sac kesme. Büyük kan damarlarının zarar vermemek için çok önemlidir. </li><li> Embriyo başının etrafında yerinde iki çift ince forseps amniyon Pick up ve hafifçe), amniyon h yırtılma yolk kesesi embriyo çekin . Embriyonun vücut midgestation aşamada embriyo için oksijen kaynağı artırmak için yumurta sarısı kesesi dışarı çekilmelidir. </li></ol> 6. Tüm embriyo kültürü <ol><li> Plasenta, yolk kesesi, kalp dayak ve kan dolaşımı durumu zararlar kontrol edin. </li><li> Göbek kordonu uzanan farkında olmak, transfer, steril bir cam pipet ile bir kültür şişe embriyo. Tyrode Kullanıcı tuzlu su kültürü şişeleri üzerinde taşır, mümkün olduğunca az olmalıdır. </li><li> Rotator davul delik olmayan bir silikon fişini çıkartın. WEC sistemi rotator davul dik bir deliği olan bir eklenti ile kültür şişe bağlayın. Rotator davul çok ince bir ekipman olduğundan olumsuz yönde davul tarihinde yürürlüğe koymak için dikkatli olun. Disseke embriyo içeren şişeler tek kültür tek aktarılır; kuluçka ön kapının açılması) kuluçka sıcaklığı önlemek için j azalma minimize edilmelidir. </li><li> Kültür 10 saat sonra, 24 saat sonra (Tablo 1) gaz karışımı akış hacmi 75 cc ve 100 cc kadar varan artış. </li><li> Kültür ortamı, yeni bir kültür ortamı ile taze hazırlanmış şişeye kültürlü embriyo transfer ederek 24 saat etrafında değiştirilmesi gerekir. 34 saat sonra 125 cc akış hacmini artırmak ve 48 saat sonra 150 cc (Tablo 1) </li><li> Bazen, kalp atışı hızı (yani, 120-150/min optimum) sayarak ve kan dolaşımını gözlemleyerek kültürlü embriyoların durumunu kontrol edin. Gerekirse Tyrode Kullanıcı salin embriyoların büyüme yargılamak için Somitlerin sayısını. Normal bir gelişme olarak, bir iki saat hücre gruplarının eklenir. </li><li> WEC bittiğinde, gaz karışımı kaynağı durdurmak ve giriş borusu ve köpürme şişe giriş tüpe geri akışı önlemek için filtre membran kesmek. </li></ol> 7. Notlar <ol class="lalpha"><li> WEC sistem içinde sıcaklığı sürekli 37,0-37,5 ° C tutulur </li><li> Sıçan ve fare embriyoları WEC% 100 sıçan IC serum rutin olarak kullanılan ve kullanımdan önce -20 ° C'de muhafaza edilir. </li><li> Biz sıçan IC serum, izofluran anestezisi sıçan toplanan satın alın. </li><li> Tek kullanımlık şişe Ikemoto Rika da mevcuttur. Şişeler ve silikon fişler otoklava olmalıdır. </li><li> Diseksiyon sırasında embriyoların düşük ya da yüksek ısıda muhafaza WEC sonraki gelişimini etkileyebilir, çünkü embriyo Diseksiyon RT yapılmalıdır. </li><li> Diseksiyon için Araçlar kuru ısı ile sterilize edilir. </li><li> Deri ve karın duvarı, mümkün olduğunca bir çanak içine kılların bulaşmayı önlemek için ayrı ayrı kesilmesi gerekir. Biz deri kestiğiniz zaman onlara yeni bir çift ile bir çift büyük makas ve forseps değiştirmek ve sırasıyla rahim izole. </li><li> Ipuçları ince forseps kullanılması kesinlikle dokuları incelemek için çok önemlidir. Biz bir taş ve makine yağı ile elle forseps ipuçları keskinleştirmek. </li><li> Biz embriyoların aşırı basıncı önlemek için forseps bir tarafında bir bıçak gibi kullanın. </li><li> WEC sistemi içindeki sıcaklık, tekrar tekrar kapıyı açarak düştüğünde, ışığı açmak için sistem içinde sıcaklıkta tutmaya devam ediyor. </li></ol> 8. Temsilcisi sonuçları Şekil 1, rat embriyo ve kültürlü sıçan embriyolar diseksiyon prosedürleri gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2170/2170fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 E12.5 rat embriyo Tüm embriyo kültürü. (A) konseptus gebe sıçan rahim disseke. (B) plasenta tarafında desidua kaldırılması. Reichert membranı (C) Kaldırma. (D) yolk kesesi açılması. (E) WEC başından sonra 6 saat süreyle şişe rat embriyo kültür. (F) sıçan 42 saat için embriyo kültür. d desidua; R Reichert Kullanıcı membran, p, plasenta, ys, yolk kesesi, e, embriyo. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 0 saat </td><td> 12 saat </td><td> 24 saat </td><td> 36 saat </td><td> 48 saat </td></tr><tr><td> E12.5 rat embriyo </td><td> % 95, 50 cc </td><td> 95% 75 cc (10 saat) </td><td> % 95 100 cc </td><td> % 95 125 cc (34 saat) </td><td> % 95 150 cc </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Optimal oksijen durumu.

