Name: Biyomekanik ve Mechanobiological Araştırmalar Rat Kuyruk Tendonlar hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-30T17:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Öğrenin sıçan kuyruk tendonlarını biyomekanik ve mekanobiyolojik çalışmalar için hazırlama yöntemlerini. Doku canlılığını koruyarak çıkarma, yıkama ve biyoreaktöre yükleme adımlarını optimize edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu makalede, M. Cyr bir lisans öğrencisi araştırma ödülü olarak G. Ebeveyn ve FRSQ için burslu olarak NSERC Hibe # 299.280, IRSST tarafından desteklenmiştir. Yoan Lemieux-Laneville video kaydedildi manipülasyonlar yapmak için teşekkür ederiz.

Önceden herhangi bir manipülasyon, tendonların grup yapıyorlar deney ve cihazı kendi eğilim bağlı olarak kullanılmak üzere tanımlamanız gerekir. Bizim amaçlarımız için, ventral tendonları kesit alanı ölçüm ve biyoreaktör odasına takarken işlemek için böylece daha kolay çünkü daha küçük seçilen ve. Tüm aletler otoklava veya% 70 etanol ile sterilize olduğunu lütfen unutmayınız. Ayrıca,% 70 etanol içeren bir sprey şişesine her operasyon öncesi deneyciler eldiven sterilize etmek için her iş istasyonunun yanında yer alır. Bölüm 1: Ekstraksiyon Rezeksiyonu sonra, kuyruk dokulara zarar vermemek için dikkatle ekstremitelerde tarafından manipüle. Ayrıca, hücre canlılığını korumak için, tüm manipülasyonlar, soğuk tuzlu su solüsyonu içinde yapılır. 1A) Malzemeler: <ul><li> Soğuk salin solüsyonu (D-PBS) </li><li> Ezilmiş buz </li><li> Yüzey koruyucu </li><li> Kesim tahta </li><li> Bireysel manipülasyon plakaları </li><li> 2 500 ml yemekleri </li><li> 2 2L cam yemekleri </li><li> Yapışkan bant </li><li> 1 Cımbız </li><li> 1 Forseps </li><li> 1 Cımbız standı </li><li> 1 Çift cerrahi makası </li><li> 1 Neşter </li><li> 1 Çift cerrahi makas <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 yönelim kimlik ile bireysel manipülasyon ("proksimal" için "P") </li></ul> 1B) İş istasyonu: <ol><li> Yüzey koruyucusu yaymak ve kesme tahtası üstüne yerleştirin. </li><li> , Kırılmış buz ile yarıya her iki büyük cam yemekleri doldurun ve kağıt üzerine koyun. </li><li> Manipülasyon plaka bir köşesine bir parça bant Stick ve proksimal sonunu belirtmek için bir harf ile tanımlamak. </li><li> Soğuk serum fizyolojik ile yarım ile iki küçük cam tabaklar ve manipülasyon plakaları tüm oluklar doldurun. Buz içeren geniş cam yemekleri yerleştirin. </li><li> Yüzey koruyucusu tüm steril aletleri düzenleyin. </li><li> Tuzlu solüsyon içeren cam tabak içine bir kuyruk aktarın. </li></ol> 1C) İşlemler: <ol><li> Dorsal tarafında ventral tarafı ayırt etmek için kuyruk proksimal sonunda anatomisi dikkat edin. Ventral tarafı tendonların daha çok sayıda ve küçük bir damla kan üretmek için kuyruk hafifçe sıkarak kontrol edilebilir bir kan damarı vardır. </li><li> Ventral tendon (veya dorsal tendonları gerekiyorsa ventral kenarı boyunca) ayıklamak istiyorsanız, cerrahi makas kullanarak, kuyruk dorsal kenarı boyunca deri kesme. </li><li> Proksimal sonunda kesi açın ve dikkatli bir şekilde kuyruk uçları manipüle ederek, forseps veya parmaklarınızı kullanarak cilt kaldırmak. </li><li> Salin solüsyonu kan ve saç durulayın ve taze solüsyon içeren kalan cam tabak içine örnek aktarmak. Eldivenleri değiştirin. Işık mikroskobu altında incelendi çapraz bölümünde altı tendon grupları gösterir. Her grup bir tendon Her omur kuyruk sonuna kadar bağlı, bu yüzden kesim boyunca yeni tendonları maruz intervertebral disk kesilir. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Enine bölümüne ışık mikroskobu altında incelendi sıçan kuyruğu. </li><li> Cerrahi makas ile kısa kıkırdak 2-3 vertebra ile distal ucu kesin. Kuyruk, neşter ve hemen ardından çözüm yerine kullanarak yumuşak dokuları kesmek için kesme tahtası üzerine yerleştirin. </li><li> Cımbız kullanarak, tek bir tendon distal kuyruk ucundan çekin. </li><li> Her iki ucunda yumuşak bir tutuş, bireysel manipülasyon plaka tendon yerleştirin. Daha fazla tendon dışarı alay kadar son iki adımı tekrarlayın ve yeni dokuların maruz gerektiğinde bir omur kısa kesmek. </li></ol> Bölüm 2: kesit alanı ölçüm 7 Doku mekanik karakterizasyonu veya stimülasyon uğrar, mekanik özellikleri tendon içinde stres kuvvet normalleştirilmesi tarafından açıklanmıştır. Bu kesit alanı değerlendirmek nedeni budur. 2A) Malzemeler: <ul><li> Optik Mikrometre </li><li> Stereomikroskopta </li><li> Dijital fotoğraf makinesi </li><li> Kenar tanıma ve bilgileri yeniden yapılanma algoritmaları 5,6 </li><li> Soğuk salin solüsyonu (D-PBS) </li><li> 1 20-200μL Micro hacmi pipet </li><li> Optik mikrometre ayarlamalar için 1 Hex anahtarı </li><li> 2 Cımbız / Files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg "alt =" Şekil 3 "/&gt; Şekil 3 Optik Mikrometre </li></ul> 2B) İş istasyonu: <ol><li> Yazılım (Dijital kamera ve algoritmalar) açın. </li><li> Cihazın tendon yüklemek için yeterli bir oda var, böylece optik mikrometre yerleştirin. </li><li> Araçların ve elinizin altında çıkarılan tendonları içeren cam tabak düzenleyin. </li></ol> 2C) İşlemler: <ol><li> Her iki bağlantı sistemleri batık kadar soğuk tuzlu su çözeltisi ile ölçüm bölmesi doldurun. </li><li> Cımbız ile biter tutarak bölmeye tendon transferi. </li><li> Hacimli mikro-pipet ile emme kullanarak, bir defada bir silikon tüp içine ekstremite çekin. Aspire, sonuna mil yaka ötesine uzanan kadar. </li><li> Tüpler sıkıştırmak ve stereomicroscope altında cihazın yüklemek için mil yaka sıkın. </li><li> 105x büyütme kırışıklıklar artık algılanamadığı kadar doku gözlemlerken, tendonları germek. Ek% 0,40 gerin. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 105x büyütme önce ve sonra gerdirme Tendon projeksiyon. </li><li> Konumunu ayarlayın ve 180 ° döndürme üzerinde tendon net bir görüntü sağlamak için odak. </li><li> Gerginlik, odak veya pozisyon değiştirmeden 10 ° her devirde bir fotoğraf çekin. Sadece döner mil dönme yürütmek için kullanın. Konik şekli nedeniyle, bu adımlar, tendon boyunca farklı noktalarda tekrar edilebilir. </li><li> Kayıtlı olan veritabanı analiz etmek için kenar tanıma ve profil rekonstrüksiyon algoritmaları etkinleştirin. </li><li> Mil yaka gevşemesine ve mikro hacimli pipet kullanarak silikon tüpler içine hava üfleme tendon Bedava. </li><li> Tendon uçları yeniden işleme, manipülasyon plaka üzerine yeniden takın. </li><li> Elde edilen profil yeniden yapılanma ve kesit alanı değeri şekli olun. </li></ol> Bölüm 3: Durulama Önceki manipülasyonlar sırasında meydana gelmiş olabilir kirlenme kaldırmak için, dokuların biyogüvenlik kabini altında durulanır. 3A) Malzemeler: <ul><li> Soğuk salin solüsyonu (D-PBS) </li><li> Çoklu-groove manipülasyon plaka </li><li> Bireysel Manipülasyon plakaları </li><li> Yapışkan bant </li><li> 2 Cımbız </li><li> 1 Cımbız standı </li></ul> 3B) İş istasyonu: <ol><li> Önceden Biyogüvenlik kabini 15 dakika içinde fan açın ve% 70 etanol ile iç yüzeylerini temizlemek. </li><li> Biyogüvenlik kabini içindeki tüm enstrümanları getirin. </li><li> Proksimal sonuna belirlemek için, her bir plaka bir köşesine üzerine bant parçaları sopa. </li><li> Steril serum fizyolojik ile bütün oluklar doldurun. </li></ol> 3C) İşlemler: <ol><li> Ayıklanan kabinede tendon içeren manipülasyon plaka tanıtın. </li><li> Cımbız kullanarak, her iki ucunda hafif bir kavrayışa sahip, plaka tendon çıkarın. </li><li> Bırakın ve yavaşça en yakın ve en uzak oluk geçmeden, çoklu oluk manipülasyon plaka her bölmesi salin solüsyonu tendon karıştırın. </li><li> Son olarak, bireysel bir manipülasyon plakasını tendon daldırın. </li></ol> Bölüm 4: biyoreaktör odasına Yükleniyor Daha fazla kontaminasyonu önlemek için, aşağıdaki manipülasyonlar da biyogüvenlik kabini yapılmaktadır. 