<ol><li>New, D. A. T. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNew%2C+DAT+%22In+Mammalian+Postimplantation+Embryos+A+Practical+Approach%22">In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach</a>. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 1-14 (1990).</li>
<li>Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22In+Mammalian+Postimplantation+Embryos+A+Practical+Approach%22%5BJournal%5D)">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 15-40 (1990).</li>
<li>Morris-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postimplantation+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Essential+Developmental+Biology+A+Practical+Approach%22%5BJournal%5D)">Postimplantation mammalian embryos.</a> Essential Developmental Biology A Practical Approach. , IRL Press. Oxford. 55-66 (1993).</li>
<li>Fujinaga, M. In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFujinaga%2C+M+%22Developmental+Biology+Protocols%22">Developmental Biology Protocols</a>. Tuan, R. S., Lo, C. W. , Humana Press. Totowa. 53-76 (2000).</li>
<li>Eto, K., Takakubo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+development+of+rat+embryos+in+culture+during+the+period+of+craniofacial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Craniofac.+Genet.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis.</a> J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).</li>
<li>New, D. A., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rotating+bottle+culture+method+with+continuous+replacement+of+the+gas+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase.</a> Experientia. 35, 138-140 (1979).</li>
<li>Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+craniofacial+embryology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammalian craniofacial embryology in vitro.</a> Int. J. Dev. Biol. 41, 187-194 (1997).</li>
<li>Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+of+the+mouse+prosencephalic+neural+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate.</a> Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).</li>
<li>Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6-dependent+boundary+defines+alignment+of+migrating+olfactory+cortex+neurons+via+the+repulsive+activity+of+ephrin+A5%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5.</a> Development. 133, 1335-1345 (2006).</li>
<li>Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+labeling+of+mouse+rhombomeres+by+Cadherin-6%3A%3AEGFP-BAC+transgenesis+underscores+the+role+of+cadherins+in+hindbrain+compartmentalization%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization.</a> Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).</li>
<li>Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibition+of+cyclin-dependent+kinases+that+lengthens%2C+but+does+not+arrest%2C+neuroepithelial+cell+cycle+induces+premature+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis.</a> J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).</li>
<li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li>
<li>Arai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Fabp7%2C+a+downstream+gene+of+Pax6%2C+in+the+maintenance+of+neuroepithelial+cells+during+early+embryonic+development+of+the+rat+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex.</a> J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).</li>
<li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).</li>
</ol>

Kemirgen WEC başarısı için iki önemli adım vardır. İlk olarak, diseksiyon prosedür değil zarar embriyolar, özellikle kan damarları doğru olmalıdır. İkincisi, oksijen ve besin artık rahim izolasyon sonra plasenta yoluyla sağlanan çünkü prosedürü mümkün olduğunca çabuk olmalıdır. Bu büyük embriyoları için kritik öneme sahiptir. E12.5 sonra sıçan WEC durumda, biz 30 dakika içinde disseke embriyoların kültürü şişeleri içine aktarmanız gerekir. Biz, hücrelerin az sayıda floresan boya DII etiketle...