4A) Malzemeler: <ul><li> Biyoreaktör odasının 4 </li><li> Steril çapa </li><li> 1 Steril Petri kabı </li><li> Soğuk hücre kültürlerinde Orta (DMEM) </li><li> Siyanoakrilat </li><li> 2 Cımbız </li><li> Cımbız standı </li><li> 0.5-10μl Mikro hacimli pipet </li><li> 1 Cetvel <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 Biyoreaktör kamara </li></ul> 4B) İş istasyonu: <ol><li> Bir önceki adımda da biyogüvenlik kabini, gerçekleştirilen bu yana gereksiz araçları kaldırılması daha fazla çalışma alanı verecektir. </li><li> Kabin içindeki tüm diğer araçlar getirin. </li></ol> 4C) İşlemler: <ol><li> Tendon ekstremite üzerinden merkezli ve doku yara, biriktirme ve makara çevresinde manipülasyon plaka üzerinde bir çapa yerleştirin. </li><li> Çapa Rulo ve doku çapa bağlı kalmasını sağlarken gevşek ekstremite tutun. Sonra ¾ dönüş durdurun. </li><li> Aynı yürütmekdiğer ucunu adımlar. </li><li> Kendi merkezlerinde 1 ila 6 cm kadar üzerinde hem çapa eşit döndürün. </li><li> Çözüm batırın ve bağlantılı bölümler, mekanik özelliklerini 2-3 geliştirmek için kısa bir süre kurumasını bekleyin tendon gevşetin. </li><li> Petri kabı içine siyanoakrilat dökün ve mikro ses pipet içine 2.5μL çizin. </li><li> Salin solüsyonu herhangi bir tutkal düşürmeden yara dokusu siyanoakrilat bir damla uygulayın. 2 damla her çapa kadar bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Tendon hala tamamen dalmış, tamamen kurumasını tutkal için 5 dakika bekleyin. </li><li> Bu süre zarfında, tuzlu su çözeltisi ile oda bölmesi doldurun. </li><li> Tüm doku hasarı önlemek için serum fizyolojik ile rehidrate. </li><li> Biyoreaktör odasına sadece çapaların manipüle ederek, tendon transferi ve aktarım sırasında sızıntı ve kirlenmeyi önlemek için yakın. </li></ol> Bölüm 5: Temsilcilik Sonuçları: Protokol sonucu doğru yapıldığında, doku sıkı izolasyon ve hazırlık prosedürü doku kısırlık, canlılığı ve bütünlüğünü korumak için mümkün kılan gösterir. İlk olarak, basit ve tekrarlayan ekstraksiyon yöntemi kullanılarak ekstraksiyonu sonrası gerçekleştirilen H &amp; E kusurludur bölümden mikroskobik analizi ile görülebilir kollajen ağı zarar vermeden kuyruk tendon ayıklamak mümkün. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6 ekstraksiyonu sonrası tendon kollajen ağı (H &amp; E ile boyanmış 5μm uzunlamasına kesit). Daha sonra kültür tendonları on gün yapılan sterilite testleri. Her gün, agar kaplama kullanılan kültür çözeltisi ve 24 saat süreyle inkübe. Herhangi bir bakteri üremesi gözlendi yana, bizim manipülasyonlar bulaşmaya sebep olmadığı sonucuna varmıştır. Profil rekonstrüksiyon algoritması ve optik mikrometre, biz hata 7% 2 marj içinde kesit alanı tahmin etmek mümkün. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig7.jpg" alt="Şekil 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 7"> Şekil 7, bir RTT Profil rekonstrüksiyon . Son olarak, memeli hücreleri için durulama adım sonra, on iki günlük kültür süre sonra DEAD / CANLI Canlılık / Sitotoksisite Kit kullanarak canlılığı değerlendirildi. Yeşil flüoresan canlı hücreler büyük bir çoğunluğu belli olduğundan, izolasyon prosedürleri canlı doku koruyarak başarılı olduğunu teyit edebiliriz. Aynı test biyoreaktör odasına tendon taktıktan sonra iki saat yapıldı. Biz, çapa dehidratasyon ve yapıştırıcı her iki demir arasındaki doku yayılmış olduğu doğrulandı. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig8.jpg" alt="Şekil 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 8"> Şekil 8 çapa Doku canlılığı (yeşil = canlı hücreleri, kırmızı = ölü hücreleri)

<ol><li>Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+various+mammalian+tendons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Zool.+Lond%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of various mammalian tendons.</a> J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).</li>
<li>Dupuis, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22D%C3%A9shydratation+de+matrices+collag%C3%A9niques+reconstruites+in+vitro%3A+effets+sur+les+propri%C3%A9t%C3%A9s+m%C3%A9caniques+et+histologiques+%5B%5D%22">Déshydratation de matrices collagéniques reconstruites in vitro: effets sur les propriétés mécaniques et histologiques [dissertation]</a>. , Québec, Université Laval. Québec. 114-114 (1981).</li>
<li>Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+influence+of+strain+rate+on+the+tensile+failure+of+rat+tail+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).</li>
<li>Huppé, N., Lessard, J. -L., Langelier, E. A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).</li>
<li>Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &amp, Rancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+profiles+and+volume+reconstructions+of+soft+tissues+using+laser+beam+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements.</a> J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).</li>
<li>Lee, T. Q., Woo, S. L. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+determining+cross-sectional+shape+and+area+of+soft+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues.</a> J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).</li>
<li>Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &amp, Langelier, E. Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).</li>
</ol>

Bu deneysel yöntemler uygulanarak, biz bu tür dokuların geniş bir yelpazede in vitro çalışmalar yapabilirler. Örneğin, doku dejenerasyonu üzerine bir çalışma, on günlük bir süre için RTTs altında stimülasyon uygulama tarafından gerçekleştirildi. Her gün, tahribatsız stres gevşeme testleri doku mekanik özellikleri değerlendirildi. Sonunda, biz RTT stres değişimi gözlemlemek ve böylece mekanik özellikleri ilerlemesini analiz etmek mümkün. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig9.jpg" ...

<table><tbody><tr><td>D-PBS </td><td>Reaktif</td><td>Wisent Inc.</td><td>311-410-CL</td><td>Salin çözeltisi</td></tr><tr><td>Glikoz </td><td>Reaktif</td><td>Wisent Inc.</td><td>609-037-EL</td><td>Salin çözeltisi&lt;br/&gt;1g/L</td></tr><tr><td>Antibiyotik-antimikotikler </td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Salin çözeltisi&lt;br/&gt;1%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td>Kültür çözeltisi</td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Reaktif</td><td>Wisent Inc.</td><td>600-105-CG</td><td>Kültür çözeltisi&lt;br/&gt;3.7g/L</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Reaktif</td><td>Wisent Inc.</td><td>090150</td><td>Kültür çözeltisi&lt;br/&gt;10%</td></tr><tr><td>Antibiyotik-antimikotikler</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Kültür çözeltisi&lt;br/&gt;1%</td></tr><tr><td>Optik Mikrometre</td><td>Araç</td><td>Özel Yapım</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipülasyon plakası</td><td>Araç</td><td>Özel Yapım</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biyoreaktör haznesi</td><td>Araç</td><td>Özel Yapım</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biyomekanik ve mechanobiological araştırmalar rat kuyruk tendonlar hazırlanması

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Sıçan kuyruk tendon (RTTs) tendon fizyolojisi ve tendinopathy alanlarında in vitro çalışmalarda deneysel olarak kullanılan ortak bir biyolojik model. Bu dokuları ile çalışmak çok kırılgan olduğu için, zor ve şimdiye kadar kendi izolasyonu için herhangi bir titizlikle ayrıntılı bir protokol vardı. Bu zorlukları ile karşı karşıya kalan, biz RTTs manipülasyon ve kontrol doku canlılığı, kısırlık ve bütünlüğünü kolaylaştırmak için yöntemler ve araçlar geliştirdik. Bu makale, biyomekanik ve mechanobiological çalışmalar için RTTs hazırlamak için kullanılan deneysel prosedürleri açıklamaktadır. Ekstraksiyon, kesit alanı ölçümü, durulama ve biyoreaktör odasına yükleme: Çalışmalarımız dört ana adımları ayrılır. Her adımda, kolaylıkla çoğaltılabilir böylece tüm prosedürleri, malzeme ve manipülasyon detaylı olarak sunulmaktadır. Ayrıca, geliştirilen özel araçların sunulmuştur: RTTs ayırmak için kullanılan bir manipülasyon plaka, kesit alanı ölçüm ve ankraj sistemi sırasında doku konumlandırmak için bir optik mikrometre RTTs biyoreaktör üzerine takmak için. Son olarak, biz yöntemleri doğrulamak için birden fazla testlerinden sonra elde edilen sonuçlar açıklanmaktadır. Canlılığı, kısırlık ve bütünlüğünü değerlendirmeler prosedürleri gibi sıçan kuyruğu tendonları gibi hassas dokuların manipülasyonlar için yeterince titiz olduğunu göstermektedir.