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Tip </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorum </td></tr><tr><td colspan="5"> WEC ayarlama </td></tr><tr><td> WEC sistemi (10-0310) </td><td> Araç </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-0310 </td><td> Başka bir küçük modeli de mevcuttur. </td></tr><tr><td> Deliksiz Silikon fişi </td><td> Araç </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-08 </td><td></td></tr><tr><td> Gaz karışımı silindir </td><td> Araç </td><td> Nikko Sanso </td><td> - </td><td> % 95 oksijen ve% 5 karbon dioksit içeren. Özel sipariş edin. </td></tr><tr><td> Gaz regülatör </td><td> Araç </td><td> Ono Seisakusho </td><td> WR-11 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 mikron filtre Millex GS </td><td> Araç </td><td> Millipore </td><td> SLGS033SS </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Anestezi ve rahim izolasyonu </td></tr><tr><td> Büyük makas </td><td> Araç </td><td> Napox </td><td> B-7H </td><td></td></tr><tr><td> Forseps </td><td> Araç </td><td> Napox </td><td> A-3-2 </td><td></td></tr><tr><td> Bertaraf Petri kabı (90 mm x 15 mm) </td><td> Araç </td><td> Iwaki </td><td> SH90-15 </td><td> Derin tipi bulaşık diseksiyon için iyi. </td></tr><tr><td> İsofluranın </td><td> Reaktif </td><td> Abbott </td><td> B506 </td><td> Anestezi için </td></tr><tr><td> Pentobarbital sodyum </td><td> Reaktif </td><td> Schering-Plough Hayvan Sağlığı </td><td> - </td><td> Anestezi için </td></tr><tr><td> Tyrode en tuzlu </td><td> Reaktif </td><td> - </td><td> - </td><td> Ref protokole göre. 2. 4 Kaydet ° C </td></tr><tr><td> Zamanlı gebe Sprague-Dawley sıçan </td><td> Hayvan </td><td> Charles Rivers Laboratuvarlar Japonya </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Kültür ortamı hazırlanması </td></tr><tr><td> Kültür cam şişe </td><td> Araç </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-05 </td><td></td></tr><tr><td> Bertaraf kültür şişesi </td><td> Araç </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-06 </td><td></td></tr><tr><td> Silikon fiş ile delik </td><td> Araç </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Alüminyum folyo </td><td> Araç </td><td> Herhangi bir şirket </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> Otoklav torbası </td><td> Araç </td><td> Hogy </td><td> HM-26 </td><td> Kültürü şişeleri için </td></tr><tr><td> Otoklav torbası </td><td> Araç </td><td> Hogy </td><td> HM-14A </td><td> Silikon fişler </td></tr><tr><td> 0.45 mikron filtre Millex HA </td><td> Araç </td><td> Millipore </td><td> SLHA033SS </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml konik tüp </td><td> Araç </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> 100 ml beher </td><td> Araç </td><td> Iwaki </td><td> TE-32 </td><td></td></tr><tr><td> Rat IC Serum </td><td> Reaktif </td><td> Charles Rivers Laboratuvarlar Japonya </td><td> - </td><td> Bakın: Sayın Kunihiko Morisaki TEL: +81- (0) 45-474-9336 Faks: +81- (0) 45-474-9340 </td></tr><tr><td> D-Glukoz (+) </td><td> Reaktif </td><td> Wako </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiyotik-antimyotic sıvı </td><td> Reaktif </td><td> Gibco </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Embriyoların diseksiyonu </td></tr><tr><td> Oftalmik düz makas </td><td> Araç </td><td> Napox </td><td> MB50-7 </td><td> Rahim duvarına kesim için </td></tr><tr><td> Oftalmik kavisli makas </td><td> Araç </td><td> Napox </td><td> MB54-2 </td><td> Yolk sac kesim için </td></tr><tr><td> Forseps # 5 </td&gt; <td> Araç </td><td> Dinçlik </td><td> T6715 </td><td></td></tr><tr><td> Forseps # 5F </td><td> Araç </td><td> Regine </td><td> T6819 </td><td></td></tr><tr><td> Cam pipet </td><td> Araç </td><td> - </td><td> - </td><td> Pasteur pipeti kullanarak el ile yapılmıştır. </td></tr><tr><td> Otoklav torbası </td><td> Araç </td><td> Hogy </td><td> HM-4 </td><td> Cam pipetler </td></tr><tr><td> Binoküler mikroskop </td><td> Araç </td><td> Leica </td><td> Mz7s </td><td></td></tr><tr><td> Işık </td><td> Araç </td><td> Leica </td><td> CLS 150XD </td><td></td></tr><tr><td> Petrol taş </td><td> Araç </td><td> Uchida Yoko </td><td> 833-2000 </td><td> Forseps keskinleşmesi için </td></tr><tr><td> Makine yağı </td><td> Araç </td><td> Uchida Yoko </td><td> 835-0000 </td><td> Forseps keskinleşmesi için </td></tr></tbody></table>