Bu makalede, biyomekanik ve mechanobiological çalışmalar için sıçan kuyruğu tendonları hazırlamak için kullanılan deneysel prosedürleri açıklamaktadır. Biyoreaktör odasına durulama ve yükleme, çıkarma, kesit alanı ölçümü ile başlayan hazırlık olarak önemli adımlar çeşitli özellikleri göstermiştir.

Biyomekanik ve Mechanobiological Araştırmalar Rat Kuyruk Tendonlar hazırlanması

Sıçan kuyruk tendonları (RTT'ler), tendon fizyolojisi ve tendinopati alanlarındaki deneysel in vitro çalışmalarda yaygın olarak kullanılan biyolojik bir modeldir. Çalışmak...

İzleyeceğiniz video, biyomekanik ve mekanik biyolojik çalışmalar için sıçan kuyruk tendonunun izole edilmesi ve hazırlanmasında kullanılan deneysel prosedürleri içermektedir. Bu makalenin amacı, hazırlama prosedürü boyunca doku canlılığını, sterilitesini ve bütünlüğünü korumak için geliştirilen ve optimize edilen yöntemleri ve araçları göstermektir. Ekstraksiyonla başlayarak, ardından kesit alanı ölçümü, durulama ve son olarak biyoreaktör haznesine yerleştirme ile devam eden hazırlamanın ana aşamalarına ilişkin çeşitli özellikleri tartışacağız.Hadi başlayalım. Hücre canlılığını korumak amacıyla hazırlığın ilk adımı ekstraksiyondur. Tüm manipülasyonlar soğuk selin çözeltisi içerisinde gerçekleştirilir.Sıçanlar sakrifiye edildikten sonra, kuyruk rezeke edilir, %70 etanol ile durulanır, hücre ve solüsyon içeren bir kaba aktarılır ve buz üzerinde bekletilir. Tendon ekstraksiyonunu kolaylaştırmak için deri çıkarılmalıdır. Ventral tendonlarla çalışıldığı göz önünde bulundurulmalıdır.Daha küçük oldukları ve ekipmanımızla manipüle edilmeleri daha kolay olduğu için, kuyruğun tüm dorsal tarafı boyunca bir insizyon yapılır. Ardından, proksimal uçtaki anatomi gözlemlenerek kuyruğun doğru yönlendirmesi doğrulanır. Görüldüğü üzere, ventral tarafta daha fazla sayıda tendon bulunmaktadır ve elde edilen kan damlacıkları ile bir kan damarının varlığı doğrulanabilir.Kuyruk hafifçe sıkıştırıldığında, insizyon gerçekleştirilir. Proksimal uçtan başlanarak bir cerrahi makas kullanılır. Kuyruğun uç kısımlarından tutularak manipüle edilmesine özen gösterilir.İnsizyon tamamlandığında, deri, parmaklar veya forseps kullanılarak proksimal uçtan başlanarak kaldırılır. Kuyruğun yalnızca ekstremitelerinden tutulmasına dikkat edilir. Ardından, kılları ve kanı temizlemek için kuyruk çözeltinin içinde durulanır.Numune daha sonra taze çözelti içeren bir kaba aktarılır ve buz üzerinde bekletilir. Bu noktada, deney yapan kişi tendonu açığa çıkarmak için eldivenlerini değiştirir. Kuyruğun distal ucu, iki ila üç vertebra daha kısa olacak şekilde rezeke edilir.Omurlar, tendon demetleri arasında görülebilen kümelerdir ve parmaklar kuyruk boyunca kaydırıldığında hissedilebilirler. Omur boyunca gerçekleştirilen bir transversal kesitin ışık mikroskobu görünümü, her birinden gelen tendonun omura tutunması nedeniyle altı farklı tendon grubu olduğunu ve yalnızca ventral dokuların kullanıldığını göstermektedir.Her kesimde, iki tanesi alt gruplardan ve iki tanesi lateral gruplardan olmak üzere toplam dört tendon çekilip çıkarılır. Rezeksiyonu gerçekleştirmek için intervertebral diski kırmak amacıyla cerrahi makas, yumuşak dokular için ise bir kesme tahtası üzerinde skalpel kullanabilirsiniz. Bu noktada ventral taraf, daha büyük tendon sponların varlığıyla ayırt edilir.Yönelim doğrulandıktan sonra, artık hiçbir doku ayrıştırılamadığında tendonlar distal uçtan pens kullanılarak nazikçe çıkarılır ve kuyruk, daha önce gösterildiği gibi vertebral omuz üzerinden rezeke edilir. Çıkarılmanın ardından doku derhal solüsyona daldırılır ve her iki uçtan tutularak, hücre solüsyonunu da içeren ve proksimal ucun belirlenmesi için bandın kullanıldığı bir manipülasyon plakasına aktarılır. H ve E boyalı boyuna kesitlerin mikroskobik analizi, bu basit ve tekrarlanabilir yöntemin kullanılmasıyla, çıkarılan doku kesitinin iyi hizalanmış ve yoğun bir kolajen ağına sahip olduğunu göstermektedir.Manipülasyon sonrası dokular mekanik stimülasyona maruz kaldığında, mekanik özelliklerini iç kuvveti strese normalize ederek tanımlarız. Bu nedenle, dokuların kesit alanını değerlendirmemiz gerekir. Bunu yapmak için, dijital kameralı bir stereo mikroskop kullanılarak doku profili yeniden oluşturulur.Bu yöntemle, kar yükü veya stres doğrudan uygulandığı için doku bütünlüğü korunur. Dijital kamera, 180 derecelik bir görüş açısıyla kiracı projeksiyonunun fotoğraflarını çeker. Bir referans çerçevesi içerisinde, bir görüntü asistanı algoritması numunenin üst ve alt kenarlarını yerleştirir.Ardından, profil yeniden yapılandırmasını gerçekleştirmek için MATLAB yazılımı ile bir algoritma kullanılır. Dokuyu odak bölgesinde tutmak için optik bir mikrometre tasarlanmıştır. Çünkü bu bölgenin dışında projeksiyon bulanıklaşmakta ve yeniden odaklama yapmak yerel referans çerçevesini kaydırmaktadır.Mikrometre, dokudehidrasyonunu önlemek için bir ölçüm bölmesi içerir. Örneğinin döndürülmesine olanak tanıyan döner tablalı iki konumlandırma sistemi ve şaft renklerine karşı sıkıştırılmış silikon tüplerle yapılmış iki sabitleme cihazı mevcuttur. İlk olarak, ölçüm bölmesi, silikon tüp girişleri tamamen su altında kalana kadar soğuk hücre solüsyonu ile doldurulur.Ardından, uzay adamı forseps kullanılarak ve sadece ekstremitelerinden tutularak ölçüm bölmesine aktarılır. Mikro hacimli bir pipet kullanılarak, tendon ekstremiteleri kesit yoluyla silikon tüplerin içine çekilir. Ardından, uç kısmı şaft renklerinin ötesine uzanana kadar aspirasyon gerçekleştirilir.Her iki taraf da tamamlandığında, tüpü sıkıştırmak için bir boyun anahtarı kullanılarak şaft renkleri sabitlenir. Tendon sabitlendiğine göre, düzenek stereo mikroskop altında kurulur. Tendon, 105 büyütme oranında doğrudan bilgisayar ekranından gözlemlenebilir.Tutarlılık için tendon, kırışıklıklar artık fark edilmeyene kadar gerilir ve ardından %0,4 ek deformasyon uygulanır. Numune 0 ile 170 derece arasında fotoğraflandığından, tüm çevre boyunca net bir görüntü elde etmek için başlangıç konumu ve odak ayarı gereklidir. Aslında, her görünüm arasında numune rotasyonunun 10 derece artırıldığı 18 fotoğraf çekilmektedir.Bu yöntemle, dokuya zarar vermeden bir sıçan kuyruk tendonunun kesit alanını tahmin etmek mümkündür. İşlem sonunda, %0,5 ile %2 hata payı dahilinde bir profil rekonstrüksiyonu elde edilir. Ölçümün ardından, önceki manipülasyonlar sırasında meydana gelmiş olabilecek kontaminasyonu önlemek için dokular durulanır.Taze sabitleme çözeltisi içeren steril manipülasyon plakaları kabine yerleştirilir; bunlardan biri durulama işlemi için kullanılırken diğeri durulanan tendonu almak için kullanılır. Deney yapan kişi, ekstrakte edilen tendonu biyogüvenlik kabinine yerleştirmeden önce eldivenlerini %70 ethanol ile yıkar. Tendon, sadece uç kısımlarından tutularak kuyucuklar arasında dikkatlice aktarılır.Son olarak, içeriği steril hücre çözeltisi de içeren bireysel bir manipülasyon plakasına aktarılır. Protokol doğrulaması