rotator-tipi Şişe kültür sistemi kullanılarak kemirgen tüm embriyo kültürü yöntemi

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Tüm embriyo kültürü (WEC) tekniği, Yeni ve arkadaşları tarafından 1950&#39;li yıllarda geliştirilmiş ve gelişim biyolojisi 1 için uygulanan olmuştur . Memeli embriyolarının gelişim ve büyüme plasentanın fonksiyonu üzerine eleştirel bağımlı olmasına rağmen, WEC teknik embriyonik gün (E) 6.5-E12.5 sırasında midgestation aşamalarına karşılık gelen sınırlı dönemlerde kültür fare ve sıçan embriyolar ex vivo durumu sağlar fare veya sıçan 2, 3, 4 E8.5-E14.5. Embriyoların mikroskop altında manipüle edilebilir, çünkü WEC, ince cam kapilerleri kullanarak embriyo alanlarda doğrudan istenen hedef yapabilirsiniz. Bu nedenle, biz postimplanted memeli embriyolarının dinamik gelişim süreçlerini incelemek için istediğiniz zaman kemirgen WEC çok yararlı bir tekniktir. Bugüne kadar, çeşitli WEC sistemleri 1 geliştirilmiştir. Bunların arasında, sırasıyla 1, fare ve sıçan E9.5 ve E11.5, sonra rotator tip şişe kültür sistemi, en popüler ve en uzun vadeli midgestation, yani embriyoların kültürü için uygundur . Bu video protokolde, Yeni ve Cockroft 5, 6 tarafından tasarlanmış orijinal rotator sistemi, zarif bir model kullanılarak E12.5 sonra sıçan WEC standart prosedürler göstermek ve memeli gelişim çalışmaları için WEC tekniğin çeşitli uygulamalarını tanıtmak biyolojisi.

Tüm embriyo kültürü tekniği kültür fare ve sıçan embriyolar için bize izin verir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Midgestation aşamaları ile ilgili sınırlı dönemlerinde durum. Bu video protokolde, E12.5 rotator tip şişe kültür sistemi kullanarak sonra sıçan tüm embriyo kültürü standart prosedürleri göstermektedir.

Rotator-tipi Şişe Kültür Sistemi kullanılarak Kemirgen Tüm Embriyo Kültürü Yöntemi

Tüm embriyo kültürü (WEC) tekniği 1950'lerde New ve meslektaşları tarafından geliştirilmiş ve gelişimsel biyolojide uygulanmıştır 1. Gelişim ...