için canlılık ve sterilite testleri gerçekleştirilmiştir. İlk olarak, memeli hücreler için canlı-ölü canlılık sitotoksisite kiti kullanılarak hücre canlılığı değerlendirilmiştir.12 günlük bir kültürün ardından, canlı hücrelerin büyük çoğunluğunun yeşil floresan şeklinde görüntülenmesi, izolasyon prosedürlerinin canlı dokuyu korumada başarılı olduğunu onaylamıştır. Ardından, kullanılan kültürün kontaminasyonu kontrol etmek amacıyla incelemeler yapılmıştır. Herhangi bir bakteri büyümesi gözlemlenmediğinden, besiyeri agar üzerine ekilmiş ve 10 gün boyunca inkübe edilmiştir.Manipülasyonlarımızın steril olduğunu doğruladık. Kullanılan sabitleme sistemi, sıçan kuyruğu ve tendonlar gibi küçük örnekler için doku dehydrasyonu ve yapıştırıcı avantajından yararlanır; yapıştırıcı dokuya nüfuz eder. Bu durum tüm alt birimlerde sabitleme sağlarken, dehydrasyon daha fazla kontaminasyonu önlemek için mekanik özellikleri geliştirir.Tüm yükleme prosedürü, tüm enstrüman ve hazne bileşenlerinin steril olduğu bir biyogüvenlik kabini altında gerçekleştirilir. Yükleme işlemi için biyoreaktör haznesi bir konumlandırma aparatına sabitlenir. Tendon ankrajlarını karşılamak üzere iki hareketli kol ayarlanır.Kirlenmeyi önlemek için bir kapakla bölme kapatılır. İlk olarak, manipülasyon plakası uçlarına ankrajlar yerleştirilir. Makaraları, tendonun üzerinde ve oluğun boyuna ekseniyle merkezlenir.Ardından tendon, bir ankrajın etrafına sarılır. Dokunun gövdesi solüsyonun içinde kalırken, ankraj yaklaşık üç çeyrek tur döndürülür. Boşta kalan ucu tutarak dokunun ankraja sabitlenmesini sağlarız.Aynı prosedür daha sonra diğer uç için tekrarlanır. Her iki taraf da sabitlendikten sonra, iki uç arasında altı santimetre kalana kadar ankrajlar eşit şekilde sarılır veya çözülür. Tendonların yaralı kısmına 2.5 µL'lik ocreate'den iki damla damlatılır.Yapıştırma işlemi için gerekli özen gösterilir. Hücre solüsyonuna yapıştırıcı karışmasını önlemek amacıyla, yapıştırıcının tamamen kuruması için en az beş dakika beklenmesi gerekir. Protokolümüzü doğrulamak için, yapıştırıcının ve sabitleme noktasının kurumasının doku canlılığı üzerindeki etkisini belirlemek amacıyla testler gerçekleştirdik.İki saat sonra, ekstremite durumunun doku dışına yayılmadığını gözlemledik. Aslında, bağlantı noktasında bulunan kırmızı floresan boyalı ölü hücreler ile doku gövdesindeki canlı yeşil hücrelerin çoğunluğu arasındaki sınırı belirleyen net bir renk sınırı mevcuttur. Bu sırada, biyoreaktör bölmesi taze kültür ortamı ile doldurulur.Tendonun bir kısmındaki yara kuruduktan sonra, hücre solüsyonu ile yeniden nemlendirilir. Ardından, sabitlenmiş doku pens yardımıyla kamaraya aktarılır. Daha fazla kontaminasyonu önlemek için kapak kapatılır.Kamar bioreaktöre yerleştirildikten sonra konumlandırma aparatı çıkarılacaktır. Sıçan kuyruk tendonunun biyomekanik ve mekanik biyolojik çalışmalar için nasıl hazırlanacağını göstermiş olduk. Bu prosedürleri uygulayarak, bu dokular üzerinde çok çeşitli in vitro çalışmalar gerçekleştirebiliriz.Örneğin, 10 günlük bir süre boyunca stimülasyon uygulanarak doku dejenerasyonu üzerine bir çalışma gerçekleştirilmiştir. Her gün dokuyu, mekanik özellikleri ve tahribatsız stres gevşemesi testini değerlendirdik. Sonuçta, stres varyasyonunu gözlemleyebildik.Titiz izolasyon ve hazırlama prosedürlerimizin doku canlılığını, itiyesini ve anti. korumayı mümkün kıldığına dair kanıtlar sunduk. İzlediğiniz için teşekkür eder, kendi deneylerinizde başarılar dileriz.

preparation-rat-tail-tendons-for-biomechanical-mechanobiological

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video cerrahi hazırlık ve sıçan medial gastroknemius kas hazırlık kasılma cevapları incelemek için gerekli prosedürleri...

Rat Prosedürleri<em&gt; In situ</em&gt; İskelet Kası Kontraktil Özellikleri

Ortabeyin dopamin sistemi ve striatum gelen Eksplantlarından için bir kollajen matris deneyde...

Fare Dopaminerjik ve Üç Boyutlu Collagen Matrix Tahliller striatal Eksplantlarından diseksiyonu ve Kültür

Peroneal sinirin uyarılmasını ve sıçan arka ayağının anterior krural kompartmanının kasılmasını takiben ayağın dorsifleksiyonunu ölçmek için bir in vivo protokol tarif ediyoruz. Bu tür ölçümler, iskelet kası patolojisini ve kas onarımı ve rejenerasyonuna yönelik doku mühendisliği yaklaşımlarını değerlendirmek için vazgeçilmez bir translasyonel araçtır.

Uygulamaları<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku değerlendirilmesi için Rat Tibialis Anterior Fonksiyonel Test İskelet Kası Onarım Engineered

Bu iletişim kuralı tendon allojeneik trombosit zengin plazma (PRP) ya da tuzlu Çözümle Aşil tendonu parçası çıkardıktan sonra enjekte edilmiş Sıçanlarda şifa değerlendirme işlemini açıklar. Tendon şifa ilerlemesini analizleri farklı türleri kullanarak birkaç saat noktalarda değerlendirilir.

Allojeneik trombosit açısından zengin plazma (PRP) kesitli Aşil tendon sıçan iyileşme süreci üzerine etkileri: metodolojik bir açıklama

Bu kağıt hazırlık ve göbek kordonu matris elde edilen Mezenkimal Kök hücre pulcuklarının bir ikili patellar tendon kusur modelinde bir fare ile değerlendirilmesi açıklanmaktadır. Bu model ile kabul edilebilir bir hastalık ilişkili ve tedavi edilmezse ve tedavi tendon arasındaki farklılıkları algılamak için bulundu ve iki tedaviler arasında test.

Kök hücre tedavileri Sıçanlarda bir ikili Patellar Tendon yaralanma modelinde değerlendirilmesi

Bu yazıda 1,5 cm'ye kadar tendon boşluğunun mühendislik kollajen grefti ile doldurularak onarılması için in vitro ve yerinde protokol sunulmuştur. Bu, greft konak dokuya olgunlaşana kadar mekanik yükü almak için modifiye edilmiş bir dikiş tekniği geliştirilerek gerçekleştirildi.

Büyük Tendon Kusurlarını Onarmak İçin Doku Mühendisliği Kollajen Greftli Yeni Bir Tenorhaphy Dikiş Tekniği

Protokol, özel uyumlu 3D baskılı armatürleri kullanarak rürinten tülonlar için etkili ve tekrarlanabilir gerilebilir biyomekanik test yöntemlerini tanımlar.

Murine Tendonunun Biyomekanik Testi

Bu protokol, sıçan tüm siyatik sinir dokusunun ex vivo elektrofizyolojik stimülasyon için hazırlanmasını ve çevresel olarak düzenlenmiş, iki bölmeli, perfüze edilmiş bir salin banyosunda kaydedilmesini açıklar.

Ex Vivo Nörofizyoloji için Sıçan Siyatik Sinirinin Hazırlanması

Tendon sıkışmasının mekanobiyolojisini keşfetmek için uygun bir model sağlayarak, sürekli hücre canlılığı ile murin arka ekstremite eksplantlarında Aşil tendonu insokulasyonunun sıkışmasının neden olduğu fibrokartilajinöz değişikliği yeniden yaratan özel bir deneysel platform ve doku kültürü protokolü sunuyoruz.

Aşil Tendonu Sıkışmasının Mekanobiyolojisini İncelemek için Murin Hind Limb Eksplant Modeli

Burada, yük taşıyan tendon çekirdek dokusu ile hastalık ve yaralanma ile aktive olan hücre popülasyonlarını içeren bir dışsal bölme arasındaki tendon hücresel karışmasını taklit etmek için bir asambloid model sistemi sunuyoruz. Önemli bir kullanım durumu olarak, sistemin dışsal endotel hücrelerinin hastalıkla ilgili aktivasyonunu araştırmak için nasıl konuşlandırılabileceğini gösteriyoruz.

Hastalık ve Onarımda Hücresel Karışmayı Araştırmak için Mühendislik Tendon Toplulukları

Öğrenin sıçan kuyruk tendonlarını biyomekanik ve mekanobiyolojik çalışmalar için hazırlama yöntemlerini. Doku canlılığını koruyarak çıkarma, yıkama ve biyoreaktöre yükleme adımlarını optimize edin.

Biyomekanik ve Mechanobiological Araştırmalar Rat Kuyruk Tendonlar hazırlanması

Daha fazla video keşfet