Gelişimsel Biyoloji'de, deneyler için çeşitli hayvanlar kullanılmaktadır. Tavuk embriyoları kültür tekniği 1950'lerde kurulmuş ve modern genetik manipülasyonların Hawaii tarımındaki gelişiminden önce geliştirilmiştir. Embriyolar manipüle edilebildiği ve mikroskop altında incelenebildiği için, genlerin iletilmesi veya transfeksiyonu yoluyla canlılığın hedef bölgeleri doğrudan hedeflenebilir; bu nedenle bütün embriyo kültürü oldukça kullanışlı bir araçtır.İmplantasyon sonrası gelişimden sonra maorian embriyolarının dinamik gelişim sürecini incelemek istediğimizde, maorian embriyolarının büyümesi, kültür süresini sınırlayan fonksiyonel presenter'a kritik düzeyde bağımlıdır. Genel olarak, sıçanlarda embriyonik gün 8,5 ile 14,5 arasında, farelerde ise E 6,5 ve 12,5 arasında embriyoları kültüre edebiliriz.Laboratuvarda, döner kültür sistemi kullanarak sıçan ve fare embriyoları kültürü yapıyoruz. Bu kültür sistemi, sıçan ve fare embriyolarının geç gestasyon dönemindeki kültürü için en popüler ve uygun olan sistemdir. Yani, sıçanlarda E 11.5 ve farelerde E 9.5 sonrası dönemdir.Bu videoda, E 12.5 RU embriyoları kullanılarak yapılan aç kültür (hungry culture) için standart protokolümüzü tanıtmak istiyoruz. Bu koşulda embriyo, hor kültüründeki çeşitli etkili manipülasyonları incelemek için yeterli olan iki gün boyunca kültüre edilebilir. Başarı için iki kritik adım bulunmaktadır.İlk olarak, özellikle çubuk damarlara zarar vermemek için diseksiyon prosedürü hassas bir şekilde uygulanmalıdır. İkinci olarak, prosedür mümkün olduğunca hızlı gerçekleştirilmelidir. Bu durum, özellikle yaşlı embriyolar için geçerlidir.Örneğin, E 10.5 fare embriyoları durumunda, transferin 30 dakika içinde gerçekleştirilmesi gerekir. Pack six mutant embriyolar için tüm embriyo kültürü tekniğini uyguladık. Örneğin, mutantta nöral hücrelerin migrasyon paternini, az sayıda hücreyi boya ile işaretleyerek veya yabanıl tip ve mutant arka planlı embriyolara hücre nakli yaparak analiz ediyoruz.Ayrıca, elektriksel şok kullanan elektroporasyon yoluyla, kültürlenmiş fare ve kırmızı embriyolara gen aktarma yöntemi geliştirdik. Gelişmekte olan beyin bölgelerine ekzojen gen konstrüktlarını, dominant negatif formları ve siRNA'ları basitçe aktarabiliyoruz. Böylece, fonksiyon kaybı ve fonksiyon kazanımı deneyleri ile gen fonksiyonlarını kolayca analiz edebiliyoruz.Ayrıca, organ kültürü veya dilim kültürü sonrası veya kültürleme yoluyla GFP veya RFP ile etiketlenmiş hücrelerin davranışlarını inceliyoruz. Böylece, diğer tekniklerle kombinasyon halinde dilim kültürü kullanarak çeşitli deneyler yapabilirsiniz.

the-method-rodent-whole-embryo-culture-using-rotator-type-bottle

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video midgastrula evre Drosophila embriyolar primer nöronal kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor. Canlı kültürlerin Görüntüleme kaplama 2 gün sonra bir bikarbonat tabanlı tanımlı bir ortamda büyüme ve farklı nöronlar sonra hücreler 1 saat gösteriyor. Nöronların elektriksel olarak uyarılabilen ve sinaptik bağlantıları formu.

Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

Bu video Yeni kültür, civciv embriyolarının 24 saat kadar yumurta dışında kültür olan bir yöntem gösteriyor. Bu yöntem, erken gelişme (14 som ilkel bir çizgi.) Fare E7-9 karşılık gelen bir süre çalışma sağlar. In situ hibridizasyon ve immünohistokimya, bu tekniğin Uygulamaları elektroporasyon içerir.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

Bu makalede, biz uzun vadeli sağlamak için basit bir yöntem...

Bir Eski-ovo</emGörüntüleme ve Mikrocerrahi Uygulamaları için uygundur> Tavuk Embriyo Kültürü Sistemi

Anne metabolizma atlar neurulation sırasında, fare embriyo doğrudan farmakolojik manipülasyonu için izin veren bir yöntem açıklanmıştır. Bu teknik, zaman noktası ve farmakolojik ajan değişen neurulation farklı yönlerini incelemek için adapte edilebilir.

Nöral Tüp Kapatma Fare Tüm Embriyo Kültürü

Biz kemirgen embriyolardan hipokampal ve kortikal nöronlar yalıtmak ve kültürüne hızlı bir metodoloji tanıtılmıştır. Bu protokol bize neredeyse saf nöronal kültürlerin gerekli olduğu deneyler yapmasına imkan tanıyor.

Sıçan Embriyonik Nöral Hücre İzolasyonu ve Kültür: Bir Hızlı Protokol

Dilim kültürleri gen ve farmakolojik tedirginliklerin tarafından embriyo gelişiminin manipülasyonu kolaylaştırır. Ancak, kültür koşullarının normal gelişim dilim azalır ortamında devam edebilirsiniz emin olmalısınız. Biz en az 24 saat süreyle devam etmek omurilikteki normalde gelişimi kolaylaştıran bir protokol göstermektedir.

Tavuk embriyo Omurilik Dilim Kültür Protokolü

Embriyo kültürlerinde kullanılan serum, özellikle sinyalizasyon etkileşimler içeren çalışmalarda deney sonucunu etkileyebilecek bilinmeyen bileşenleri içerir. Burada bir serum içermeyen kültür sistemi kullanılan oksijenli ve 16-40 saat süre ile kültüre orta gebelik fare embriyo utero gelişen embriyo benzer morfolojik gelişimini gösteren göstermektedir.

Serumsuz Tüm Embriyo Kültür Sistemde Fare Embriyonik Development

Memeli tüm embriyo kültürü (WEC), teratoloji ve gelişim biyolojisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Hemen santrifüjlenmiş sıçan serumu, hem fare hem de sıçan WEC için bir ortam olarak yaygın olarak sağlanır. Bu videoda, memeli WEC'e uygun yüksek kaliteli sıçan serumunun hazırlanması için standart protokolümüzü gösteriyoruz.

Memeli Tüm Embriyo Kültürü için uygun Rat Serum hazırlanması

İn vivo potansiyellerini belirlemek için kültürlenmiş hücreleri erken fare embriyolarının tanımlanmış bölgelerine aşılamak için bir yöntem gösteriyoruz. Ayrıca, eksojen DNA'nın embriyolardaki birkaç hücreye hassas bir şekilde iletilmesini sağlayan, çapı bilinen cam kılcal damarları kullanan optimize edilmiş bir elektroporasyon yöntemi de sunuyoruz.

Erken Postimplantation Fare Embriyolar içine Hücreleri veya DNA Kesinlikle lokalize Transferi Yöntemleri

Tam embriyo kültürü için geliştirilmiş bir platform, pregastrülasyon aşamalarından ileri organogenezine kadar altı güne kadar postimplantasyon fare embriyolarının sürekli ve sağlam ekstre gelişimini sağlar. Bu protokolde statik plakalar ve dönen şişe sistemleri kullanılarak başarılı embriyo kültürü için standart prosedürü detaylandırıyoruz.

Ex Utero Pregastrülasyondan İleri Organogenez'e Fare Embriyolarının Kültürü

Bu protokol, embriyo implantasyon sürecini etkileyen ilgili molekülleri değerlendirmek için in vitro model olarak basit ve verimli embriyo implantasyonu oluşturmak için metodolojileri açıklar.

İn Vitro Embriyo İmplantasyon Modelinin Kurulması

Öğrenin, rotator-tipi şişe kültür sistemi kullanarak kemirgen tüm embriyo kültürü yöntemini. Bu teknik, E12.5 sonrası rat embriyolarının gelişim biyolojisi araştırmalarında kontrollü koşullarda incelenmesini sağlar.

Rotator-tipi Şişe Kültür Sistemi kullanılarak Kemirgen Tüm Embriyo Kültürü Yöntemi

Daha fazla video keşfet